Summary
여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.
Abstract
순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 그리고 T 도우미 1 차별화의 정량화 (Th1) 세포 면역 반응에서 T 세포의 역할을 평가 하는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜 granulocyte macrophage 식민지 자극 요소 (GM-CSF) 파생 된 모 수석 세포 (DCs)를 골 (BM) 창시자의 체 외에서 분화를 설명 합니다. Ovalbumin 펩 티 드 (OVAp)의 입양 전송 프로토콜에 대해서도 설명 합니다-로드 GM-CSF 파생 Dc 순진한 CD4 T 세포 OTII 유전자 변형 쥐에서 vivo에서 활성화, 확산, 및 Th1 분화를 분석 하기 위하여는 전송 된 CD4 T 세포입니다. 이 프로토콜 메서드의 순전히 vivo에서 특별히 조작 하거나 공부 셀 채우기를 선택 하는 무 능력에 의해 부과 된 제한 circumvents. 또한,이 프로토콜 변경 체 외에서 발생할 수 있는 기능적 요소와 세포 유형 및만 그대로 장기에 있는 다른 요인의 영향을 포함 하 여 피할 vivo에서 환경에서 연구를 수 있습니다. 프로토콜은 DCs에 변화를 생성 하기 위한 유용한 도구와 T 세포는 적응 면역 반응, 잠재적으로 제공 하는 원본 또는 수많은 면역 관련된 질병의 개발을 이해 하는 중요 한 결과 수정.
Introduction
CD4 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) Dc 같은 미생물 병원 체1,2면제의 필요한 중재자는. 주변 림프 기관에 CD4 T 세포 APCs3,,45에 의해 제시 하는 특정 항 원 인식에 따라 활성화 됩니다. 활성화 된 CD4 T 세포 증식 하 고 올바른 적합 한 면역 반응6,7의 개발에 필요한 별개 특정 효과 기 Th 세포로 분화. 이러한 프로세스의 제어는 유해한 조직 손상8을 생산 하지 않고는 병원 체를 죽이 적절 한 적응형 방어를 생산을 위한 중요 한. Th 셀 식 또는 표면 분자, 녹음 방송 요인과 이펙터 cytokines의 생산에 따라 정의 되 고 병원 체1응답에 필수이 고 정확한 기능을 수행. Th1 세포 부분 집합의 세포 전사 인자 T 내기와 사이토카인 인터페론 γ (IFNγ) 표현 하 고 세포내 병원 체1에 대 한 호스트 방어에 참여. 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화의 정량화는 T 세포 재생의 역할 면역 반응을 평가 하는 유용한 수단입니다.
이 프로토콜 활성화에 비보 분석의 체 외-용량 생성 BM 파생 Dc 활성화, 확산, 및 Th1 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하. 프로토콜 또한 순진한 CD4 T 세포 활성화, 격 증, 유도의 용량을 평가 하 고 Th1 분화 (그림 1). 이 다양 한 프로토콜을 특별히 조작 하거나 순전히 프로토콜 vivo에서 공부 셀 채우기 선택 못하는 circumvents. 다양 한 분자와 Dc에 치료의 효과 BM 유전자 변형된 쥐5 에서 사용 하거나 치료 또는 격리 된 BM 셀9유전자 조작에 의해 공부 될 수 있다. 마찬가지로, T 세포 응답 서로 다른 소스에서 또는 여러 가지 조작을3,,810후 입양 전송에 대 한 T 세포를 획득 하 여 탐험 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 두 가지입니다. T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 흐름 cytometry 접근;와 분석 그리고이 vivo에서 학문, 따라서 averting 체 외에서 발생할 수 있는 변경 및 세포 유형 및 기타 요인에만 그대로 장기11에서 발견을 포함 하 여 결합.
중요 한 염료의 사용 방사능의 사용을 피하고 있는 동안 세포의 확산을 추적 하는 널리 사용 되는 기술입니다. 이 시 약으로 확산의 측정 세포 분열 후 염료 희석을 기반으로 합니다. 또한, 이러한 염료 여러 파장에서 검출 될 수 있다 그리고 쉽게 여러 형광 항 체 또는 표식 함께 cytometry에 의해 분석 된다. 우리는 어떻게 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 cytometry에 의해 분석 될 수 있다 표시 하 여이 프로토콜의 유틸리티를 강조 표시 합니다.
