Summary
우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
셀의 기본 spatiotemporal 조직의 여러 측면 반응 유포 형식 시스템에 의해 규율 됩니다. 이러한 시스템의 재구성 생체 외에서 가능 하지 않을 것 이라고 그들의 기본 메커니즘의 상세한 연구에 대 한 허용 vivo에서. 여기, 우리는 생체 외에서 의 대장균, 셀 중간에는 세포 분열 심장 MinCDE 시스템의 재구성에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 분석 결과 구성 요소만 자기 조직에 필요한 즉 막, 두 단백질 마음 및 광산 및 ATP의 형태로 에너지를 공급 하도록 설계 되었습니다. 우리는 그러므로 지원된 지질 bilayer 형성 되는 coverslip에 오픈 반응 챔버를 조작. 챔버의 오픈 디자인 지질 bilayer의 최적의 준비 및 대량 콘텐츠 제어 조작에 대 한 수 있습니다. 두 단백질, 마음 및 광산,으로 ATP, 다음 막 위에 대량 볼륨에 추가 됩니다. 영상은 디자인 지원 confocal, 넓은 필드와 비슷하게 TIRF 현미경으로 많은 광학 microscopies에 의해 가능 하다. 프로토콜의 변이에서 지질 bilayer는 셀 모양의 PDMS 마이크로 구조, 유리 대신에 패턴된 지원에 형성 된다. 이 구획의 가장자리에 대량 해결책을 낮추는 작은 구획에는 반응의 포함 하 고 vivo에서 진동 동작의 흉내 낸 수 있는 경계를 제공 합니다. 함께 찍은, 우리 설명 MinCDE 시스템 모두와 함께 공간 감 금 없이 다시 구성할 프로토콜 연구원은 정확 하 게 농도 범위 등 다른 요인의 추가 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면을 제어할 수 있도록 또는 단백질, 그리고 체계적으로 비교적 간단한 실험 설치 프로그램에서 시스템의 복잡성을 증가.
Introduction
Spatiotemporal 패턴 자연, 다세포과 세포 수준에, 통제 세포 분열1,2morphogenesis에서 복잡 한 작업을 모두 조절에 필수적입니다. 반응 유포 시스템 이러한 패턴을 수립에 중요 한 역할 하지만 아직도 잘 이해 된다. 반응 유포 시스템 그리고 최고의 특징이 생물학적 시스템의 대표적인 사례는 지금까지 대장균 MinCDE 시스템3,,45,6,7입니다. MinCDE 시스템 대장균 미래 사단 사이트로 셀의 가운데를 확인 하기 위해 장 대 셀에 셀 극에서 진동. 이 시스템은 ATPase 마음, 광산, 및 공간 반응 매트릭스8로 막 단백질을 활성화 ATPase 기반으로 합니다. MinC는 패턴 형성 메커니즘의 일부 이지만 실제 기능 에이전트: 주요 divisome 단백질 FtsZ5,6의 억제제. MinC 마음에 바인딩하고 따라서 다음과 같이 진동, 셀에서 최대한 이며 셀 중간에 최소한의 시간 평균 단백질 농도 기온 변화도 결과로 midcell9,10에서 유해를 FtsZ 허용 . MinCDE 시스템 위치를 수송 하는 단백질 복합물11 및 플라스 미드12 와 셀을 규제에 대 한 박테리아2, spatiotemporal 조직에 중요 워커 A ATPases의 가족의 일부입니다. 부문13 와 염색체 분리14. 따라서, MinCDE 반응 확산 시스템 뿐만 아니라 원형 반응-보급 시스템 나타내지만 또한 박테리아에 spatiotemporal 조직에 대 한 그것의 관련성 때문에 관심을 끌었다 있다.
MinCDE 시스템에는 vivo에서 의 상세한 기능 연구는 복잡 한, 단백질 및 유전자 삭제의 조작 일반적으로 세포 분열 결함 발생. 또한, 막 구성 또는 vivo에서 cytosol의 속성을 변경 하는 것은 매우 도전적인15,16. 시스템 및 요소에 영향을 미치는 변경 경우 세포 분열으로 같은 필수적인 기능에 방해 되는 셀의 복잡 한 환경에서 더욱 그렇게 해석 하는 하드 있다. 우리와 다른 그러므로 아닙니다 생체 외에서 재구성 접근, 시스템의 핵심 구성 요소에 감소: 마음, 에너지 원으로 ATP와 반응 매트릭스6,17, 로 지원된 지질 bilayer 내 18.이 상향식 접근 방식을 자세히 복잡 하지 않고 살아있는 세포의 자기 조직화의 메커니즘을 수 있습니다. 여행 표면 단백질 양식 파도6 와 다른 종류 패턴17,19 이러한 조건 하에서 파장으로는 비보에보다 큰 크기에 대 한 일반적으로 이기는 하지만. 개방 챔버를 사용 하 여 용이 하 게 정밀 하 게 제어할 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면: 단백질 농도6, 단백질 속성20, 막 구성10, 버퍼 구성, 및 ATP 농도 6, 뿐만 아니라 대리인21 와 다른 divisome 단백질22를 크롤 링 하는 등 다른 요인의 추가. 비교에서는, 흐름 셀18,,1923 에 MinCDE 시스템의 생체 외에서 재구성 프로브 흐름17,23, 단백질의 영향을 사용할 수 있습니다. 제한 조건19, 막 구성19 와 단백질 패턴에 풀 3D 감18 하지만 단백질/구성 요소 농도 및 순차적 구성 요소 또한 훨씬 더 복잡 한 컨트롤을 렌더링 합니다.
우리는 하나 어떻게 기하학적 경계 영향 패턴 형성21, 최근에 현상을 프로브 수 있습니다 평면 지질 bilayers의 지원 또한 모방이 오픈 챔버를 사용 하 여, 또한 조사 되어 vivo에서 박테리아를 사용 하 여 마이크로 구조7으로 성형. 우리 또한이 분석 결과 내에서 어떻게 정의 된 돌연변이 조사 시스템20의 영향을 패턴 형성 고용. 또한, 동일한 기본적인 분석 결과 형식 빛, 분석 결과에 아조 가교 된 광산 펩 티 드를 소개 하 고 TIRF 현미경24이미징 패턴 형성을 제어 하는 방법은 조사 하 고용 하고있다.
