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Behavior

Kynurenine और Kynurenic एसिड का एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी माप: अनुभूति और चूहों में सोने के लिए जैव रसायन से संबंधित

Published: August 19, 2018 doi: 10.3791/58129
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Maryland School of Medicine

Summary

kynurenine मार्ग (केपी) में परिवर्तन neuroactive चयापचयों को मनोरोगी बीमारियों में फंसा रहे हैं. कुतर में vivo में एक बदल kynurenine मार्ग चयापचय के कार्यात्मक परिणामों की जांच स्पष्ट उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण में मदद मिल सकती है । वर्तमान प्रोटोकॉल जैव रासायनिक और व्यवहार दृष्टिकोण को जोड़ती है चूहों में एक तीव्र kynurenine चुनौती के प्रभाव की जांच ।

Abstract

tryptophan क्षरण के kynurenine मार्ग (केपी) को मनोरोग विकारों में फंसाया गया है. विशेष रूप से, astrocyte-व्युत्पंन metabolite kynurenic एसिड (KYNA), दोनों एनमिथाइल-डी-aspartate (मोर्फिन) और α7 कोर्टेक्स acetylcholine (α7nACh) रिसेप्टर्स में एक विरोधी, स्वास्थ्य और रोग में संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं में फंसाया गया है । के रूप में KYNA का स्तर एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों के दिमाग में बुलंद कर रहे हैं, glutamatergic और कोलीनर्जिक रिसेप्टर्स पर एक खराबी के कारण संज्ञानात्मक रोग, बीमारी के psychopathology के एक कोर डोमेन से संबंधित होने के लिए माना जाता है. KYNA एक प्रकार का पागलपन के साथ व्यक्तियों में pathophysiologically महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । यह प्रत्यक्ष bioprecursor kynurenine के साथ पशुओं के इलाज के द्वारा कुतर मस्तिष्क में अंतर्जात KYNA तरक्की संभव है, और चूहों में नैदानिक अध्ययन है कि KYNA में तीव्र उंनयन उनके सीखने और स्मृति प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते है दिखा दिया है । वर्तमान प्रोटोकॉल विस्तार में इस प्रायोगिक दृष्टिकोण का वर्णन है और एक को जोड़ती है) रक्त kynurenine स्तर और मस्तिष्क KYNA गठन के एक जैव रासायनिक विश्लेषण (उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर), ख) जांच करने के लिए व्यवहार परीक्षण हिप्पोकैम्पस-निर्भर प्रासंगिक स्मृति (निष्क्रिय परिहार प्रतिमान), और ग) सो-जागो व्यवहार का एक आकलन [telemetric रिकॉर्डिंग इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम (ईईजी) और चूहों में electromyogram (ईएमजी) संकेतों] संयोजन । एक साथ लिया, ऊंचा KYNA, नींद के बीच एक रिश्ता है, और अनुभूति का अध्ययन किया है, और इस प्रोटोकॉल विस्तार में एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण kynurenine उंनयन और चूहों में vivo में KYNA गठन के समारोह परिणामों को समझने के लिए वर्णन करता है । इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों के माध्यम से प्राप्त परिणाम परिकल्पना का परीक्षण करेंगे कि केपी और KYNA स्वास्थ्य और रोग राज्यों में नींद और अनुभूति का नियमन करने में निर्णायक भूमिकाएं निभाते हैं ।

Introduction

केपी आवश्यक एमिनो एसिड tryptophan1के लगभग ९५% अपमानजनक के लिए जिंमेदार है । स्तनधारी मस्तिष्क में, astrocytes में लिया kynurenine neuroactive छोटे अणु KYNA में मुख्य रूप से एंजाइम kynurenine aminotransferase (कैट) द्वितीय2द्वारा metabolized है । KYNA मस्तिष्क2,3,4में मोर्फिन और α7nACh रिसेप्टर्स में एक विरोधी के रूप में कार्य करता है, और भी aryl हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर (AHR) और जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर ३५ (GPR35) 5 सहित रिसेप्टर्स संकेतन लक्ष्य ,6. प्रयोगात्मक जानवरों में, मस्तिष्क KYNA में उन्नयन व्यवहार परख2,7,8,9,10 की एक सरणी में उनके संज्ञानात्मक प्रदर्शन ख़राब करने के लिए दिखाया गया है . एक उभरती हुई परिकल्पना से पता चलता है कि KYNA नींद-जागो व्यवहार11प्रभावित द्वारा संज्ञानात्मक कार्यों को नियमन करने में एक अभिंन भूमिका निभाता है, इस प्रकार आगे सोने की तंत्रिका जीव विज्ञान नियमन में astrocyte-व्युत्पंन अणुओं की भूमिका का समर्थन और अनुभूति१२.

चिकित्सकीय, KYNA में उन्नयन मस्तिष्कमेरु द्रव और एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों से पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक में पाया गया है13,14,15,16, एक दुर्बल मनोरोग विकार संज्ञानात्मक विकलांगता की विशेषता । एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों को भी अक्सर नींद अशांति है कि17बीमारी ख़राब कर सकते से त्रस्त हैं । विशेष रूप से सीखने और स्मृति के बीच नींद और अनुभूति, के बीच एक रिश्ता मॉडुलन में केपी चयापचय और KYNA की भूमिका को समझना, एक प्रकार का पागलपन और अन्य में इन गरीब परिणामों के इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सा के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं मनोरोग बीमारियों ।

केपी चयापचयों के माप के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि से यह विश्वास दिलाना जरूरी है कि विभिन्ना संस्थाओं से उभरते हुए शोध को केपी बायोलॉजी की वैज्ञानिक समझ में एकीकृत किया जा सकता है. वर्तमान में, हम उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा चूहे के मस्तिष्क में चूहे प्लाज्मा और KYNA में kynurenine को मापने के लिए पद्धति का वर्णन । वर्तमान प्रोटोकॉल, जो Zn 2 की उपस्थिति में एक fluorimetric का पता लगाने का उपयोग करता है+, पहली शिबाता द्वारा विकसित किया गया था18 और अधिक हाल ही में अनुकूलित और पोस्ट के रूप में ५०० mM जस्ता एसीटेट के साथ derivatize के लिए अनुकूलित-कॉलम रिएजेंट, के लिए अनुमति अंतर्जात का पता लगाने, मस्तिष्क में KYNA की nanomolar मात्रा11.

वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में डी नोवो अंतर्जात KYNA उत्पादन को उत्तेजित करने के लिए, प्रत्यक्ष bioprecursor kynurenine चूहों में intraperitoneally (आईएफसआई) इंजेक्ट किया जाता है । KYNA उत्पादन की डिग्री निर्धारित करने के लिए जैव रासायनिक आकलन के साथ संयोजन में, हिप्पोकैम्पस पर निर्भर स्मृति पर एक kynurenine चुनौती के प्रभावों (निष्क्रिय परिहार प्रतिमान) और सो-जागो वास्तुकला (ईईजी और ईएमजी संकेतों) भी है 11की जांच की । इन तकनीकों का एक संयोजन एक kynurenine चुनौती के जैव रासायनिक और कार्यात्मक चूहों में vivo में प्रभाव के अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

हमारे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल मैरीलैंड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के बाद किया गया ।

नोट: वयस् क नर Wistar चूहों (250-350 ग्राम) का प्रयोग सभी प्रयोगों में किया गया । जानवरों के अलग साथियों जैव रासायनिक विश्लेषण, व्यवहार प्रयोगों, और नींद जागो रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया गया । जानवरों मैरीलैंड मनोरोग अनुसंधान केंद्र में एक तापमान नियंत्रित सुविधा में स्थित थे । वे एक 12/12 एच प्रकाश पर रखा गया था अंधेरे चक्र, पर रोशनी के साथ zeitgeber समय (ZT) 0 और ZT 12 पर बंद रोशनी । जानवरों के प्रयोगों के दौरान भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum पहुँच प्राप्त की. सुविधा पूरी तरह से प्रयोगशाला पशु देखभाल की मांयता के लिए अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा मांयता प्राप्त था ।

1. चूहों को Intraperitoneal Kynurenine प्रशासन

नोट: इस प्रोटोकॉल में, kynurenine ZT 0 पर प्रशासित किया गया था (प्रकाश चरण की शुरुआत) और ऊतक ZT 2 और ZT 4 में एकत्र किया गया था kynurenine चयापचय के लिए एक समय पाठ्यक्रम का निर्धारण । खारा इंजेक्शन जानवरों के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । उदाहरण के लिए, यदि एक चूहे का वजन ५०० ग्राम और वांछित खुराक १०० मिलीग्राम/किलो है, चूहे kynurenine के एक 10 मिलीग्राम/एमएल समाधान की एक 5 मिलीलीटर इंजेक्शन प्राप्त करना चाहिए ।

  1. बाहर वजन L-kynurenine सल्फेट ("kynurenine") और यह एक 20 मिलीलीटर कांच की शीशी में जगह है । kynurenine को हर समय बर्फ पर रखना सुनिश्चित करें ।
  2. खारा जोड़ें वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए और पीएच समायोजित करने के लिए ७.६ 1 N सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) का उपयोग कर । भंवर और sonicate जब तक समाधान kynurenine पूरी तरह से भंग कर दिया है ।
    चेतावनी: NaOH हैंडलिंग करते समय सभी अनुशंसा सावधानियों का पालन करें ।
    1. उदाहरण के लिए, प्राप्त करने के लिए एक 10 मिलीग्राम/एमएल समाधान, बाहर वजन २०० मिलीग्राम kynurenine और यह एक गिलास शीशी में जगह है । खारा और भंवर और sonicate के 15 मिलीलीटर जोड़ें (5 के लिए 20 kHz-10 एस, 1/8 इंच व्यास microtip) यह भंग करने के लिए । NaOH का प्रयोग, समाधान के पीएच समायोजित करें । अंत में, खारा का उपयोग करने के लिए 20 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें ।
  3. प्रत्येक प्रयोगात्मक चूहे तौलना और पशु के शरीर के वजन और वांछित उपचार खुराक के आधार पर प्रत्येक इंजेक्शन की मात्रा की गणना । ध्यान से अपने घर पिंजरे से पशु निकालें, समाधान intraperitoneally इंजेक्षन, और अपने पिंजरे में पशु वापस ।

2. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर Kynurenine माप

  1. ऊतक संग्रह
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, kynurenine ZT 0 पर प्रशासित किया गया था (प्रकाश चरण की शुरुआत) और ऊतक ZT 2 और ZT 4 में एकत्र किया गया था kynurenine चयापचय के लिए एक समय पाठ्यक्रम का निर्धारण । खारा इंजेक्शन जानवरों के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
    1. पशु euthanize करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड का प्रयोग करें । श्वसन के संकेत के बाद 1 मिनट के लिए बंद कर दिया है, decapitation द्वारा एक माध्यमिक इच्छामृत्यु विधि करते हैं ।
    2. पूरे ट्रंक रक्त इकट्ठा करने के लिए, एक 15 मिलीलीटर में एक डिस्पोजेबल कीप प्लेस3K-EDTA (०.५ मीटर) के 20 μL युक्त ट्यूब । शरीर से खून को ट्यूब में छानकर दें । ट्यूब उल्टे बार EDTA सुनिश्चित करने के लिए भर में मिलाया जाता है ।
    3. कैंची का प्रयोग, midline खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए नीचे सिर के ऊपर त्वचा को काट । खोपड़ी की पीठ पर किसी भी अतिरिक्त गर्दन की मांसपेशी निकालें और, रीढ़ की हड्डी के लिए खोलने पर, वापस करने के लिए सामने से खोपड़ी के माध्यम से काट ।
      1. धीरे मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खुला खोपड़ी के दोनों किनारों खींचो, और फिर ध्यान से संदंश के साथ मस्तिष्क को दूर ताकि यह नुकसान नहीं है । एक उस्तरा ब्लेड के साथ घ्राण बल्ब निकालें और midline नीचे आधे में मस्तिष्क को काट । संदंश का प्रयोग, काटना hemibrain को ब्याज के क्षेत्रों में (यानी, हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था) ।
    4. सूखी बर्फ पर एल्यूमीनियम पंनी पर सभी विच्छेदित मस्तिष्क टुकड़े प्लेस । ऊतक पूरी तरह से जम जाने के बाद, यह एक 20 मिलीलीटर प्लास्टिक की शीशी में स्थानांतरण और-८० डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
    5. 10 मिनट के लिए ३०० x g पर पूरे ट्रंक रक्त केंद्रापसारक । supernatant (प्लाज्मा) को हटाने और नए केंद्रापसारक ट्यूबों में स्थानांतरण उंहें भंडारण से पहले-८० डिग्री सेल्सियस ।
  2. नमूना तैयारी
    1. प्लाज्मा: स्वास्थ्यकर्मी पशुओं से एकत्र
      1. पिघल प्लाज्मा के साथ जमे हुए ट्यूब (ऊतक संग्रह के लिए २.१ कदम देखें) गीली बर्फ पर ।
      2. एक नए केंद्रापसारक ट्यूब में, ultrapure पानी के साथ नमूना पतला (kynurenine के लिए 1:2, KYNA के लिए 1:10) । पतला नमूना के १०० μL के लिए, 6% perchloric एसिड की 25 μL जोड़ें ।
        चेतावनी: perchloric एसिड को संभालने के दौरान सभी सिफारिश सावधानियों का पालन करें ।
      3. भंवर सभी नमूनों, तो उंहें 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । एक बार समाप्त, supernatant के १०० μL निकालें (प्रत्येक ट्यूब से) और उंहें kynurenine या KYNA दृढ़ संकल्प के लिए एक छोटे से ०.२५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है ।
    2. ब्रेन: स्वास्थ्यकर्मी पशुओं से एकत्र
      1. जमे हुए मस्तिष्क के नमूनों के साथ प्लेस ट्यूबों (ऊतक संग्रह के लिए कदम २.१ देखें) सूखी बर्फ पर । व्यक्तिगत रूप से एक सटीक विश्लेषणात्मक संतुलन पर प्रत्येक मस्तिष्क नमूना तौलना. यह ट्यूब के लिए वापस और सूखी बर्फ पर इसे वापस जगह है ।
      2. सभी नमूनों तौला गया है के बाद, गीला बर्फ पर ट्यूबों चाल. ultrapure पानी के साथ प्रत्येक नमूना 1:10 w/v पतला और उंहें एक sonicator (20 kHz के लिए 5-10 एस, 1/8 इंच व्यास microtip) का उपयोग कर homogenize । उदाहरण के लिए, मस्तिष्क ऊतक के १०० मिलीग्राम के लिए, ultrapure पानी की ९०० μL जोड़ें ।
      3. Aliquot १०० μL एक पतला नमूना के लिए एक नई ट्यूब और acidify 25% perchloric एसिड की 25 μL के साथ । भंवर, तो यह 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
      4. इस केंद्रापसारक के बाद, supernatant के १०० μL निकालें और यह KYNA निर्धारण के लिए छोटे ०.२५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में जगह है ।
  3. HPLC सेट अप और भागो
    1. ५० mM सोडियम एसीटेट मोबाइल फेज तैयार करें । ultrapure पानी के 1 L में सोडियम एसीटेट trihydrate की ६.८१ ग्राम को भंग करें । ६.२ हिमनदों एसिटिक एसिड का उपयोग करने के लिए पीएच समायोजित करें और फिर साफ कांच के बीच में यह फिल्टर वैक्यूम । सोडियम एसीटेट मोबाइल चरण एक साफ 1 L कांच की बोतल के लिए स्थानांतरण ।
    2. तैयार ५०० mM जिंक एसीटेट । ultrapure पानी की ५०० मिलीलीटर में जस्ता एसीटेट के ५४.८८ जी भंग, तो यह वैक्यूम फिल्टर । यह एक साफ ५०० मिलीलीटर कांच की बोतल के लिए स्थानांतरण । ultrapure पानी और HPLC ग्रेड acetonitrile के साथ एक ५०० मिलीलीटर की बोतल के साथ एक 1 एल बोतल भरें ।
    3. HPLC मशीन से सेवन टयूबिंग अलग से मोबाइल चरण में रखें, ultrapure पानी, और १००% acetonitrile । जस्ता एसीटेट समाधान अलग से एक सिकुड़नेवाला पंप है कि मोबाइल चरण के बाद कॉलम के साथ जोड़ती है, और derivatization से पहले के माध्यम से पंप ।
    4. मशीन पर नियंत्रण कक्ष का उपयोग करते हुए, यह प्रोग्राम 5% acetonitrile और ९५% ultrapure पानी पर चलाने के लिए ०.५ मिलीलीटर/एक स्थिर दबाव और आधारभूत को प्राप्त करने के लिए 20-30 मिनट के लिए चलाने के लिए अनुमति दें ।
    5. एक स्थिर आधार रेखा स्थापित करने पर, समाधान संरचना 5% acetonitrile और ९५% सोडियम एसीटेट मोबाइल चरण के लिए बदल जाते हैं । 30 मिनट के लिए Equilibrate ।
    6. प्रतिदीप्ति डिटेक्टर में दीपक पर बारी और यह गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    7. इस बीच, यह भी ०.१ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर करने के बाद स्तंभ पंप पर बारी/लगभग 20 मिनट के बाद के बारे में ५०० साई के एक स्थिर दबाव तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं ।
    8. मानकों को तैयार करें ।
      1. KYNA के लिए, एक 1 मिमी स्टॉक समाधान के साथ शुरू और यह 5 मानक सांद्रता (यानी, 10 एनएम, 5 एनएम, २.५ एनएम, 1 एनएम, और ५०० बजे) तैयार करने के लिए पतला ।
        नोट: यह २०० fmoles से 20 μL इंजेक्शन प्रति 10 fmoles से लेकर एक मानक वक्र उत्पादन होगा ।
      2. kynurenine के लिए, एक 1 मिमी स्टॉक समाधान के साथ शुरू और यह 5 मानक सांद्रता (यानी, 10 माइक्रोन, 5 माइक्रोन, २.५ माइक्रोन, 1 माइक्रोन, और ५०० एनएम) तैयार करने के लिए पतला ।
        नोट: यह २०० pmoles से 20 μL इंजेक्शन प्रति 10 pmoles से लेकर एक मानक वक्र उत्पादन होगा ।
    9. नमूना अनुक्रम पैरामीटर को नियंत्रित करने और एकाधिक नमूनों की HPLC के लिए अनुमति देने के लिए सिस्टम सॉफ़्टवेयर सेट करें ।
      1. "नमूना चलाएँ" स्क्रीन पर, "फ़ाइल" पर क्लिक करें और "नया नमूना सेट बनाएँ" करने के लिए नीचे खींचें. जब नई विंडो खुलती है, तो "खाली" का चयन करें । व्यक्तिगत रूप से सभी मानकों की सूची (चरण 2.3.8 देखें) या नमूने वे चलाया जाना चाहिए क्रम में.
      2. "फ़ंक्शन" स्तंभ में, मानक और नमूने निर्दिष्ट करें । मानकों की शुरुआत और अनुक्रम के अंत में परख की जानी चाहिए । हर 5 नमूनों के बीच पानी इंजेक्ट ।
      3. प्रत्येक नमूने के लिए चलाते समय 15 मिनट के लिए सेट करें । मानकों और प्लाज्मा तैयारी से नमूने के 20 μL इंजेक्षन या मस्तिष्क homogenate तैयारी से नमूने के 30 μL इंजेक्षन.
      4. सेट उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (यौगिक पर निर्भर मूल्यांकन किया जा रहा) kynurenine के लिए उत्तेजना के लिए: ३६५ एनएम, उत्सर्जन: ४८० एनएम, और प्रतिधारण समय: ~ 6 मिनट, और KYNA उत्तेजना के लिए: ३४४ एनएम, उत्सर्जन: ३९८ एनएम, और प्रतिधारण समय: ~ 11 मिनट ।
      5. एक बार सभी मापदंडों सेट किया गया है और मशीन equilibrated है, अनुक्रम चलाते हैं ।
      6. डेटा को बढ़ाता है, "ब्राउज़ करें प्रोजेक्ट" स्क्रीन पर नेविगेट करें । "नमूना सेट" टैब के अंतर्गत, quantified किया जा करने के लिए सेट नमूना पर डबल-क्लिक करें । सभी इंजेक्शन की सूची से, सभी मानकों पर प्रकाश डाला और राइट-क्लिक करें । नई विंडो में, "प्रक्रिया" का चयन करें, तब ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करने के लिए "जांचना और Quantitate" के आगे "कैसे": का उपयोग करें ।
      7. सभी मानकों पर फिर से प्रकाश डाला, राइट क्लिक करें और "समीक्षा" का चयन करें. जब chromatograms खुला, शीर्ष के साथ बटन का उपयोग करने के लिए "एकीकृत" और फिर "जांचना" प्रत्येक मानक; यह स्वचालित रूप से मानक वक्र बना देगा ।
      8. "नमूना सेट" टैब पर लौटें और नमूना सेट पर डबल-क्लिक करें । अगले, सभी मानकों पर प्रकाश डाला । ऊपर कहा गया प्रक्रिया दोहराएँ, लेकिन इसके बजाय, ड्रॉप-डाउन मेनू से "Quantitate" का चयन. सभी नमूनों को फिर से हाइलाइट करें, फिर राइट-क्लिक करके "समीक्षा करें" चुनें. जब chromatograms खुला, शीर्ष के साथ बटन का उपयोग करने के लिए "एकीकृत" और फिर "Quantitate" प्रत्येक नमूने ।
        नोट: यह उत्पादन पहले बनाया मानक वक्र पर आधारित प्रत्येक नमूने की एकाग्रता होगा ।