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Protocol
실험 절차 Fundación 센트 나시오날 드에 의해 승인 되었다 Investigaciones Cardiovasculares 카를로스 3 세 (CNIC)와 스페인과 유럽 지침에 따라 지방의 Autónoma 드 마드리드. 마우스는 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 자란 했다 그리고 이산화탄소 (CO2) 흡입에 의해 안락사 되었다.
1. 절연 Tibias 화관에서 마우스 골 수 세포의
참고: C57BL/6 congenic 마우스 스트레인 운반 차동 백혈구 마커는 Ptprc는는, 야생-타입 C57BL 긴장 Ptprcb 대립 유전자, CD45.2 또는 Ly5.2로 알려진, 수행 하는 반면에, CD45.1 또는 Ly5.1로 일반적으로 인식 합니다. CD45.1 및 CD45.2 변종 cytometry 항 체를 사용 하 여 구분할 수 있습니다. CD45.1, CD45.2, 및 CD45.1/CD45.2 쥐 입양 전송, cytometry에 의해 뚜렷한 세포 인구의 추적을 허용에 대 한 셀 소스 또는 받는 사람으로 사용할 수 있습니다. 나이 우선적으로 사용-및 나이의 12 주 아래 섹스 일치 하는 남성 또는 여성 쥐.
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화관과 Tibias의 준비
- 제도 동물 보호 위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용 하 여 마우스를 안락사
- 70% 에탄올과 동물 표면에 분사 하 여 뒷 다리 사지를 소독.
- 살 균가 위, 집게와 scalpels 사용 합니다. 메스로 피부에 상처를 만들고 후부 사지를 포함 하는 피부를 포함 하 여 마우스의 원심 부분에서 피부를 제거. 낮은 종 아리 근육 주위 피부 껍질과 다리에서 피부를 완전히 제거 (그림 2A, 2B).
- 메스를 사용 하 여 대 퇴 골에서 quadriceps 근육을 구분 합니다. 고관절 대 퇴 골 머리 깨지 않고 disarticulate. 메스 (그림 2C, 2D)를 사용 하 여 경골에서 근육을 제거 합니다. 뼈 끝을 깨지 않고 경골에서 대 퇴 골을 구분 합니다.
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스 얼음 1 x 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체에 포함 된 배양 접시에서 뼈를 유지.
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세포 격리
참고: 모든 후속 단계는 문화 후드와 오염을 피하기 위하여 살 균 물자로 수행 되어야 합니다.- 멸 균 페 트리 접시에 메스와 각 뼈의 인접 하 고 원심 끝을 잘라 신중 하 게.
- 완전 따뜻한 RPMI 매체 (RPMI + 10 %FBS, 2 mM EDTA, 1% 페니실린/스, 20 mM HEPES, 55 μ M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate 및 2 m m L-글루타민)의 10 ml 전체 볼륨으로 반복적으로 뼈를 플러시. 1 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 사용 하 여 양쪽에서 뼈를 플러시.
- 50 mL 원뿔 튜브 70 µ m 나일론 웹 필터 장착 하는 effluate를 전송 합니다. 신중 하 게 부드러운 교 반 및 pipetting 파편 및 셀 대기업을 분리 하십시오.
- 셀 서 스 펜 션 (RT) 실 온에서 10 분 동안 250 x g 에서 원심
- 감기-적혈구 세포의 용 해 버퍼 (0.15 M NH4Cl + 1 m m KHCO3 + 0.1 m m EDTA, 1 N HCl, 0.4 µ m 살 균 필터링, 및 4 ° C에서 저장과 7.2에 조정된 산도)의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 떨고 수동 5 분 동안 얼음에 유지 합니다.
- 비활성화 하 고 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 씻어 감기 버퍼 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) + 2 mM EDTA + 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) x 1) 10 mL를 추가 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
- 완전 한 RPMI 매체 및 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척
- 완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액 trypan 블루와 함께 1: 1의 혼합 50 µ L. 현미경으로 세 실에 휴대폰 번호를 확인 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12.