우리는, MinDE 패턴을 복제 하기 위해 형성 관찰 vivo에 는 체 외에서 시스템, 감 금 했다 키 발견. MinDE 극-극 진동 및 단백질 그라데이션 형성 의 재구성을 허용 지원된 지질 bilayer와 입은 MinDE에서 생체 외에서 (10 x 30 µ m)의 더 큰 파장을 조정 하는 크기와 막대 모양의 microcompartments를 사용 하 여 10,25. 이 분석 결과에 지원된 지질 bilayers는 위에 열려 있는 막대 모양 microcompartments의 몇 백 복제본을 포함 하는 꽃무늬 PDMS 기판에 입금 됩니다. 이것에 의해, 반응 챔버를 오픈에서 설정할 수 있습니다 그리고 이후에 버퍼 microcompartments, 그로 인하여 수감 작은 볼륨에 대 한 반응의 가장자리를 인하 됩니다. 이러한 구획 한쪽에 어 버퍼 인터페이스 있고 따라서 막 풀 3D 감 변하지 않습니다, 비록 단백질 역학 유사 진동10,25 vivo에서 . 풀 3D 감 금에 비해 매우 유사 하 게 보여 주는 결과18, 오픈 마이크로 구조 분석 결과 비교적 간단 하 고 쉽게 처리 하 고 또한 하지 전문된 마이크로 장비를 갖춘 실험실에 의해 수행할 수 있습니다 및 클린 룸 시설입니다.
여기, 우리 현재 MinCDE 패턴 형성에 지질 bilayers에서 지원 체 외에서 광학 현미경에 의해 그리고, 미성년자의 모든 구성 요소와 쉽게 액세스 제어 허용 하는 오픈 챔버를 사용 하 여 재구성 하는 실험 프로토콜 수정, 표면 조사 기법26에 대 한 적응도. 평면 지원된 지질 bilayers 옆 우리는 또한 단백질 감 수 어떻게 표시 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에 간단한 패턴된 지원된 지질 bilayers를 사용 하 여 얻을. 이 분석 실험, 비록 MinCDE 시스템에 최적화 된 옮겨질 수 있다 또한 FtsZ27 등 최소한의 걸 피28막과 유사한 방식으로 상호 작용 하는 다른 단백질 시스템.
Protocol
1. 단백질 생산
- 단백질 표정
- 대장균 BL21 변환 마음6, EGFP 마음29, mRuby3-마음24, 광산6 또는 MinC30의 표현에 대 한 각 플라스 미드와 (DE3) pLysS. 플라스 미드 맵, 추가 정보를 참조 하십시오.
- 각각 항생제 (예를 들어,100 µ g/mL 암 피 실린 또는 50 µ g/mL 대)를 사용 하 여 단일 식민지와 파운드 매체에 숙박 문화를 접종 하 고 동요 하는 동안 14-16 h 37 ° C에서 품 어.
- 야간 문화 (희석 1: 200)으로 각각 항생제를 포함 하는 TB 매체의 500 mL를 접종 하 고 180 rpm에서 흔들어 동안 37 ° C에서 문화를 품 어.
- 문화는 600에서 광학 밀도 도달 하면 0.5 m m IPTG을 추가 하 여 단백질 발현을 유도 0.5-0.7 nm. EGFP 마음 또는 mRuby3-마음, 16 ° C와 인큐베이터 셀 이동 14-16 h, 그리고 MinC, 마음 또는 내 세포 성장, 유도 후 37 ° C에서 3-4 h에 대 한 셀을 성장.
참고: 유도 MinC, 마음 또는 내 식 세포 분열 결함; overexpression 결과로 셀에 대 한 독성은 따라서, 그것은 중요 한 37 ° C에 외피 시간 4 h 미만으로 유지입니다. 더 많은 단백질이 필요한 경우 문화, 하지만 부 화 시간이 아니라의 양을 증가. - 각각 부 화 시간 10 분 동안 4000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확까지-80 ° C에서 셀 펠 릿 저장 후 더 사용 합니다.
- 단백질 정화
참고: 자동된 단백질 정화 시스템에 prepacked Ni NTA 열을 사용 하거나 중력 흐름 벤치 정화에 대 한 Ni NTA 비즈를 사용 하 여 단백질 정화 될 수 있습니다.- (50mm 나트륨 인산 염 pH 8.0, 500 mM NaCl, 이미 20 m m), prepacked Ni NTA 열 자동된 단백질 정화 시스템 사용 버퍼 a 1에 (50 m m 인산 나트륨 pH 8.0, 500 mM NaCl, 이미 10 m m), 버퍼 B1 정화 및 버퍼 C1 (50mm 나트륨 인산 염 산도 8.0, 500 m NaCl, 250 m m 이미 m). Ni NTA를 사용 하 여 중력 흐름 벤치 정화 구슬 버퍼 A2 (50 mM Tris HCl pH 8.0, 300 m m NaCl, 이미 10 m m)를 사용 하 여, B2 (50 mM Tris HCl pH 8.0, 300 m m NaCl, 이미 20 m m), 버퍼 및 버퍼 C2 (50 mM Tris HCl pH 8.0, 300 m m NaCl, 이미 250 m m). ß-mercaptoethanol 10mm 또는 0.4 m m TCEP (사용 하기 바로 전에 감소 시키는 대리인으로 tris(2-carboxyethyl)phosphine) 모든 버퍼를 보충.
- Resuspend 셀 A1 또는 A2 버퍼의 20-30 mL에 보충 EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물와 100 µ g/mL lysozyme, 250 ~ U/mL DNase 0.2 m m Mg2 +-ADP (Mg2 +-ADP만, 마음 또는 EGFP 마음 정화의 경우 100mm ADP에서에서 재고 100 mm MgCl 2 ph 조정 7.5).
- 팁 sonicator를 사용 하 여 세포를 lyse (30% 진폭, 2.5 분, 30 s 펄스, 30에서 s) 얼음 목욕에 있는 셀을 포함 하는 유리병을 유지 하면서.
- 25000 x g에서 45 분 및 4 ° c.에 대 한 lysate 셀 centrifuging 여 세포 파편을 제거
- Ni NTA 열 또는 Ni NTA 구슬에 상쾌한 품 어.
- Prepacked Ni NTA 열에 대 한 자동화 된 단백질 정화 시스템의 샘플 펌프를 사용 하 여 열에 샘플을 로드 합니다.
- 벤치탑 정화, 1 시간에 4 ° C에서 회전 통에 50 mL 반응 관에 Ni NTA 구슬과 샘플을 품 어. 후속 단계에 대 한 Ni NTA 구슬 25 mL 피 펫을 사용 하는 빈 열에 전송 합니다.