3. निष्क्रिय परिहार प्रतिमान

नोट: इन व्यवहार प्रयोगों तीव्र kynurenine चुनौती के साथ हमारे जैव रासायनिक निष्कर्षों के आधार पर डिजाइन किए गए थे । के लिए मस्तिष्क KYNA में वृद्धि को अधिकतम करने के लिए, kynurenine (१०० मिलीग्राम/kg) ZT 0, 2 ज में प्रशासित था निष्क्रिय परिहार प्रतिमान में प्रशिक्षण सत्र से पहले परीक्षण हिप्पोकैम्पस-मध्यस्थता सीखने, कि 2 ZT में हुई । उपकरण के होते है 2 समान रूप से आकार के डिब्बों (२१.३ सेमी उच्च, २०.३ सेमी चौड़ा, और १५.९ सेमी गहरी) एक गिलोटिन दरवाजे से अलग है और एक ध्वनि-रहित बॉक्स के भीतर समाहित । परीक्षण तंत्र के दो डिब्बों "प्रकाश पक्ष" और "अंधेरे पक्ष" करार कर रहे हैं । प्रकाश पक्ष की दीवारों को स्पष्ट कर रहे है और, परीक्षणों के दौरान, एक प्रकाश को आगे इस डिब्बे रोशन पर बंद हो जाएगा । ब्लैक आउट की हालत बनाए रखने के लिए अंधेरे डिब्बे की दीवारें पूरी तरह से ढक रखी हैं ।

  1. 1 दिन: प्रशिक्षण परीक्षण
    1. परीक्षण से पहले, ७०% इथेनॉल के साथ उपकरण साफ ।
    2. जानवरों को टेस्टिंग रूम में लाएं ।
    3. धीरे उपकरण के प्रकाश पक्ष में प्रयोगात्मक पशु जगह और बंद और तंत्र दरवाजा और ध्वनि का डिब्बा कुंडी ।
    4. संबद्ध सॉफ्टवेयर का प्रयोग, परीक्षण शुरू करते हैं । होम स्क्रीन से, "फ़ाइल" का चयन करें और फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से "सत्र खोलें". नई विंडो में, सुनिश्चित करें कि सही प्रक्रिया और तंत्र का चयन कर रहे हैं और "बंद करो". अगला, का चयन करें "कॉंफ़िगर करें" और फिर "सिग्नल" । नई विंडो में, सही उपकरण का चयन करें और "समस्या" क्लिक ।
      नोट: सॉफ्टवेयर उपकरण के प्रकाश पक्ष में चालू करने के लिए और दो डिब्बों के बीच गिलोटिन दरवाजा खोलने के लिए एक प्रकाश शुरू होगा । एक टाइमर शुरू किया जाएगा ।
    5. जब जानवर पूरी तरह से तंत्र के अंधेरे पक्ष में प्रवेश करती है, गिलोटिन दरवाजा बंद हो जाएगा, और एक अपरिहार्य पैर सदमे (1 एस के लिए ०.५६ मा) दिया जाएगा ।
    6. पशु अंधेरे डिब्बे में प्रवेश करने से पहले बीता है कि समय रिकॉर्ड ।
    7. पशु सदमे प्राप्त हुआ है के बाद, उपकरण से पशु को हटाने से पहले वसूली समय के 30 एस की अनुमति दें ।
    8. अपने घर के पिंजरे में पशु वापस रखें ।
    9. अगले जानवर के साथ परीक्षण की शुरुआत करने से पहले, एक गीला तौलिया के साथ साफ तंत्र पोंछ और किसी भी मल छर्रों के निपटान ।
    10. सभी पशुओं को प्रशिक्षण देने के बाद उन्हें पशु सुविधा के लिए वापस लौटाएं ।
  2. 2 दिन: परीक्षण परीक्षण
    1. पशु परीक्षण के कमरे में वापस लाने के प्रशिक्षण के परीक्षण के बाद 24 एच । यह तंत्र के प्रकाश की ओर, बंद करने और दरवाजा और ध्वनि रहित बॉक्स कुंडी में रखकर पहले जानवर के लिए परीक्षण परीक्षण शुरू करते हैं ।
    2. पिछले दिन के रूप में एक ही सॉफ्टवेयर आज्ञाओं का उपयोग कर परीक्षण परीक्षण आरंभ; प्रकाश उपकरण के प्रकाश पक्ष में चालू हो जाएगा और दो डिब्बों के बीच गिलोटिन दरवाजा खुलेगा । एक टाइमर शुरू किया जाएगा ।
    3. जब पशु अंधेरे डिब्बे में प्रवेश करता है, गिलोटिन दरवाजा बंद हो जाएगा । समय बीता रिकॉर्ड ।
      नोट: परीक्षण सॉफ्टवेयर के माध्यम से समाप्त हो जाएगा ३०० की एक अधिकतम के बाद एस अगर पशु परीक्षण उपकरण के प्रकाश पक्ष पर रहता है ।
    4. अपने घर पिंजरे में पशु वापस प्लेस और तंत्र को साफ (के रूप में चरण 3.1.9 में वर्णित) अगले जानवर के साथ परीक्षण शुरू करने से पहले ।