참고:이 방법은 수율 40 x 106 60 x 106 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 골 수 세포 뼈. - 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
2. DC 분화, 성숙 및 항 원 로드
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BM 셀 수확
- 6 잘 초 저-첨부 매체, 일반적으로 잘 당 5 mL의 mL 당 106 세포 표면 접시에 완전 한 문화 씨앗 차별화 된 대 식 세포는 문화 판에 연결 됩니다. 후 12 h, 주로 포함 monocytes, 6 잘 플레이트, 준수 대 식 세포와 오래 된 6 잘 플레이트를 폐기 시키려면 상쾌한 전송.
- 세포 분화를 촉진 하는 비 부착 한 세포 상업적으로 재조합 murine GM-CSF 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 얻은 20 ng/mL를 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 당 일반적으로 5 mL에 mL 당 5 x 105 셀에서 문화 및 매일 관찰 합니다.
- 3 일 마다 중단된 셀 아래로 회전 5 mm EDTA PBS에 부착 세포를 수집 하 고 스핀 다운. 결합 하 고 5 × 105 셀/mL 신선한 매체 20 ng/mL rm-GM-CSF를 포함에서 resuspend.
- 8 일에 위와 같이 부착 및 분리 된 세포를 수집 하 고 조직 문화 치료 비 멸 균 페 트리 접시, 유도 높은 MHC-II에에서 24 h에 대 한 중간 포함 20 ng/mL GM-CSF에서에서 5 x 105 셀/mL와 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) resuspend CD80 그리고 CD86 식.
- Cytometry 단계 2.2에에서 표시 된에 의해 확인 DC 차별화.
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Cytometry 분화 및 성숙 분석 흐름.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- 마우스 Fc 수용 체 차단 (안티 마우스 CD16/CD32 IgG2b 항 체 순화) 제조업체의 지침에 따라 4 ° C에서 15 분에서 resuspended 셀 펠 릿을 배양 하 여 블록 Fc 수용 체.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
- 각 프로브에 대 한 흐름 cytometry 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 4 ° c.의 300 µ L 250000 셀 resuspend
- 96 잘 접시에 잘 당 셀 솔루션의 30 µ L를 전송 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
- 상쾌한 삭제 하 고 포함 하는 항 체의 30 µ L 추가 버퍼를 각 제조업체의 표시를 따라 잘. 4 ° c.에 20 분에 대 한 항 체와 세포를 품 어
참고: 일반적으로 고용 마커 Dc, monocytes, 대 식 세포는 CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 그리고 CD86 (그림 3). - 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 죽은 세포 (예를 들어, propidium 요오드 화물, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 아민 반응성 염료를 제외 마커를 포함 하는 흐름 cytometry 버퍼의 당 200 µ L에서 resuspend ) 제조 업체의 권장된 농도13에.
- 교류 cytometry 튜브 샘플을 전송 하 고 죽은 세포를 제외 하 고 0, 3, 6, 9 일에 교류 cytometry 분석을 수행 하 여 세포 분화를 모니터링 합니다.
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DC 항 로드 합니다.
- 8 일에 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS 항생제 없이). 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- 10 µ g/mL OVAp (323-339;와 Dc를 품 어 ISQAVHAAHAEINEAGR) 1 x 107 Dc에서에서 매체의 1 mL 당 (RMPI + 1 %FBS) 37 ° c.에 적어도 30 분 동안 플라스틱 튜브에 OVAp 로드 Dc를 사용 하 여 부정적인 제어 조건으로.
- 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 고 200 µ L 완전 한 RPMI 매체에 산 탄을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS) 2 x 106 셀/mL에.
3. OTII 마우스에서 순진한 CD4 T 세포의 고립
참고:이 방법은 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 약 100 x 106 spleenocytes를 생성합니다. 남성과 여성 모두 사용할 수 있습니다. CD4 T 세포는 비장 또는 림프절;에서 고립 될 수 있다 CD4 T 세포는 각각 대략 25% 및이 기관에 있는 세포의 50%를 위한 계정. 무 균 조건에서 다음 단계를 수행 합니다.
- 사 타 구니, 겨드랑이, 상 완, 자 궁 경부, 그리고 mesenteric 림프절과 비장 OTII 유전자 변형 마우스 (그림 4)에서 분리 하 고 플라스틱 페 트리 접시 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 10 mL 그들을 전송.