- 워시 버퍼 A1 또는 a 2의 적어도 5 열 량.
- 워시 버퍼 B1 또는 b 2의 적어도 5 열 량.
- 버퍼 C1 또는 c 2와 단백질 elute
- SDS 페이지 단백질 순도 평가 합니다.
- 선택 사항: 추가 정화 단백질 저장 버퍼 (50 mM HEPES/코 pH 7.2, 150 m KCl, 10% 글리세롤, 0.1 m EDTA, 0.4 m m, TCEP (0.2 m m Mg2 +-ADP 마음 경우) m m)에 equilibrated 젤 여과 열에 적용 하 여.
참고: 젤 여과 집계 단백질 분수 제거를 권장 합니다. - 없는 젤 여과, 고용 하는 경우 교환 Ni NTA 차입 버퍼 저장소 버퍼 (50 mM HEPES/코 pH 7.2, 150 m m KCl, 10% 글리세롤, 0.1 m m EDTA, 0.4 m m TCEP, 0.2 mM (밀리 그램-ADP 마음 경우))에 중력을 사용 하 여 염 열 흐름 ( 재료의 표참조).
- 충격-동결 단백질 aliquots에 액체 질소와-80 ° C에서 저장소에 추가 사용까지.
- Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 재고 농도 측정 하 고 ATPase 분석 결과20단백질 활동을 결정 합니다.
참고: 280에서 흡수를 사용 하 여 단백질 농도 평가 하지 않습니다 nm. 마음 정화 중 뉴클레오티드의 존재와 내에서 tryptophans의 부족 왜곡280 농도 측정. 브래드 포드 사용 또는 BCA 대신 단백질 농도 측정 하는 분석 실험.
- 단백질 라벨
참고: 내 유도 하는 작은 단백질에 형광 단백질의 융합 주요 변경 그것의 퍼지는 속성 및 기능; 따라서, 단백질 (위치 51 시스테인)의 화학 라벨 끝났습니다 선호 형광 성 단백질 융해.- DMSO (디 메 틸 sulfoxide)의 5-10 µ L에서 maleimide 염료 켤레의 0.125 mg를 녹이 고 흔들어 0.5 mL에 내 pH 7.2, 스토리지 버퍼에 aliquot 위에 설명된대로 준비 아래에 추가.
- 4 ° C에서 하룻밤에 2 h 또는 2 h RT 부드러운 떨고 또는 교 반에 품 어.
- 별도 염료 그리고 단백질 열 스토리지 버퍼 (50 mM HEPES/코 pH 7.2, 150 m m KCl, 10% 글리세롤, 0.1 m m EDTA, 0.4 m m TCEP) equilibrated 담 중력 흐름을 사용 하 여.
- 어떤 첨부 되지 않은 염료를 더 제거 하려면 저장소 버퍼의 초과 대 한 단백질 dialyze.
- 각 염료에 대 한 최대에 멸종을 측정 하 여 성공적인 라벨을 확인 하 고 예상된 라벨 효율 계산. 라벨의 정도 추정에 자세한 프로토콜에 대 한 염료 제조 업체의 지침을 참조 하십시오. SDS-PAGE로 분석 하 고 결정 레이블 성공과 샘플 동질성에 대 한 더 유용한 정보에 대 한 총 질량으로 질량 분석.
2. 작은 Unilamellar 소포 (SUV) 준비
- Multilamellar 소포의 세대
- 원하는 혼합물 및 최종 SUV 볼륨에 대 한 클로 프롬에 lipid(s)의 양을 계산 합니다. 농도가 4 mg/mL 지질 분 버퍼 (25mm Tris HCl pH 7.5, 150 m m KCl, 5 mM MgCl2)에 해야 합니다. 표준 분 분석 결과 대 한 7:3 DOPC:DOPG (mol %)의 혼합 것이 좋습니다. E. 콜라이 극 지 지질을 사용 하 여 추출 하는 경우 SLB 버퍼 (25mm Tris HCl pH 7.5, 150 m m KCl)을 사용 하 여 모든 준비 단계.
참고: 그것은이 혼합물을 가진 동질적인 SLBs의 생성은 훨씬 더 도전 대장균 극 지 지질 추출 물을 사용 하 여 처음 사용자를 위한 권장 하지 않습니다. - 유리 팁 긍정적인 변위 피 펫을 사용 하 여, 1.5 mL 유리 유리병에 클로 프롬에 지질 혼합.
- 유리병을 천천히 선회 하면서 약간의 질소 스트림 아래 지질을 건조. 10 ~ 20 분에 대 한 강한 질소 스트림 아래 지질을 놓습니다. 진공 desiccator에 말린된 지질 필름을 포함 하는 유리병 놓고 1 시간 이상에 대 한 진공을 적용 합니다.
- 혼합물이 균질로 불투명 때까지 실 온에서 vortexing에 의해 분 버퍼에 지질을 rehydrate.
참고: multilamellar 소포에서 작은 unilamellar vesicles의 생성, 지질 수 중 돌출 될 2.2에 설명 된 대로. 또는 sonicated 2.3에 설명 된 대로. 일반적으로 압출 지원된 지질 bilayers의 대형으로 도울 수 있는 더 좁은 크기 분포를 생성 합니다.
- 원하는 혼합물 및 최종 SUV 볼륨에 대 한 클로 프롬에 lipid(s)의 양을 계산 합니다. 농도가 4 mg/mL 지질 분 버퍼 (25mm Tris HCl pH 7.5, 150 m m KCl, 5 mM MgCl2)에 해야 합니다. 표준 분 분석 결과 대 한 7:3 DOPC:DOPG (mol %)의 혼합 것이 좋습니다. E. 콜라이 극 지 지질을 사용 하 여 추출 하는 경우 SLB 버퍼 (25mm Tris HCl pH 7.5, 150 m m KCl)을 사용 하 여 모든 준비 단계.
- 밀어 남에 의해 SUV 준비
- 추가 7 ~ 10 사이클에 대 한 동결 해빙 하 여 지질을 solubilize을 지질 집계 및 multilamellar 구조를 끊고.
- 뜨거운 접시에 99 ° C에 70 ° C에서 물 비 커 및 액체 질소 용기를 준비 합니다.