4. नींद विश्लेषण

  1. एक वायरलेस ईईजी/ईएमजी ट्रांसमीटर के सर्जिकल आरोपण
    नोट: telemetric ट्रांसमीटरों निष्फल और सर्जरी से पहले तैयार किया जाना चाहिए ।
    1. एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, धीरे प्लास्टिक कोटिंग की एक छोटी सी लंबाई हटाने के लिए तार प्रकट होता है । ट्रांसमीटरों में एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब से भरा समाधान बंध्याकरण के साथ जगह [उदा, Wavecide (२.६५% glutaraldehyde)] ।
      1. विशुद्धीकरण के समाधान में ट्रांसमीटरों को छोड़ दें कम से 12 ज. फिर, सर्जरी से पहले, एक अपशिष्ट कंटेनर के लिए समाधान हस्तांतरण । बाँझ खारा के साथ ट्रांसमीटर कुल्ला ।
    2. शल्य चिकित्सा के दिन, यह एक संज्ञाहरण चैंबर में रखने से पहले पशु तौलना । १००% ओ2के साथ 3-5% isoflurane प्रेरित ।
    3. एक सफल संज्ञाहरण पर, पशु हटाने और ध्यान से दाढ़ी, एक बिजली के रेजर का उपयोग, सिर और गर्दन के ऊपर, साथ ही शरीर के पीछे पर बालों के एक छोटे पैच, बस थोड़ा छोड़ दिया और ribcage नीचे ।
    4. carprofen (5 मिलीग्राम/) पश्चात analgesia के लिए चमड़े के नीचे प्रशासन ।
    5. सर्जरी के दौरान पशु के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए पशु के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट एक thermostatically नियंत्रित गर्म पानी हीटिंग पैड रखें ।
    6. एक stereotaxic फ्रेम में, सिर को स्थिर करने के लिए संवेदनाहारी हालत और जगह कान सलाखों को बनाए रखने के लिए एक नाक शंकु पर पशु जगह है । betadine सफ़ाई और ७०% इथेनॉल की झाड़ू बारी द्वारा मुंडा त्वचा निष्फल । उंहें चिकनाई के लिए आंखों के लिए opthalamic मरहम लागू करें ।
    7. पहले चीरा करने से पहले पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए, पैर की अंगुली-चुटकी परीक्षण का उपयोग करें ।
    8. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करना, सिर्फ गर्दन के पीछे से नीचे आंखों के पीछे से एक चीरा बनाने. खोपड़ी और पृष्ठीय गर्भाशय ग्रीवा गर्दन की मांसपेशी उजागर किया जाना चाहिए ।
    9. खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए आवश्यक हो, तो किसी भी झिल्ली को हटाने के लिए कपास इत्तला applicators का उपयोग करें । माइक्रो-बुलडॉग clamps खोपड़ी से त्वचा को दूर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्थिति जानें और bregma का स्थान चिह्नित करें । ड्रिल 2 गड़गड़ाहट-छेद और डालें धातु शिकंजा २.० mm पूर्वकाल/1.5 मिमी पार्श्व और ७.० mm पीछे/-1.5 mm पार्श्व bregma के सापेक्ष । पूर्ण 2 क्रांतियों शिकंजा कसने के लिए । धुंध के एक टुकड़े के साथ उजागर खोपड़ी को कवर ।
    10. बस पसलियों के नीचे, बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग कर, शरीर गुहा में एक चीरा बनाते हैं ।
    11. सर्जिकल शीट पर, ट्रांसमीटर के क्रम संख्या रिकॉर्ड करने के लिए प्रत्यारोपित किया जाना सुनिश्चित करें ।
    12. शरीर गुहा के अंदर बाँझ ट्रांसमीटर डालें. तार सुराग अभी भी शरीर के बाहर होना चाहिए ।
    13. लीड के सभी चीरा के एक छोर करने के लिए इकट्ठा कर रहे हैं सुनिश्चित करना है कि मांसपेशियों की दीवार सिलाई करने के लिए अवशोषित टांके का प्रयोग करें ।
    14. सिर से धुंध निकालें और बस चीरा नीचे त्वचा लिफ्ट । पक्ष में चीरा करने के लिए सिर चीरा से त्वचा के तहत लंबे बाँझ hemostats की एक जोड़ी चलाएँ. त्वचा पर दबाव बनाये रखें ताकि किसी भी चोट को कम न कर सके ।
      1. hemostats शरीर चीरा के पास दिखाई दे रहे हैं एक बार, सर्जिकल कैंची के साथ उन्हें कवर कर सकते हैं कि किसी भी झिल्ली क्लिप और चार ट्रांसमीटर हड़पने hemostats के साथ होता है. धीरे hemostats बाहर आकर्षित, ताकि तारों त्वचा के नीचे रखना और खोपड़ी के लिए चलाते हैं ।
    15. निर्दिष्ट करें जो 2 सुराग खोपड़ी से जोड़ा जाएगा । संदंश का उपयोग करना, एक हाथ से एक तार के अंत और दूसरे के साथ प्लास्टिक म्यान के अंत में बस के नीचे समझ । व्यक्तिगत छोरों सिर्फ बाहर किया जा सकता है जब तक तार पर खींचो ।
    16. कसकर धातु शिकंजा 3-4x में से एक के आसपास उजागर तार लपेटो । एक बार सुरक्षित, जानने के लिए और किसी भी अतिरिक्त तार बंद क्लिप से तार को रोकने के पेंच कस । दूसरा सीसा और पेंच के साथ इस दोहराएं ।
    17. खींचो दोनों ईईजी शरीर गुहा से सुराग इतना है कि वे खोपड़ी के खिलाफ सुखद बैठते हैं ।
    18. उजागर खोपड़ी पर एक टोपी बनाने, शिकंजा और cortical सुराग को कवर करने के लिए दंत सीमेंट का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि कोई दंत सीमेंट त्वचा या मांसपेशी के लिए चिपक जाती है और कोई तेज किनारों बनाया जाता है । डेंटल सीमेंट को सूखने दें ।
      नोट: कैप काफी छोटा होना चाहिए कि त्वचा के शीर्ष पर टांका किया जा सकता है ।
    19. ईएमजी सुराग के लिए, चरण 4.1.15 में वर्णित के रूप में तार और प्लास्टिक म्यान के अंत समझ । व्यक्तिगत छोरों स्पष्ट रूप से समझदार हैं जब तक तार खिंचाव.
    20. 2 के लिए दाईं ओर गर्दन मांसपेशियों के तहत एक 22 जी सुई भागो-3 मिमी यह उभरने के लिए अनुमति देने से पहले. अवशोषित टांके का प्रयोग, एंबेडेड सुई के चारों ओर एक एकल, ढीला सीवन जगह है ।
    21. सुई में ईएमजी तार धागा और सुई बाहर खींच, ईएमजी तार मांसपेशी के तहत धागा करने की अनुमति. यह सुनिश्चित करने के लिए टांका कस जगह में रहता है और अतिरिक्त तार कि मांसपेशी से उभर सकता है क्लिप ।
    22. दोहराएं चरण 4.1.20 और 4.1.21 दूसरी ईएमजी लीड के लिए, के बारे में 1 mm पहले लीड से नीचे ।
    23. खींचो दोनों ईएमजी शरीर गुहा से सुराग इतना है कि वे पेशी के खिलाफ सुखद बैठते हैं ।
    24. सिर और गर्दन चीरा बंद करने के लिए अवशोषित टांके का प्रयोग करें । शरीर की त्वचा के नीचे सभी अतिरिक्त तार टक और शरीर चीरा बंद करने के लिए घाव क्लिप का उपयोग करें ।
    25. पश्चात दर्द के साथ पशु की सहायता के लिए दोनों चीरा साइटों के लिए lidocaine मरहम लागू करें ।
    26. अपने घर पिंजरे में पशु लौटें, पिंजरे हीटिंग पैड पर बैठने के लिए जब तक पशु संज्ञाहरण से बरामद किया है की अनुमति ।
      नोट: पशु 7 रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले 10 दिनों के लिए ठीक हो जाना चाहिए ।
  2. ईईजी/ईएमजी रेकॉर्डिंग
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम ZT 0 पर खारा या kynurenine प्रशासित और फिर जानवर की नींद दर्ज 24 ज के लिए पैटर्न जगा
    1. जहां जानवरों रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए बाधित नहीं किया जाएगा एक नामित कमरे में सभी नींद रिकॉर्डिंग को पूरा करें ।
    2. पशु के घर पिंजरे प्लेस (प्रत्यारोपित ईईजी/ईएमजी ट्रांसमीटर) एक रिसीवर इकाई पर । शल्य चिकित्सा से प्रत्यारोपित ट्रांसमीटर पर बारी एक चुंबक का उपयोग ।
      नोट: एक प्रकाश रिसीवर इकाई पर दिखाई जब ट्रांसमीटर सक्रिय हो जाना चाहिए ।
    3. संबद्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर ईईजी/ईएमजी डेटा की रिकॉर्डिंग सेट करें ।
      1. चुनें "प्रयोग" और फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से "बनाएं" । प्रयोग को नाम दीजिये, और फिर उसे सेव कर लीजिये. अगला, का चयन करें "हार्डवेयर" और फिर "संपादित करें MX2 विंयास" ।
      2. नई विंडो में, प्रयोग में प्रयुक्त सभी ट्रांसमीटरों का चयन करें और संकेत मिलता है जो प्राप्त पैड प्रत्येक के साथ बनती है । जब तैयार हो, दबाकर रिकॉर्डिंग शुरू "सभी सतत शुरू".
    4. प्रयोगों की समाप्ति पर, संबंधित सॉफ्टवेयर में "सभी निरंतर रोकें" का चयन करें और चुंबक का उपयोग कर ट्रांसमीटरों को बंद कर दें ।
    5. Euthanize2 asphyxiation द्वारा पशुओं को एक हृदय पंचर के बाद । सर्जिकल कैंची से सिर के ऊपर के साथ चीरा खोलने और दंत सीमेंट और गर्दन की मांसपेशी से मुक्त होता है काटने से ट्रांसमीटर ध्यान से निकालें ।
    6. अगले, शरीर गुहा खुला, ट्रांसमीटर का पता लगाने और धीरे से इसे शरीर से हटा दें ।
  3. ईईजी/ईएमजी विश्लेषण
    1. स्लीप-वेक डेटा का विश्लेषण करने के लिए संबद्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । प्रोग्राम खोलें और "नया स्थान जोड़ें" का चयन करें । नई विंडो में, यह स्कोरिंग सॉफ़्टवेयर में आयात करने के लिए डेटा का चयन करें ।
      नोट: यह प्रयोग के दौरान एकत्र सभी कच्चे waveforms युक्त सॉफ्टवेयर के भीतर एक नई फ़ाइल पैदा करेगा.
    2. मैन्युअल रूप से वांछित प्रयोगों के लिए सतर्कता राज्यों स्कोर. स्कोरिंग के बाद, इस तरह के कुल अवधि के रूप में मानकों का विश्लेषण, मुक्केबाज़ी की संख्या, और विभिंन सतर्कता राज्यों की औसत मुक्केबाज़ी अवधि [रैपिड नेत्र आंदोलन (शेष), गैर-शेष (NREM), और जागो] ।
      नोट: विश्लेषण पूरे रिकॉर्डिंग पर किया जा सकता है या ब्याज की विशिष्ट समय अंक के लिए छोटा । यहां, विश्लेषण ZT 0 ZT 2 के बीच रिकॉर्डिंग अवधि के लिए किया गया था ।