- 완전 한 RPMI 매체의 2 mL와 함께 셀 여과기를 헹 구 고 50 mL 튜브에서 제거. 전송 림프절과 비장 70 µ m 셀 스 트레이너를 50ml 튜브에 배치. (그림 5) 주사기 플런저를 사용 하 여 균질 하 고 매체 추가 최대 15 mL.
- 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 하 고 완전 한 RPMI 매체의 15 mL에 펠 릿을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- 비장 세포 현 탁 액 셀 펠 릿 resuspend 및 단계 1.2.5에서 붉은 혈액 세포를 lyse.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
- 완전 한 RPMI 매체와 실시간에 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척
- 중간의 5 mL에 셀 resuspend Trypan 파랑 세포 현 탁 액 1: 1의 50 µ L를 혼합. 현미경 아래 세 챔버를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12.
- 2.2.2 단계를 반복 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 셀 CD4 T 세포의 부정적인 선택 나중에 얼음에 30 분을 CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (난 Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, DX5 biotinylated 항 체의 1:800 희석을 품 어.
- 제조업체의 지침에 따라와 streptavidin 입히는 자기 microbeads의 필요한 금액을 계산 하 고 CD4 T 세포는 자기 세포 구분 및 적절 한 사용 하 여 격리 셀 수와 구슬의 용량에 따라, 분리의 열 있습니다.
- 완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 고 단계 3.7에서에서 설명한 대로 라이브 셀을 계산 하는 동안 얼음에 그들을 유지.
- 2 x 105 셀을 추출 하 고 수집 된 셀 사용 하 여 안티 CD4, CD3, B220, CD8 항 체 희석 제조 업체 추천을 사용 하 여 교류 cytometer에서 형광 항 체의 순도 확인 하십시오.
- 격리 된 순진한 CD4/OTII T 세포 얼룩, 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 106 셀 resuspend. 준비 하는 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 중요 한 셀 추적 염료의 최종 제조업체 권장 농도 더블. 천천히 세포 현 탁 액을 세포 추적 솔루션을 추가 하 여 두 솔루션을 혼합. 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어
- 완전 한 RPMI 매체와 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 이 단계를 두 번 반복 합니다. 1 x 107셀/mL에서 완전 한 RPMI 매체의 1 mL에 셀 resuspend
4. Vivo에서 활성화, 확산 및 Th1 차별화 분석 결과
참고: 중요 한 셀 추적 염료 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 및 다른 succinimidyl 에스테 르 기반 염료, 기쁘게 생각 하 고 다른 파장에서 형광을 방출, 널리 이용 된다 림프 톨 확산을 평가 하기 위해 흐름에 의해 그들의 높은 형광 강도, 긴 수명, 낮은 다양성, 및 낮은 독성14cytometry.
- Adoptively 정 맥 (i.v.) 1 x 106 라이브 중요 한 셀 추적 염료 얼룩이 순진한 CD4/OTII T 셀 마우스 당 PBS의 100 µ L에 전송 합니다. 레이블이 T 세포 adoptively 꼬리 정 맥 또는 복고풍 궤도 주입15;으로 옮겨질 수 있다 두 경우 모두에서 세포 림프 기관 (그림 6A)에 홈 것입니다.
- 도전 받는 사람 마우스 1 일 후 adoptively 100000 LPS 성숙 OVAp 로드 Dc 올리십시오 (그림 6B)에 피하 주사 (s.i.)로 전송 하 여.
- 받는 사람 마우스에서 오 금 림프절을 수확 하 고 이전 3.1 및 3.2에 설명 된 동일한 단계를 수행 하는 단일 셀 정지의 획득까지 그들을 처리 합니다. 이렇게 하루 2 사후 예방 접종 CD4/OTII T 세포 활성화를 측정 하 고 확산 플러스 Th1 차별화를 측정 하는 5 일에.
- 하루에 2 T 세포 활성화를 분석 하려면 얼룩 CD4, CD69와 CD25 형광 항 체와 세포 (선택적으로 CD45.1와 CD45.2) C69의 비율을 결정 하 고+CD25+ T 세포 CD4 인구. Cytometry (그림 7)에 의해 분석.