- 잡고 유리병 액체 질소에 대형 핀셋으로 질소 중지 끓는 때까지. 다음 솔루션은 완전히 해 동 때까지 뜨거운 물에 유리병을 전송 합니다. 지질 혼합 혼합물에 따라 눈에 분명 나타날 때까지이 단계를 반복 합니다.
- 지질 압출 기를 조립 하 고 미리 씻어 분 버퍼 시스템. 35 사이의 고 41 번 50 nm 기 공 크기의 세포 막을 통해 지질 혼합물을 압출 성형. 결코 멤브레인을 통과 하는 집계를 피하기 위해 패스의 홀수에 있는지 확인 합니다.
- 추가 7 ~ 10 사이클에 대 한 동결 해빙 하 여 지질을 solubilize을 지질 집계 및 multilamellar 구조를 끊고.
- SUV 준비 쥡니다
- 더 나은 버퍼에서 지질 분해, 37 ° C와 소용돌이를 1 분간 20 분 마다 설정 열 블록에 솔루션을 포함 하는 유리 유리병을 넣어. 약 1 시간에 대 한 총에서 품 어.
- 필요한 높이에서 클램프 스탠드에 유리병을 연결 하 여 (에이 작품에는 1.91 L, 80 W) sonicator 목욕에서 유리병의 바닥을 담가.
- 유리병을 둘러싼 솔루션은 철저 하 게는 펄스에 의해 동요 sonicator 욕조에 물 높이 설정 하 고 약 20 분 동안 지질 혼합물을 sonicate. 성공적인 쥡니다 지질의 선명도 평가 하 여 확인 합니다.
- Suv는 1 주까지 4 ° C에서 저장 또는 작은 aliquots (~ 20 µ L)에-20 ° C에서 냉동 고 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다. 튜브 또는 실내 온도에 튜브 thaw 그리고 지질 bilayers (SLBs) 지원의 준비에 대 한 Suv를 사용 하기 전에 솔루션은 분명 때까지 2.2.3 또는 5.3에서 설명 된 대로 다시 sonicate. 제발는 Suv의 좁은 크기 분포 압출 하 여 얻은 후 고정 및 후속 녹고 쥡니다 손실 됩니다.
3. 청소 유리 Coverslips
참고: 청소 및 hydrophilization 유리 coverslips의 균질 성 및 액체 지원된 지질 bilayers에 대 한 중요 한 요소입니다. 유리 coverslips 황산 7: 2의 비율에서 50%의 과산화 수소 (3.1), 또는 플라즈마 클리너 (3.2)에서 산소 플라즈마로 만든 피 솔루션을 사용 하 여 정리할 수 있습니다. 두 방법 모두 비슷한 결과 얻을.
- 피 라 coverslips의 청소
- 피 솔루션 적용
- 거꾸로 유리 페 트리 접시 또는 다른 비활성 표면에 유리 coverslips를 배포 합니다. 유리 피 펫과 각 coverslip의 센터에 집중된 한 황산 (98%)의 7 방울을 추가 합니다.
주의: 황산은 강하게 산 성 및 부식. 연기 찬에만 적절 한 보호 장비와 함께 작동 합니다. - 산 성 방울의 중간 50%의 과산화 수소의 2 방울을 추가 합니다.
주의: 과산화 수소는 눈과 피부에 부식성입니다. - 커버는 반응 하 고 적어도 45 분 동안 품 어.
참고: 여기에 최대 대기 시간 실험의 결과 대 한 중요 하지 않습니다 그리고 몇 일까지 연장 될 수 있습니다.
- 거꾸로 유리 페 트리 접시 또는 다른 비활성 표면에 유리 coverslips를 배포 합니다. 유리 피 펫과 각 coverslip의 센터에 집중된 한 황산 (98%)의 7 방울을 추가 합니다.
- 워시 피 coverslips 청소.
- 개별적으로 족집게를 사용 하 여 coverslips를 선택 하 고 산 초순 물으로 씻어. 비-스틱 홀더 또는 유사한 교통 장치 세척된 coverslips를 놓습니다.
- 각 coverslip 초순으로 광범위 하 게 헹 구 고 가압된 가스 (질소, 공기 오일 프리 하는 경우에)를 가진 표면 건조. 영구 마커는 coverslip의 청소 측면을 표시 합니다.
- 피 솔루션 적용
- Coverslips의 플라즈마 청소
- Coverslips를 초과 에탄올 및 초과 초순 이후에 헹 구 십시오. 가압 가스 coverslips를 건조. 4에 설명 된 대로 챔버를 조립.
- 4에 설명 된 대로 챔버 조립 후 연결 된 챔버와 coverslips 고 청소기 공정 가스로 산소 플라즈마에 장소. 깨끗 한 플라즈마와 coverslips (이 작품 30% 전력 1 분 동안 0.3 mbar 산소 압력 사용 되었다). 바로 전에 SLB 대형 플라즈마 청소의 hydrophilizing 효과로 5에 설명 된 대로 닳아 시간이 지남에 청소 할.
참고: 타이밍 및 플라즈마 청소의 힘 최적화 되어야 합니다 약간 너무 붙일 레이블된 막를 사용 하 여 또는 과도 한 플라즈마 청소 모두 이어질 수 움직이지 막 또는 막 구멍.
4. 챔버 어셈블리
- 날카로운가 위, 차단 하 고 뚜껑과 0.5 mL 반응 관의 원뿔 부분을 삭제 합니다. UV 접착제 튜브의 위쪽 테두리를 적용 하 고 피 펫 팁을 사용 하 여 균등 하 게 배포.
- 거꾸로 이전 청소 coverslip 튜브를 붙입니다. 피 라 청소의 경우 유리의 청소 측을 접착제에 있는지 확인 합니다. 360 nm 램프 또는 LED 5 ~ 15 분에 대 한 아래 여러 챔버를 배치 하 여 UV 접착제를 치료.
5. 지질 Bilayer (SLB) 형성 지원
- 미리 열 블록 37 ° C에가 열 하 고 품 어 분 또는 SLB 버퍼, 챔버 당 1 튜브 2 mL 반응 관.
- 어떤 먼지 또는 UV 경화 및 어셈블리 동안 정착 할 수 있는 다른 입자를 제거 하는 조립 및 치료 실에는 타격 질소 플라즈마 청소 하지 피 솔루션 (3.1) coverslips를 청소 하는 경우 3.2에 설명 된 대로. 열 블록에 챔버를 놓습니다.