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Representative Results

मस्तिष्क KYNA तरक्की करने के लिए एक विधि के रूप में एक intraperitoneal kynurenine इंजेक्शन के उपयोग को मान्य करने के लिए, ऊतक के एक HPLC विश्लेषण किया गया था. मानक curves (चित्रा 1) संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्माण किया गया और ऊतक नमूनों की ठहराव के लिए अनुमति दी । kynurenine और KYNA के लिए प्रतिनिधि chromatograms चित्रा 2में प्रस्तुत किए गए हैं । Kynurenine 6 मिनट के एक प्रतिधारण समय पर मनाया गया था, और KYNA 11 मिनट का एक प्रतिधारण समय था । केपी गतिशीलता का पालन करने के लिए, १०० मिलीग्राम/kynurenine के किलो इस प्रोटोकॉल में प्रशासित किया गया था, और ऊतक तुरंत इंजेक्शन, या 2 या 4 एच बाद इंजेक्शन (चित्रा 3ए) के बाद एकत्र किया गया था । प्लाज्मा kynurenine (चित्रा 3 बी) और हिप्पोकैम्पस KYNA (चित्रासी) quantified थे । kynurenine चयापचयों के HPLC निर्धारण में प्रयुक्त विशिष्ट पैरामीटर्स तालिका 1में उल्लिखित हैं । खुराक-प्रतिक्रिया इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित वक्र एक विधि के रूप में एक तीव्र kynurenine इंजेक्शन के अपने विवरण का समर्थन करता है मस्तिष्क KYNA के स्तर में वृद्धि, एक 2 एच पोस्ट इंजेक्शन और KYNA के स्तर पर हासिल की चोटी के साथ अपने आधारभूत 4 एच पोस्ट इंजेक्शन के लिए लौट आए ।

aforementioned जैव रासायनिक निष्कर्षों के आधार पर, निष्क्रिय परिहार प्रतिमान में प्रशिक्षण kynurenine इंजेक्शन के बाद 2 ज प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 4a) । प्रशिक्षण परीक्षण (चित्रा 4b) के दौरान कोई समूह अंतर नहीं देखा गया । परीक्षण परीक्षण के दौरान, नियंत्रण जानवरों के अंधेरे पक्ष में प्रवेश करने के लिए विलंबता में एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित, प्रासंगिक सीखने का संकेत. पिछले दिन पर kynurenine के साथ इंजेक्शन जानवरों के विलंबता में एक ही वृद्धि प्रदर्शित नहीं किया, सीखने में एक घाटे का प्रदर्शन । इन निष्कर्षों के आधार पर, हम उस तीव्र kynurenine उन्नयन समाप्त कर सकते हैं, स्मृति अधिग्रहण और समेकन के समय के दौरान, एक हिप्पोकैम्पस मध्यस्थता कार्य में एक बिगड़ा प्रदर्शन में परिणाम.