- 5 일에 T 세포 증식을 확인 하려면 셀 c d 4와 선택적으로 CD45.1와 CD45.2에 대 한 적절 한 형광 항 체를 사용 하 여 얼룩. CD4 인구에서 중요 한 셀 추적 염료 신호 감퇴 cytometry (그림 8) 분석. 중요 한 셀 추적 염료와 각 형광 피크에 나누어 세포의 비율, 총 셀에 나누어 세포의 백분율을 표시 하는 세포에 의해 받은 셀 분할 수 등이 연구에 여러 매개 변수를 확인할 수 있습니다. 인구입니다.
- 하루 5, Th1 차별화 플레이트 1 µ M ionomycin과 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 아세테이트 (PMA) 인큐베이터에서 37 ° C에서 6 시간을 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 200 µ L에서 96 잘 접시의 당 400000 셀을 결정 합니다. 마지막 4 h 3-10 µ g/mL brefeldin 매체에 cytokine 분 비를 차단 하는 추가 합니다.
- 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 번호판을 원심 96 잘 접시의 급속 한 반전으로는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 2.2.2 단계를 반복 합니다.
- 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 항 체의 CD4 하 고 CD45.1 및 CD45.2 제조 업체 권장 희석에서 30 µ L에 4 ° C에서 15 분 동안 배양 하 여 세포 막 얼룩. 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 세척 하 고 250 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 번호판을 원심 상쾌한 삭제.
- 1000 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 번호판 실시간 원심 분리기에서 20 분 동안 2 %paraformaldehyde/1% 자당의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정 폐기는 상쾌한.
- 세포내 permeabilization 버퍼 (1 x PBS + 0.1 %BSA, 0.01 M HEPES, 0.3% 사포닌)의 50 µ L을 추가 하 여 세포를 permeabilize, 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 실시간 삭제는 상쾌한에서 1000 x g 에서 PBS와 5 분 동안 원심 분리기의 150 µ L를 추가 합니다.
- 버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)에서 IFNγ 항 체 안티 fluorophore 활용의 30 µ L을 추가 하 여 세포내 cytokines 얼룩이 실시간에서 30 분 동안 품 어
- 버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 씻어. RT에서 1000 x g 에 5 분 동안 접시를 원심 및 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- Cytometry (그림 8)에 의해 세포 인구를 분석 합니다.
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Representative Results
그림 1 에서는이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 보여 줍니다. 그림 2 에서는 분리와 마우스 BM 세포의 문화를 보여 줍니다. 이러한 문화에 GM-CSF와 LPS의 추가 허용 한다 생체 외에서 생성 하 고 Dc. 그림 3 의 성숙 분화의 흐름 cytometry 분석과 취득된 Dc OVAp 로드 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 성숙 보여 줍니다. 그리고 고립 된 중요 한 셀 추적 염료 얼룩이 CD4/OTII T 세포 adoptively 마우스에 게 전송 됩니다. 그림 4 는 CD4/OTII T 세포의 절연에 사용 되는 림프절의 위치를 보여줍니다. 그림 5 50 mL 튜브 70 µ m 나일론 필터 장착 및 림프절과 비장 균질 하는 데 사용 하는 주사기 플런저를 보여준다. 그림 6 i.v. 주입 CD4/OTII T 세포의 복고풍-궤도 총으로는 노상 강도에 OVAp 로드 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 사우스 캐롤라이나 주입을 보여줍니다. CD4/OTII T 세포 GM-CSF Dc 마이그레이션할 오 금 림프절 GM-CSF Dc OVAp의 프레 젠 테이 션에 의해 순진한 CD4/OTII T 세포를 활성화 하는 반면 다른 림프 기관에 배포 합니다. 순진한 CD4/OTII T 세포 확산 그리고 Th1 표현 형으로 구분 합니다. 그림 7 에 순진한 막 CD69의 분석에서 CD4/OTII T 세포 활성화의 정량화와 CD25 식을 보여 줍니다. 그림 8 CD4/OTII T 세포 확산의 정량화를 보여줍니다. 그림 9 는 Th1 표현 형으로 CD4/OTII T 세포 분화의 정량화를 보여 줍니다.