- 명확한 지질 (4 mg/mL)에서 약 20 µ L 수 분 버퍼 또는 대장균 극 지 지질 추출, 작업 농도 0.53 mg/mL의 저조한 경우 SLB 버퍼의 130 µ L로 희석. 경우에 지질, 냉동 버퍼를 추가 하기 전에 목욕 sonicator에 튜브를 눌러 먼저 sonicate 다음 다시 버퍼 sonicate.
- 각 약 실에 지질 혼합물의 75 µ L을 추가 하 고 3 분 타이머를 설정 (DOPC/DOPG 혼합물;에 대 한 더 이상 보육 할 수 있습니다 다른 지질 혼합물). 대장균 극 지 지질 추출 시 CaCl2 100 m m 재고에서 3 m m의 최종 농도에 챔버로 플라스틱. 인큐베이션 기간 동안은 소포 친수성 유리 표면에 파열 하 고 일관 된 SLB를 융합.
- 60 초 후, 각 약 실에 분 버퍼의 150 µ L를 추가 합니다.
- 세척 약 실: 신중 하 게를 pipetting 아래로 몇 번 제거 및 또 다른 200 µ L를 추가 다른 120 초 (총 3 분) 분 또는 SLB 버퍼의 200 µ L을 추가 하 여 각 챔버를 세척 후.
- 각 약 실 한 번 씻어 되었습니다 후 버퍼의 2 개 mL 사용 됩니다 때까지 첫 번째 챔버를 철저 하 게 세척을 진행 합니다. SLBs의 세척 챔버에 움직임의 범위를 완벽 하 게 하 여 올바른 세척 강도 찾을 몇 가지 경험을 해야 합니다.
참고: 절대는 SLB의 건조를 피하기 위해 약 실에서 모든 액체를 제거 합니다.
참고: 세척, 위에 막 속성에 따라 달라 집니다 여러 추가 요소: 유형의 지질 및 지질 혼합물, Suv에 대 한 준비 방법에 있는 그들의 상대 농도 표면 처리 및 지원의 사전 청소.
- 각 약 실 한 번 씻어 되었습니다 후 버퍼의 2 개 mL 사용 됩니다 때까지 첫 번째 챔버를 철저 하 게 세척을 진행 합니다. SLBs의 세척 챔버에 움직임의 범위를 완벽 하 게 하 여 올바른 세척 강도 찾을 몇 가지 경험을 해야 합니다.
6. 자기 조직 분석 결과
- 단백질과 ATP 솔루션의 금액 마이너스 200 µ L 분 버퍼를 챔버에 버퍼 볼륨 후 내 마음, 마음, 표시를 추가 하 고, 원하는 경우, MinC. 부드럽게 pipetting으로 구성 요소를 믹스. 예를 들어 농도 1 µ M 마음 (30% 첨가 EGFP-마음), 1 µ M 광산 (화학적 분류 내 10% 첨가) 0.05 µ m MinC, 하지만 패턴 형성 농도6,10,,2030 의 범위 .
- MinDE의 자기 조직화를 시작 (100 m m 100 mM MgCl2, pH 7.5에에서 ATP 재고)에서 2.5 m m ATP를 추가 합니다.
참고: 구성 요소 추가 (, 내 마음과 ATP)의 순서 변화 될 수 있습니다 및 최종 패턴 결과4에 영향을 주지 않습니다. - MinDE 형광 현미경에 자기 조직 관찰 ( 재료의 표참조). MinDE 자기 조직 또한 TIRF 현미경을 사용 하 여 관찰할 수 있습니다. 이미징 eGFP 마음, 488 nm의 아르곤 레이저 또는 유사한 다이오드 레이저 (예를 들어, 490 nm)를 사용 합니다. 이미징 mRuby3-마음, 561 nm 다이오드 레이저를 사용 하는 최상 이다.
참고: 높은 수준의 방지 우리와 더 긴 시간 동안 여기의17 는 돌이킬 수 없는 단백질 중 합 막에 이어지는 MinDE 시스템에서 phototoxicity를 관찰.
7. PDMS 마이크로 구조
참고: PDMS (입니다)는 마이크로 구조와 미세 소자의 생산을 위해 사용 될 수 있는 중합체 이다. 꽃무늬 실리콘 웨이퍼는 금형 주조 PDMS 구조에 대 한 역할을 합니다. PDMS 구조 SLB 형성에 대 한 지원 그리고 시험의 설치.
- 하나 실리콘 웨이퍼 microcompartments 포토 리소 그래피를 사용 하 여 직접 생산 (자세한 프로토콜31 이나32비디오 프로토콜 대 한 시설을 이용하실 수 외. Zieske 및 Schwille 참조) 하거나 당신의 원하는 실리콘 웨이퍼 파운드리에서 주문 . 여기에 사용 되는 웨이퍼의 패턴에 대 한 추가 정보를 참조 하십시오.
- PDMS 마이크로 구조에서 꽃무늬 실리콘 웨이퍼의 생산입니다.
- 플라스틱 컵을 사용 하 여 10 g PDMS 기지 및 PDMS crosslinker의 1 g의 무게. 어느 혼합 장치를 혼합 하 여 사용 혼합 및 PDMS 혼합물을 드 또는 수동으로 PDMS 다음 진공에서 드.
- 피 펫 팁을 사용 하 여 실리콘 웨이퍼에 직접 구조에 PDMS의 작은 금액을 놓습니다.
참고: 수 실리콘 웨이퍼를 스크래치 하지 않도록 주의 하십시오. - 즉시 #1 coverslip PDMS 드롭에 배치 하 고 부드럽게 눌러 실리콘 웨이퍼에 coverslip 깨끗 한 피 펫 팁의 위쪽 끝. PDMS는 coverslip 및 실리콘 웨이퍼 사이 얇게 확산 한다.
- 오븐에는 coverslips와 웨이퍼를 배치 하 고는 PDMS 3-4 시간에 대 한 치료 또는 75 ° c.에서 하룻밤 웨이퍼는 오븐에서 제거 하 고 실내 온도 아래로 멋진 보자. 면도날으로 조심 스럽게 SI 웨이퍼에서 연결 된 PDMS와 coverslip 제거.
참고: 실리콘 웨이퍼 더러운 또는 손상 되지 않도록 하려면 항상 PDMS와는 coverslip 마이크로 구조 커버. 그러나, PDMS 연령대, 결과 마이크로 구조에 균열에 따라서 사용 하지 마십시오 2 ~ 3 주 이상 된 PDMS 구조.