नींद जागो वास्तुकला पर प्रकाश चरण के दौरान एक तीव्र kynurenine उन्नयन के प्रभाव की जांच करने के लिए, जानवरों खारा के साथ 1 दिन पर और kynurenine के साथ ZT 0 (चित्रा 5) पर दिन 2 पर इंजेक्शन थे. ईईजी/ईएमजी संकेत पूरे ४८ ज अविध के लिए telemetrically दर्ज किए गए । तुलना दिन 1 पर खारा इंजेक्शन (वाहन) के बीच किए गए थे और 2 दिन पर kynurenine इंजेक्शन । परिणाम कुल शेष नींद की अवधि में कमी (आधार रेखा से एक प्रतिशत परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत) पहले 2 घंटे के दौरान एक इंजेक्शन के बाद (चित्रा 5b) संकेत दिया । यह इन समय अवधियों और NREM नींद में एक मामूली कमी के दौरान जगा अवधी में वृद्धि से प्रतिबिंबित किया गया था । ये परिणाम प्रदर्शित करता है कि तीव्र kynurenine उन्नयन स्लीप-वेक गतिशीलता में गड़बड़ी का कारण बनता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक kynurenine और KYNA इंजेक्शन के लिए मानक घटता है । प्रत्येक मानक के 20 µ l को (क) kynurenine और (ख) KYNA के लिए मानक वक्र बनाने के लिए इंजेक्ट किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: kynurenine और KYNA के लिए प्रतिनिधि chromatograms । मानक उनके अवधारण समय की पुष्टि करने के लिए एक नमूना से पहले चला रहे थे । ये पैनल (क) सीरम kynurenine और (ख) ब्रेन KYNA के लिए प्रतिनिधि नमूने दिखाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक kynurenine चुनौती के बाद HPLC द्वारा सीरम और हिप्पोकैम्पस ऊतक का विश्लेषण. (A) Kynurenine (१०० मिलीग्राम/किग्रा) या खारा zeitgeber समय (ZT) 0 पर एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया गया । ऊतक या तो 2 या 4 एच के बाद इंजेक्शन एकत्र किए गए । निम्नलिखित पैनलों (ख) kynurenine-ऊंचा सीरम kynurenine और इंजेक्शन के बाद हिप्पोकैम्पस KYNAस्तर 2 एच करने के लिए प्रदर्शन दिखाने के लिए । P < 0.001 एक Bonferroni t-परीक्षण सुधार के बाद प्रसरण (ANOVA) के दो-तरफा विश्लेषण द्वारा महत्व को इंगित करता है । N = 4 – 5 प्रति समूह । सभी डेटा मतलब ± SEM रहे हैं । यह आंकड़ा Pocivavsek एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: निष्क्रिय परिहार प्रतिमान में हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्मृति पर एक kynurenine उंनयन का प्रभाव । (A) Kynurenine (१०० मिलीग्राम/kg) या खारा zeitgeber समय (ZT) 0 पर intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया गया । ZT 2 पर कार्य पर पशुओं को प्रशिक्षित किया गया । 24 ज प्रशिक्षण के बाद पशुओं की स्मृति गठन के लिए परीक्षण किया गया । (ख) kynurenine के लिए एक जोखिम प्रशिक्षण से पहले विलंबता कम करने के लिए परीक्षण के दिन aversive अंधेरे डिब्बे से बचने के लिए । * * p < 0.01, * * * p < 0.001 एक Bonferroni t-परीक्षण सुधार के बाद प्रसरण (ANOVA) के दो-तरफा विश्लेषण द्वारा महत्व इंगित करता है । N = 8 – 14 प्रति समूह । सभी डेटा मतलब ± SEM रहे हैं । यह आंकड़ा Pocivavsek एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सो-जागो वास्तुकला पर एक kynurenine उंनयन का प्रभाव । (क) खारा (दिन 1) और kynurenine (१०० मिलीग्राम/दिन 2) zeitgeber समय (ZT) 0 पर एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रशासित थे । बाद में 24 घंटे के लिए स्लीप-वेक व्यवहार रिकॉर्ड किया गया था । (ख) तेजी से नेत्र आंदोलन (शेष) नींद की अवधि कम हो गया था और जगा अवधि kynurenine इंजेक्शन के बाद पहले 2 एच में वृद्धि हुई थी । * P < 0.05 एक Bonferroni t-परीक्षण सुधार के बाद के प्रसरण (ANOVA) के दो-तरफा विश्लेषण द्वारा महत्व को इंगित करता है । N = 6-8 प्रति समूह । सभी डेटा मतलब ± SEM रहे हैं । यह आंकड़ा Pocivavsek एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मोबाइल चरण संरचना ५० मिमी सोडियम एसीटेट, पीएच ६.२
5% acetonitrile
मोबाइल चरण प्रवाह दर ०.५ मिलीलीटर/
पोस्ट-कॉलम derivatization रिएजेंट ५०० मिमी जस्ता एसीटेट
पद-स्तम्भ derivatization प्रवाह दर ०.१ मिलीलीटर/
स्तंभ प्रकार ReproSil-Pur C18
स्तंभ आयाम 4 x १५० mm2
डिटेक्टर तापमान ४.० º ग
Kynurenine तरंग दैर्ध्य उदा: ३६५, Em: ४८०
Kynurenine अवधारण समय ~ 6 मिनट
KYNA तरंग दैर्ध्य उदा: ३४४, Em: ३९८
KYNA अवधारण समय ~ 11 मिनट

तालिका 1: kynurenine मार्ग चयापचयों के एक HPLC निर्धारण के लिए पैरामीटर्स ।

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Discussion

एक परिधीय kynurenine प्रशासन के बाद मस्तिष्क में KYNA के एक विश्वसनीय आकलन के लिए, यह गठबंधन और जैव रासायनिक और कार्यात्मक प्रयोगों की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि नए उपयोगकर्ताओं प्लाज्मा kynurenine और चूहों के मस्तिष्क KYNA को मापने के लिए प्रभावी तरीके स्थापित करने के लिए परमिट पेश करते हैं । प्लाज्मा में kynurenine की माप सटीक इंजेक्शन की पुष्टि की और metabolite KYNA की माप मस्तिष्क में डी नोवो संश्लेषण की पुष्टि करता है. वहां वर्णित fluorometric HPLC विधि के कई फायदे हैं, शिबाता18से रूपांतरित, KYNA2 +की उपस्थिति में derivatize Zn के लिए ठीक अंतर्जात रेंज में मस्तिष्क में KYNA मात्रा nanomolar का पता लगाने की क्षमता भी शामिल है . इसके अलावा, विधि उत्तेजना और उत्सर्जन, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में fluorometric तरंग दैर्ध्य का समायोजन करके micromolar रेंज में प्लाज्मा में bioprecursor kynurenine का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है ।

इस तरह के उपचार और इच्छामृत्यु के बीच विशिष्ट समय के रूप में प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम, सही मस्तिष्क में KYNA गठन के समय पाठ्यक्रम का निर्धारण और डिजाइन और व्यवहार और नींद के विश्लेषण का मार्गदर्शन करने के लिए वर्णित हैं-जागो प्रबोधन उपाययोजना. हिप्पोकैम्पस-मध्यस्थता सीखने निष्क्रिय परिहार प्रतिमान और एक नींद जाग विश्लेषण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था ईईजी/ईएमजी डेटा की telemetric रिकॉर्डिंग के साथ आयोजित किया गया था । जैसा कि हम निर्धारित किया है कि मस्तिष्क KYNA स्तर उच्चतम 2 एच पोस्ट इंजेक्शन थे, हम व्यवहार प्रतिमान प्रशिक्षण सत्र के अनुसार समय पर, ताकि निष्क्रिय परिहार कार्य में अधिग्रहण हुआ जब KYNA का स्तर सबसे अधिक थे, ZT 2 पर । इसके अलावा, हम भी महत्वपूर्ण ZT 0 ZT 2 समय सीमा है जिसके दौरान KYNA स्तर मस्तिष्क में सबसे अधिक थे पर सो-जागो व्यवहार के विश्लेषण को ध्यान केंद्रित किया । एक साथ लिया, सावधानी से विचार प्रयोगात्मक डिजाइन हम एक साथ जैव रासायनिक और कार्यात्मक प्रयोगों से निष्कर्षों को पाटने के लिए अनुमति दी है, दोनों अनुभूति और सो-जागो व्यवहार11का एक मॉडुलन के रूप में KYNA का परिचय.