그림 1: 프로토콜 스키마. 1) BM 셀 마우스 화관 tibias에서 격리 합니다. GM-CSF BM을 생성 하기 위해 GM-CSF와 문화 2) BM 세포 파생-Dc. 3) 확인 DC 분화 및 성숙 GM-CSF BM 파생-Dc LPS와 함께. 4) DC 성숙을 확인 합니다. 5) Dc OVAp 로드 합니다. 6) CD4/OTII T 세포 형태 마우스 비장을 격리 합니다. 중요 한 셀 추적 염료와 7) 얼룩 CD4/OTII T 세포. 8) 절연 순도 격리 된 CD4/OTII T 세포의 중요 한 세포 추적 염료 얼룩 확인 합니다. 9) adoptively 받는 사람 마우스 격리 된 CD4/OTII T 세포 i.v. 전송. 10). adoptively 받는 사람 마우스 OVAp 로드 및 성숙 Dc 사우스 캐롤라이나를 전송. 11) CD4/OTII T 세포 활성화를 확인 합니다. 12) CD4/OTII T 세포 증식 및 분화를 확인 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마우스 화관 및 tibias 골 격리 프로세스. (A) 피부 절 개를가 위로. (B) 다리에서 피부 제거. (C) 절 개를가 위로 근육. (D)에서 메스와 사지 근육의 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: GM-CSF BM 파생 된 Dc의 성숙의 cytometry 분석 흐름. MHCII, CD80, 및 LPS 활성화 (+ LPS) CD86 식 표면 및 비 활성화 (-LPS) GM-CSF BM 파생 Dc. 숫자는 임의 단위 (거리) 평균 형광 강도 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 사 타 구니, 겨드랑이, 상 완, 자 궁 경부, 그리고 mesenteric 림프절 및 생쥐에서 비장 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 림프절과 비장 균질에 대 한 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 입양 전송 CD4/OTII T 세포와 OVAp 로드 GM-CSF BM-파생-Dc. 역 궤도 총으로 CD4/OTII T 세포의 (A) 정 맥 주사. (B)는 노상 강도에 GM-CSF BM 파생 Dc OVAp 로드의 피하 주사 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: T 세포 활성화 비보의 정량화. Cytometry 플롯과 그래프 분석 및 정량화 CD69의 막 식의 CD4 T 세포에서 보여주는 흐름. CD45.1/CD45.2 마우스 했다 마우스 CD45.1/CD4/OTII와 CD45.1/CD4/OTII 셀 OVAp 로드 GM-CSF BM의 사우스 캐롤라이나 입양 전송 되기 전에 24 h adoptively 전송된 i.v.-파생-Dc. T 세포 활성화는 2 일 게시물-DC에서 측정 했다 cytometry에 이전 후 표시 된 항 원에 항 체 형광 태그와 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: T 세포 확산 비보의 정량화. Cytometry 플롯 및 그래프 분석 및 정량화 CD4 T 세포 확산에 얼룩이 감소 중요 한 셀 추적 염료의 흐름. CD45.2 마우스 마우스 CD45.1/CD4/OTII 셀 OVAp 로드 GM-CSF BM의 사우스 캐롤라이나 입양 전송 되기 전에 24 h adoptively 전송된 i.v. 했다-파생-Dc. T 세포 확산 5 일 포스트-DC에서 측정 했다 cytometry와 얼룩 후에 이전에 형광 항 체를 가리킨다. T 세포 증식 또는 사단 봉우리는 그래프에 표시 된 대로의 수를 계산 하 여 각 부문 피크 셀의 비율, 세포 증식의 비율을 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: T 세포 Th1 표현 형에서 비보에향해 분화의 정량화. 흐름 cytometry 플롯 그래프 분석 및 IFNγ 표현 CD4 T 세포의 비율의 정량화. CD45.2 마우스 마우스 CD45.1/CD4/OTII 셀 OVAp 로드 GM-CSF BM의 사우스 캐롤라이나 입양 전송 되기 전에 24 h adoptively 전송된 i.v. 했다-파생-일 게시물-DC에서 Dc. T 세포 분화를 측정 했다 cytometry와 얼룩 후에 이전에 형광 항 체를 가리킨다. T 세포 Th1 표현 형으로 분화 proliferating CD4 T 세포만 오가는 총 CD4 T 세포의 비율으로 표현 하는 IFNγ 세포로 결정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 활성화, 확산, 그리고 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하는 BM 파생 된 Dc의 용량 특성에 대 한 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 변조 CD4 T 세포의 민감성을 평가 하기 위해 BM 파생 DCs에 의해. 이 프로토콜 측정 vivo에서이러한 이벤트에는 변경 될 수 있습니다.