8입니다. 자기 조직 PDMS 마이크로 구조
- 챔버로 연결할 PDMS 마이크로 구조와 사용 coverslips 설명 미만 4.
- 깨끗 하 고 청소기 3.2.2 아래 설명 된 대로 산소 플라즈마에서 표면 hydrophilize. 할 하지 피 깨끗 한 PDMS 기판.
- 6에 설명 된 대로 MinDE 자기 조직 분석 결과 설치.
- 분석 결과 설정한 후 일반적인 MinDE 패턴 형성 및 형광 현미경에 제대로 형성 된 마이크로 구조를 확인 합니다.
- 일반 MinDE 패턴 형성 (10-30 분) 때 부드럽게 구성 요소를 혼합 한 다음 pipetting으로 버퍼 단계적으로 제거를 두 번 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 100 µ L 피 펫을 사용 하 여 버퍼의 큰 대량을 제거 하 고 나머지 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 제거.
참고:이 단계는 연습을 해야 합니다 합니다. 는 마이크로 구조를 건조 것입니다 너무 많은 버퍼 반출 하거나 프로세스 시간이 너무 오래 걸립니다, 만약 너무 약간은, 단백질, 마이크로 구조에 국한 되지 것입니다 하지만 여행 하는 표면 파를 계속. - 즉시 챔버는 마이크로 구조에서 잔여 버퍼의 건조를 피하기 위해 뚜껑을 닫습니다.
- 수 있도록 더 긴 영상 시간, moistened 조각의 챔버 내부에 스폰지를 연결 하 고 뚜껑을 닫습니다. 스폰지는 coverslip의 표면에 연결 하지 못한 다는 것을 확인 하십시오.
- 전에 버퍼 마이크로 구조 MinDE 패턴 형성 위에 표면에 중단 했다 그래야, 인하 했다 표면에 마이크로 구조 검사의 이미지입니다. MinDE 진동 마이크로 구조에서 이미지. 마이크로 구조 밖으로 건조 하지 또는 이미징 동안 밖으로 건조 됩니다 확인 하십시오.
참고: PDMS 형태로 균열으로 각 사용 후, microcompartments와 coverslips를 삭제.
9입니다. MinDE 패턴 형성의 분석
- 파장, 파 속도 및 평면 지원된 지질 bilayers에 MinDE 자기 조직화의 웨이브 프로필 계량. 피지 패키지 플러그인의 표준 세트와 함께 기본 분석33충분 하다.
- Kymographs 및 시간 평균 단백질 농도 프로 파일 microcompartments에 극-극 진동 분석. 기본 kymographs 다시 피지에 선 선택에 따라 시계열 조각화 얻어질 수 있다.
Representative Results
단백질 정화 우리의 프로토콜에 따라 적절 한 순도의 분 단백질 항복 한다. 참고로, 그림 1 붙일 마음, 광산, 그리고 MinC 이라는 마음의 SDS 페이지 이미지를 제공 합니다. 꽃무늬 비 지원된 지질 bilayers에 MinDE 자기 조직 분석 결과 수행 하는 절차의 각 단계는 그림 2에 설명 되어 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 표면 파를 여행 하는 일반 MinDE 챔버 (그림 3)에 걸쳐 관찰할 수 있습니다. 파장은 챔버 내에서 약간 다를 수 있습니다 하지만 일반적 패턴 유사. 챔버의 가장자리 형태 UV 접착제에는 유리에 보다 다른 특성을가지고 것 막 표면 ( 그림 3C참조)으로 양적 비교를 위해 사용할 수 없습니다. (그림 3B) 전파 방향에 따라 강도 그려서 여행 표면 파를 분석할 수 있습니다. 마음 형광 파의 앞 가장자리에서 오히려 빨리 정점 다음 후행 가장자리에서 급격히 감소, 동안 광산 형광 마음 물결의 시작부터 거의 선형으로 증가 하 고 후행 가장자리에 마음 후 최대에 도달 어디 그것 6현저 하 게 떨어져 떨어진다.
단백질 품질 옆 지원된 지질 bilayers의 품질이 MinCDE의 일반 자기 조직에 대 한 가장 중요 합니다. 한 손으로 막 너무 지나치게 씻어 또는 기본 표면 청소 되었고 따라서 너무 강하게 충전, 구멍 형성할 수 있습니다 멤브레인 (그림 6A, 상단). 다른 한편으로 막 제대로 세척 되지 또는 기본 표면 청소/hydrophilized 하지 않습니다, 경우 소포 막에 붙어 것입니다 또는 막 유동성 위험 해질 것 이다 (그림 6A, 하단). 비록 하지으로 명백한 레이블이 지질 통해 직접 막 관찰 하는 경우 이러한 문제 수 또한 검출 될 마음 형광 신호에서 패턴은 일반 고는 맥시 마에 형광 균일 하지만 "구멍"를 포함 하거나 그림 6A의 중간 패널에 표시 된 밝은 명소.
막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에서 MinDE 자기 조직에 대 한 절차는 그림 4에 요약 됩니다. 몇 가지 프로토콜 단계 필요가 없습니다 반복 될 것으로 단백질과 지질을 다시 사용할 수 있습니다. 처럼 비 패턴이 기판에 기판 청소 (플라즈마-청소)에 의해 hydrophilized, 지원된 지질 bilayer는 PDMS에 형성 되 고 자기 조직 분석 결과 200 µ L의 볼륨에 설정 되어. 적절 한 막 형성 하고있다 MinDE 자체 막에 구성 확인에 실은 몇 군데. 적절 한 막 형성 되었습니다, MinDE 양식 일반 개별 마이크로 구조 사이 PDMS의 표면에 표면 파를 여행 하 고 또한 자체 구성 마이크로 구조는의 밑에 파도 자유롭게 할 수 있는 전체를 통해 이동 막으로 덮인 표면 (그림 5A). 버퍼 제거 후, 구획 사이 표면 해야 보여주지 전파 MinDE 패턴 (그림 5B), 그것은 완전히 건조 되어야 합니다. MinDE 패턴은 여전히 이동, 더 많은 버퍼를 제거 해야 합니다. 막 입은 PDMS와 상위 인터페이스 (그림 5C), 있는 그들은 자기 조직에 공기 단백질은 이제 막대 모양 microcompartments에 국한 됩니다. 이러한 조건 하에서 두 가지 단백질 그림 5D와 같이 극-극 진동 수행할 수 있습니다. 마음과 나의 일부분은 항상 막 도약, 또한 버퍼 제거 하는 동안 버퍼 제거 후 농도 없습니다 입력 농도 비교. 이 효과 농도 또한 다 같은 coverslip에 개별 마이크로 구조 사이 그들은 버퍼 제거 하기 전에 패턴의 위치에 따라. 실리콘 웨이퍼 생산 또는 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 조형 분석 (그림 6B)에 대 한 사용할 수 없는 불완전 한 마이크로 구조에서 발생할 수 있습니다. 또한, 버퍼 때문 제거 마이크로 구조 그리고 과정에서 건조 수 있습니다 따라서, 추가 분석 (그림 6B)에서 제외 해야 합니다. 결과적으로 한 챔버에 마이크로 구조의 일부 분 일 뿐인 원하는 극-극 진동 보여줍니다. 단백질은 마이크로 구조 역학을 분석 하는 kymograph는 전체 구조 (그림 5E) 선택 여 얻어질 수 있다. 때 MinCDE 극-극에서 흔들 리 다, MinC와 마음 구획 (그림 5F) 중간 구획에서 최대 농도와 최소 농도 시간 평균 농도 그라데이션 표시 됩니다.