बताई गई प्रोटोकॉल में कई सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए । KYNA के अंतर्जात उत्पादन को उत्तेजित करने के लिए, प्रत्यक्ष bioprecursor kynurenine चूहों में परिधीय रूप से इंजेक्ट किया गया था. Kynurenine आसानी से रक्त मस्तिष्क बाधा पार और प्रेरित केपी चयापचय मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म में होता है2. हम वर्तमान में हिप्पोकैम्पस में astrocyte-व्युत्पन्न KYNA में तरक्की पर ध्यान देते हैं; हालांकि, इस बात पर गौर करना जरूरी है कि kynurenine के प्रणालीगत इंजेक्शन भी चयापचयों की neurotoxic शाखा की तरक्की करते हैं, जिसमें 3-hydroxykynurenine (3-एच) और quinolinic एसिड शामिल हैं । KYNA उन्नयन की वजह से उन लोगों की तुलना में 3-एच में उन्नयन के कारण प्रभाव को चिढ़ाने के लिए, पद्धति समायोजित किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क11 भर में केपी चयापचय में perfuse उन्नयन विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों है कि व्यवहार में परिवर्तन मध्यस्थता कर रहे हैं में एक सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

जब व्यवहार प्रयोग डिजाइन यहां वर्णित है, हम मौजूदा तरीकों के संबंध में निष्क्रिय परिहार प्रतिमान अनुकूलित, के रूप में विस्तार से वर्णित है, हिप्पोकैम्पस संलग्न प्रासंगिक स्मृति मध्यस्थता । स्मृति तीन प्रमुख उपप्रक्रियाओं के शामिल है: एंकोडिंग, समेकन, और पुनः प्राप्ति । जब नए एंकोडेड स्मृति लंबी अवधि के संग्रह19,20में एकीकृत है स्मृति समेकन प्रक्रियाओं के लिए इष्टतम स्थितियां स्लीप के दौरान हो । के रूप में कुतर में अध्ययन स्मृति समेकन के संकीर्ण समय खिड़कियों पर ध्यान केंद्रित किया है और पहचान की है कि स्मृति सबसे संवेदनशील प्रतीत होता है जब सोने के अधिग्रहण के बाद देरी है, हम इस संवेदनशील के दौरान मस्तिष्क में kynurenine और KYNA गठन तरक्की के लिए चुना समय विंडो, अधिग्रहण और समेकन को प्रभावित करने, इस लेख की परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए । हम नहीं, तथापि, वर्तमान में परीक्षण अगर स्मृति की बहाली kynurenine उंनयन द्वारा प्रभावित किया गया था, के रूप में पहले21दिखाया । यह भी एक कार्य करने के लिए कुतर में लगे मस्तिष्क क्षेत्रों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि इस अध्ययन के लिए, हम ज्यादातर में हिप्पोकैम्पस की भूमिका में रुचि रखने वाले थे अनुभूति, प्रोटोकॉल में संशोधन करने के लिए वैकल्पिक व्यवहार प्रतिमान है कि एक तीव्र kynurenine द्वारा प्रभावित किया जा दिखाया गया है में जानवरों का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हो सकता है चैलेंज, जैसे डर कंडीशनिंग और काम स्मृति कार्य2,7,8,9,10।

इसके अतिरिक्त, kynurenine के प्रणालीगत इंजेक्शन के एवज में मस्तिष्क KYNA तरक्की के लिए, वैकल्पिक रणनीतियों पर विचार के हित के एक क्षेत्र में KYNA के प्रत्यक्ष अर्क या औषधीय द्वारा synthesizing एंजाइम कैट द्वितीय के लक्षित निषेध शामिल उपकरण या आणविक दस्तक नीचे विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में दृष्टिकोण, यंत्रवत परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए. हालांकि इन दृष्टिकोण भी संभावित इनवेसिव प्रक्रियाओं है कि स्वतंत्र रूप से कार्यात्मक परिणाम मापा प्रभाव शुरू कर सकते हैं, यह इष्टतम नियंत्रण की स्थिति के साथ प्रयोग डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

अंत में, नींद रिकॉर्डिंग ईईजी/ईएमजी प्रोटोकॉल यहां वर्णित के बजाय सीमित telemetric जा रहा है का लाभ दिया है, बिजली के शोर, आंदोलन कलाकृतियों को नष्ट करने, और एक जानवर है कि सीमित केबल खींच लिया है में चोट के जोखिम । शारीरिक आकार और telemetric डिवाइस के हल्के वजन, और उसके स्थान के बजाय चूहे में intraperitoneally के बाद शल्य चिकित्सा वसूली का अनुकूलन करने के लिए, वायरलेस रिकॉर्डिंग है कि एक मुक्त करने के साथ प्राकृतिक सो-जागो व्यवहार पर कब्जा सक्षम बनाता है आंदोलन की सीमा । हालांकि, एक महत्वपूर्ण विचार telemetric प्रणाली का उपयोग करते समय एक साथ गुणकों चैनलों से रिकॉर्डिंग करने के लिए सीमित करने की क्षमता है । वर्तमान प्रतिमान जोड़े एक ईईजी चैनल और एक ईएमजी चैनल, और शेष, NREM, और जागो व्यवहार के स्कोरिंग के लिए अनुमति देता है ।

तरीकों का संयोजन वर्णित वर्तमान में व्यवहार और जैव रासायनिक परख में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है एक kynurenine उंनयन के कार्यात्मक परिणाम स्पष्ट । इन प्रोटोकॉल केपी, अनुभूति, और सो, एक पहले से बेरोज़गार गतिशील के बीच एक संबंध प्रदर्शित करता है । विस्तृत प्रयोगात्मक यहां प्रदान की विधियों का उपयोग पशुओं में kynurenine और KYNA तंत्रिका जीव विज्ञान के कार्यात्मक प्रभावों की वैज्ञानिक समझ में वृद्धि होगी । अंततः, इस क्षेत्र में काम जारी रखने के नए चिकित्सीय दृष्टिकोण के लिए नेतृत्व कर सकते है व्यक्तियों में परिणामों को कम combatting मनोरोग गड़बड़ी और नींद में व्यवधान ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वर्तमान अध्ययन के हिस्से में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01 NS102209) और क्लेयर ई. फोर्ब्स ट्रस्ट से एक दान द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wistar rats Charles River Laboratories adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) Dr. Maisch GmbH
EZ Clips Stoelting Co. 59022
Mounting materials screws PlasticsOne 00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures MedRep Express 699B CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures Ethicon J310H 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement Stoelting Co. 51458
Drill Bit Stoelting Co. 514551 0.45 mm
Name Company Catalog Number Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module Waters 176269503
2475 fluorescence detector Waters 186247500
post-column reagent manager Waters 725000556
Lenovo computer Waters 668000249
Empower software Waters 176706100
Name Company Catalog Number Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle MedAssociates ENV-018MD Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D)
Center channel modulator shuttle box chamber MedAssociates ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat MedAssociates ENV-010MB-GF
Auto guillotine door MedAssociates ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat MedAssociates ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel MedAssociates ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber MedAssociates ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package MedAssociates DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes MedAssociates ENV-253C
Infrared source and dectector array strips MedAssociates ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module MedAssociates ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module MedAssociates ENV-412
Dual A/B shock control module MedAssociates ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension MedAssociates SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F MedAssociates SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6 MedAssociates SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080D
PCI interface package MedAssociates DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package MedAssociates SOF-700RA-7
Name Company Catalog Number Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software Data Sciences International (DSI) PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface Data Sciences International (DSI) PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit Data Sciences International (DSI) 271-0112-013
Dell 19" computer monitor Data Sciences International (DSI) 271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x Data Sciences International (DSI) 272-6001-001
Cisco RV130 VPN router Data Sciences International (DSI) RV130
Matrix 2.0 Data Sciences International (DSI) 271-0119-001
Network switch Data Sciences International (DSI) SG200-08P
Neuroscore software Data Sciences International (DSI) 271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET Data Sciences International (DSI) 270-0134-001

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References

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Kynurenine और Kynurenic एसिड का एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी माप: अनुभूति और चूहों में सोने के लिए जैव रसायन से संबंधित
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Baratta, A. M., Viechweg, S. S., Mong, J. A., Pocivavsek, A. A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats. J. Vis. Exp. (138), e58129, doi:10.3791/58129 (2018).

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