조사 가설에 따라 T 세포와 Dc의 여러 가지 조합은 사용할 수 있습니다. 예를 들어 하나에 노크 또는 특정 유전자 또는 CD4 T 세포 활성화, 확산, 또는 Th1 차별화의 특정 자극의 효율을 떨어뜨리는 결과 분석할 수 있습니다. Dc 또는 CD4 T에이 절차를 수행할 수 있습니다 세포 또는 세포 유형 모두에. 따라서, 야생-타입 또는 유전자 변형 쥐에서 CD4 T 세포와 야생-타입 마우스를 파생 하는 Dc와 결합할 수 있습니다.
이 프로토콜은 cytometry 및 CD45.1 및 CD45.2에 대 한 항 체를 사용 하 여 다른 세포 인구의 구별을 적용할 수 있습니다. 실제로, CD45.1/CD45.1 및 CD45.2/CD45.2 마우스 사용할 수 있습니다 사용 하는 셀 형식의 소스로 또는 받는 사람으로 조합에 입양 전송. 예를 들어 CD45.2/CD45.2 마우스 DC 생성에 대 한 BM의 원점 수 CD4 T 세포 CD45.1/CD45.1/OTII 마우스에서 얻을 수 있습니다. 이 실험에서 두 세포 유형 adoptively CD45.1/CD45.2 마우스를 전송할 수 있습니다. 또한, CD45.1/CD45.1에서 CD4/OTII T 세포 하나 마우스 타입과 CD45.2/CD45.2 타입 2 마우스는 동일 하거나 다른 CD45.1/CD45.2 유형 3 받는 사람을 하나 종류의 동작을 비교 하 고 경쟁에서 두 CD4 T 세포 인구를 입력에 결합 될 수 있다 고 비 경쟁 조건, 각각.
이 방법은 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 생성을 설명합니다. 그러나, 대체 프로토콜 DC 성숙과 차별화;에 대 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어 papain LPS 또는 GM-CSF, CD4 T 세포 적응 면역 활성화 phenotypically 별개 Dc의 능력의 연구 허용 대신 fms 관련 된 티로신 키 니 아 제 3 ligand (Flt3-L) 대신 사용할 수 있습니다. 항 원 로드 및 프레 젠 테이 션에 대 한 Dc 같은 의도로 수 직접 쥐에서 분리. 조합 다른 사람으로이 프로토콜의9 조작을 허용 순의 CD4/OTII T 세포 바이러스 감염16 받는 사람 마우스에 그들의 입양 전송 되기 전에. BM 레트로 바이러스 프로토콜에 사용 하기 전에 dc 제어 셀 수정의 효과 연구를9 로 불리고 수 수 있습니다.
또한,이 프로토콜 형광 단백질을 표현 하는 셀을 사용 하 여 intravital 현미경 연구17 적용할 수 있습니다. 예를 들어 GFP 또는 체리 표현 GFP 또는 체리/OTII CD4 쥐를 쥐와 CD4/OTII 마우스를 넘어 수 있습니다. 이러한 마우스 CD4 T 세포의 원본으로 사용할 수 있습니다 그리고 vivo에서 실험 필요에 따라 체리 또는 GFP 표현 쥐에서 BM 파생 Dc와 결합 될 수 있다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
우리는 영어 편집 닥터 사이먼 바 틀을 감사합니다. 이 연구는 Instituto de에서 교부 금에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), 미겔 세르 프로그램과 Fundación 라몬 Areces; 함께 Fondo Europeo 드 개발 지역 (페더)에서 공동 자금. CNIC 경제 산업성, 산업 및 경쟁력 (MEIC), 그리고 프로 CNIC 재단에서 지원 하 고는 세 베로 오 초아 센터의 우수 (SEV-2015-0505). RTF Fundación 라몬 Areces CNIC, VZG ISCIII, BHF Instituto de에 의해 의해 의해 설립 Investigación Sanitaria 병원 12 드 Octubre (imas12)와 ISCIII 미겔 세르 프로그램 및 imas12에 의해 JMG-G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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