그림 1: 단백질 담긴의 최종 제품을 보여주는 SDS 페이지. 그의 마음 (33.3 kDa), 그의 eGFP 마음 (60.1 kDa), 그의 mRuby3 마음 (59.9 kDa), 그의 광산 (13.9 kDa)와 그의 MinC (28.3 kDa) 순서로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 개별 단계와 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers (1-6 단계)에 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 점선된 상자 청소를 위해 사용할 수 있습니다 이러한 두 가지 옵션 중 하나를 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: confocal 현미경 검사 법에 의해 MinDE 분석 결과의 이미징. A) 일반 분 나선형, 어떤 파 전파 속도, 강도 플롯 및 속도 측정을 얻을 수 있습니다. 사용 농도: 0.6 µ M (30 %eGFP-마음), 마음이 1.8 µ M 그의-광산 (30% 그의-광산-Alexa647) B) 지역에 대 한 예제에서는 정규화 된 강도 음모 a에서 표시 C) 전체 시험 챔버의 개요 (눈금 막대: 1mm로 동일한 단백질 농도 위). 뿐만 아니라 대상 패턴을 관찰할 수 있다 어느 방향으로 돌고 나선. 확대 지역 웨이브 패턴 UV 접착제에 다 하는 방법을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 개별 단계와 막대 모양의 마이크로 구조 (단계 1-5, 7, 8)에서 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 회색 상자 단계 제품을 다시 사용할 수 있는 프로토콜에서 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers에 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: MinDE에 대 한 결과 대표적인 패턴 막대 모양의 PDMS microcompartments에 형성. A) MinDE 표면 파도 여행 형성 PDMS의 표면에 자체 구성 (1 µ M 마음 (30 %EGFP-마음), 2 µ M 내와 2.5 m m ATP). B) 단백질 자체 조직에서 microcompartments 사이의 평면 표면에 중지 후 버퍼는 마이크로 구조의 높이를 낮 췄 다. C) 1 개의 막대 모양 microcompartment의 도식. D) MinDE 극-극 진동 버퍼 제거 후의 대표 이미지. E) D에 표시 된 강조 표시 된 줄을 따라 진동의 Kymograph). F) 이미지와 프로필 D에 표시 된 시계열의 평균 형광 강도의) 명확 하 게 보여주는 microcompartment 기둥에 최대한 고 구획 중에서 최소한의 단백질 그라데이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 부정적인 실험 결과의 예. A) 차선 소포 준비 및 지질 구성 소포 튀어나와 이어질 동안 지나치게 씻어 막 구멍, 축적. 두 센터 패널 모두 문제 하 고 어떻게 그들이 분 진동 관찰의 조합을 표시 합니다. 막 0.05%로 표시 했다 Atto655-마약. (바 규모: 50 µ m) B) 상단 패널: 밖으로 건조 microcompartments 너무 많은 버퍼 제거 하거나 버퍼 시간 동안 증발 하는 때 발생할 수 있습니다. 하단 패널: 불완전 한 구획 웨이퍼 생산 또는 PDMS 성형 동안 형성 될 수 있다. (바 규모: 30 µ m) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 1: 그의 마음에 대 한 플라스 미드 맵입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 2: 그의 EGFP 마음에 플라스 미드 맵입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 3: 그의 mRuby3 마음에 플라스 미드 맵입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 4: 그의 광산에 대 한 플라스 미드 맵입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 5: 그의 MinC에 플라스 미드 맵입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 6: 막대 모양 microcompartments의 실리콘 웨이퍼에 대 한 CAD 파일입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
우리는 설명 하는 프로토콜 평면에 MinCDE 자기 조직화의 생체 외에서 재구성 지원 지질 bilayers 및 지질 bilayer 적용 3 차원 구조, 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조의 예를 사용 하 여. 이러한 분석에서 중요 한 데이터를 얻기 위해 제어에 가장 중요 한 요소는 단백질 및 막 품질.
단백질, 단백질 품질을 보장 하기 위해 질량 SDS 페이지와 질량 분석을 사용 하 여 확인 한다. 또한, 그것은 단백질은 가용성과 하지 집계 분석 젤 여과 또는 동적 산란을 사용 하 여 확인 되어야 한다. 젤 여과 단백질의 모든 집계 분수를 제거 하려면 사용할 수 있습니다. 주의 깊은 pH 조정 및 추가 된 뉴클레오티드의 품질은 매우 중요, 단백질 비 조정 또는 부분적으로 저하 된 뉴클레오티드의 추가 주식 또는 자체 조직 분석 실험 단백질 활동, 따라서 폐지를 제거 하기에 충분 자기 조직입니다.
단백질 품질, 옆 막 품질이 가장 중요 한, 그리고 부적 절 한 막 형성은 가장 종종 결함이 자기 조직과 artefactual 표면 구조의 기원에 대 한 원인.
처음으로 프로토콜을 수행할 때 낮은 어 금 니 비율에서 Atto-655-마약 등 DiI 레이블이 지질 (0.05%)를 포함 하 여 지원된 지질 bilayers를 도움이 됩니다. 따라서 속성 및 막의 품질 수 판단 직접. FRAP를 사용 하 여 막의 유동성 평가 될 수 있다. 서 있을 것입니다 중 하나 너무 많은 소포, 아니 유체 막 또는 아무 막, 떨어져 세척 되는 경우 또한, 하나 직접는 SLB의 세척의 품질을 평가할 수 있습니다. 오픈 챔버 접근 방식은 엄격 하 게, 막 씻어 수 그리고 그러므로 또한 소포는 SLB의 표면에 고정을 제거 하. SUV 크기와 크기 분포를 사용 하 여 도움이 될 수는 청소와 화란 지원 표면 및 올바른 크기의대 수의 유체 및 균질 성 지원된 지질 bilayers는 얻기 위해 가장 중요 한 요인 동적 빛 비 산. 좁은 크기 분포에 대 한 그들을 sonicating 보다는 소포를 압출 하는 것이 좋습니다. 다른 방법 청소 coverslips, 강한 기초, 기본 세제, 또는 coverslips를 사용 하 여 직접 물으로 rinsing 후 치료 예를 들어, 응용 프로그램 및 지질 혼합물에 따라 좋은 결과 얻을 수 있습니다.
여기, 오픈 실에서 평면 지원된 지질 bilayers에 생체 외에서 재구성에 제시 된 프로토콜의 첫 번째 절반 표면 TIRF 현미경30, FRAP 같은 광학 microscopies 위한 렌더링의 이점이 있다 분석6,34, 원자 힘 현미경 검사 법26같은 표면 감지기 기술을 추적 단일 입자. 큰 균질 지역 정의 된 농도에서 더 나은 통계 수 있습니다. 또한 오픈 챔버 접근 단백질 농도 및 구성 요소 추가, 따라서 적정 단일 챔버20에 단백질 농도를 허용에 대 한 신속 하 고 간단한 추가 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 분석 결과 또한 FtsZ22,35, ZipA22 또는 공상 단백질 FtsZ YFP MTS10,35같은 다른 세균성 divisome 구성 요소를 추가 하 여 확장할 수 있습니다.
다른 그룹 분 시스템에는 생체 외에서오픈 챔버17,,1819대신 사용 흐름-셀 재구성에 유사한 접근 방식을 갔다. 흐름 세포 특정 이점이 있다, 특히 때 완전히 동봉 된 3D 환경 필요한18흐름17,,1923 의 영향 인지 MinCDE 패턴에 막 구성23 조사, 또는 단백질 패턴 제한 조건19단백질에서 관찰 될 경우. 그럼에도 불구 하 고, 분자 농도의 로컬 제어는 더 어렵습니다. 막 단백질 구성 요소, 특히 마음에 의하여 강하게 바인딩할 그들은 먼저18,19발생. 우리의 경험에서는, 단백질은 자주 튜브, 후미, 주사기 및 다른 미세 부품 비 특정 바인딩 전시. 따라서, 지방 단백질 농도 다 입력된 농도18 를 또한19다른 사람에 의해 관찰로 입구와 출구 사이 막에 다른 단백질 패턴의 다양 한 결과 흐름 셀의 길이에 따라 달라.
프로토콜의 절반 여기, 막대 모양의 마이크로 구조 다시 지질 적용 패턴된 지원에 오픈 챔버 방식을 사용 하 여에서 생체 외에서 재구성에 제시 된 두 번째 bilayers vivo에서 단백질 동작의 단순한 모방에 대 한 허용 비록 단백질 농도 정밀 하 게 제어 버퍼 제거 손실입니다. Note는 MinDE의 파장은 대략 1 개의 크기 순서 때문에 더 큰 생체 외에서 vivo에서 막대 모양의 microcompartments는 또한 1 개의 크기 순서 더 큰 (10 x 30 µ m) 막대 모양의 대장균 보다에 대 한 셀.
전반적으로,이 프로토콜 단백질 농도, 막 속성, 버퍼 구성 등 모든 조건 정밀 하 게 제어할 수 있습니다. 3 차원 구조적된 지원 사용 vivo에서 복잡 한 마이크로 장비에 대 한 필요 없이 행동을 흉내 낸 공간 감 금에서 공부를 반응이 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 마이클 Heymann 감사 하 고 실리콘의 생산에 대 한 프랭크 Siedler 웨이퍼, 단백질 정화와 사이먼 Kretschmer에 핵심 시설 MPI-B와 레온 해 링 턴 원고에 대 한 의견.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| DOPG | Avanti Polar Lipids | 840475 | |
| E.coli polar lipid extract | Avanti Polar Lipids | 100600 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate | Roche | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285-1G | |
| Sodium chloride | VWR | 27810.295 | |
| Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
| Tris-base | Sigma Aldrich | T1503-1kg | |
| Hydrochloric acid | Roth | 9277.1 | |
| TCEP-HCl | Termo Fisher Scientific | 20491 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetate | Merck Millipore | 1.08418.1000 | |
| Sulfuric Acid 98% | Applichem | 173163.1611 | |
| Hydrogen Peroxide 50% | Applichem | 147064.1211 | |
| HEPES | Biomol | 05288.1 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 102950 | Uvasol |
| Glycerol 86% | Roth | 4043.1 | |
| TB medium | |||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roth | 2316.x | |
| Atto-655-DOPE | Atto Tec | AD 655-161 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| PDMS base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| PDMS crosslinker | Dow Corning Corporation | ||
| Materials | |||
| UV Glue | Norland Products | 6801 | #68 and #63 both work well |
| Coverslips #1.5 24x24 mm | Menzel Gläser | ||
| Coverslips #1 24x24 mm | Menzel Gläser | used only for PDMS microstructures | |
| 0.5 ml reaction tube | Eppendorf | 0030123301 | |
| culture flask 2L | Corning | e.g. 734-1905 | |
| His-Trap HP | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column | Biorad | 7322010 | |
| dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL | Termo Fisher Scientific | 66333 or 66330 | |
| razor blade | |||
| Instruments | |||
| ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems | Merck | ||
| automated protein purification system: Äkta Pure | GE Healthcare Life Sciences | ||
| bath sonicator | Branson | e.g. Model 1510 | |
| ARE-250 mixer | Thinky Corporation | ||
| Plasma cleaner Zepto | Diener electronic | use oxygen as process gas | |
| positive displacement pipettes | Brand | Transferpettor models with glass tips | |
| LSM780 confocal laser scanning microscope | Zeiss | Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective | |
| Plasmids | |||
| pET28a-His-MinD_MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield | |
| pET28a-His-MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinE | |
| pET28a-His-EGFP-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-EGFP-MinD | |
| pET28a-His-mRuby3-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-mRuby3-MinD | |
| pET28a-His- MinC | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinC |
References
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