プロトコルでは、平面脂質二重膜を用いたシナプス インターフェイスを形成する主なポリクローナル T 細胞の機能を研究する手法について説明します。主に由来するリンパ節、末梢血 T 細胞の差動シナプス形成機能を表示するのにこの方法を使用します。
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この記事について
サマリー
要約
原動力の現在の理解と T 細胞シナプス インターフェイスの構造機能主平面膜のガラス サポートと体外を使用して決定されています-派生 T 細胞クローンまたはライン1,2 ,3,4。主なヒト T 細胞由来の血液やリンパにこれらの調査結果を適用方法組織知られていない、分析5セルの十分な数を得ることに重要な難しさもあって。ここで活性化し、接着分子を含む平面脂質二重膜を構築するマルチ チャンネル流れスライドを利用する技術の開発を通じてこのアドレスします。流れスライドの高さの低いシナプス界面形成のダイナミックや顆粒放出の速度論を研究する研究者、細胞: 二重添付ファイルを同期するために急速な細胞沈降を促進します。この 10 数としてシナプス インターフェイスを分析するアプローチを採用4 105一次凍結 T 細胞リンパ節 (LN) と末梢血 (PB) から分離されました。新規平面脂質二分子膜技術できる主な T 細胞由来の血液と健康と病気のコンテキストで組織の生物物理特性の研究結果が明らかに。
概要
T 細胞免疫シナプスおよび T 細胞の機能的活動へのリンクの構造機能の科学的知識は、細胞株の研究から主に生成されているし、PB 由来のクローンを作成します。得られる主な T 細胞に関連してこれらの結果どの程度人間のリンパ組織または血液不明のまま、リンパやその他の組織に存在する T 細胞のシナプスのインタ フェースはこれまで分析されていません。重要なは、新たなデータは住民組織とリンパ器官由来の T 細胞表現型、PB6,7で機能活性に有意差があることをお勧めします。これはさらに主な人間の T 細胞の T 細胞のシナプス インターフェイスの機能を理解する必要性を凝固しました。
このため、私たち人間の PB および LN から分離された未満 105主な T 細胞の T 細胞/二分子膜のイメージングを実行するを有効にするマルチ チャンネル流れスライドに組み込まれた脂質二重膜を利用した新規ミニスケール アプローチを開発しました。この手法より良いモデルし、生体内で細胞間の相互作用を理解するために主な人間の T 細胞シナプスのインターフェイスの生物物理学的特性の研究をことができます。
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プロトコル
本研究はヘルシンキ宣言に基づき行った。すべての参加者から書面によるインフォームド コンセントを得たし、血とリンパ節のサンプルは、ペンシルベニア州立大学 (IRB #809316、IRB # 815056) 制度検討委員会の承認を得て買収されました。すべての被験者は、大人でした。臍帯血サンプルは、トーマス ・ ジェファーソン大学産科婦人科分娩によって提供された親切。すべてのサンプルはデ識別されました。
1. CD4 の分離+ T 細胞の画像解析
-
107冷凍末梢血単核球 (PBMCs) または収集されたサンプルからリンパ節単核細胞 (LNMCs) を含む 1 mL 因数分解しなさい。無菌フードでペニシリン/ストレプトマイシンとグルタミン添加 RPMI 9 mL に解凍されたセルを追加します。
- Centrifugate 4 ° c、300 x gで 10 分間のセル、上清を吸引し、補われた RPMI 10% 含有の 5 mL の細胞を再懸濁します FBS (完全培地)。37 ° C で CO2インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。
- 次の日、浄化 CD4+ T 細胞の否定的な免疫は、メーカーの説明書によると市販のキットを使用して並べ替えによって。<....
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結果
まず、臍帯血由来の活性化 CD8 によって形成されるシナプスのインターフェイスの構造を比較した+ T 脂質二重膜の細胞構築いずれかの伝統的な大規模なフロー電池システム (詳細については材料の表を参照してください)1 ,2,3,4またはマルチ チャンネル流のスライドで。膜に含まれる蛍光標識抗 CD3 と icam-1 50 分子/μ m2と 300 分子/μ m2、それぞれ。CD8+ T プレート連結抗 CD28 と抗 CD3 抗体13,14刺激によるひと臍帯血由来細胞活性します。CD.......
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ディスカッション
ここで説明する手法コンベンショナル フロー セル5平面膜の構築に必要な同じような試薬を利用し、人間の T 細胞-二層のプライマリ インターフェイス3,4 のイメージングを実行する正常に適用することができます。 ,15。技術蛍光分子使用量の大幅な削減を提供しています 10-20 x フロー電池システム5血液や他の組織から主なヒト T 細胞を分析する機会を作成するのと比較して少ない T 細胞を必要とします。
本研究で使用される細胞数では、イメージング 60 X 目的と分野ごとに約 50 セルをイメージすることができました。大きい集中は、セルの集計、解析に適した細胞の数を減らすことで起因しました。我々 はさらに 10-50 x、挿入されたセルの数を減らすことができるが、細胞の数の下限値依存細胞不均一性、画像フ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品が支持されたマイケル r. ベッツに R01AI118694 NIH グラント、サブ賞 566950 百合 Sykulev に含まれています。我々 は、シドニー ・ キンメルがんセンター バイオ イメージング共有リソースに優れたサポートをありがちましょう。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CD4 T細胞単離キット、ヒト | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T細胞単離キット、ヒト | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | アバンティ極性脂質 | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti極性脂質 | 790528C | |
| BiotinylキャップPE | Avanti極性脂質 | 870273C | |
| ヒト血清アルブミン | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| スティッキースライドVI 0.4 | 同上 | 80608 | |
| スティッキースライド用カバースリップ | 同上 | 10812 | |
| バイオテックFCS2チャンバー | バイオプテック | 060319-2-03 | |
| 抗CD3抗体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 16-0037-81 | OKT3クローン、ハイブリドーマ細胞はATCCから入手可能 |
| 抗CD28抗体 | Genetex | GTX14664 | 9.3 |
| カゼイン | シグマ | C5890 | |
| ビオチン-PEO4-NHS | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488タンパク質ラベリングキット 標識タンパク質精製用カラム付き | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 タンパク質ラベリングキット 標識タンパク質精製用カラム付き | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A10238 | |
| アマシャム Cy5 NHS エステル | GE ライフサイエンス | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C ショウジョウバエ発現ベクター | サーモフィッシャーサイエンティフィ | V412020 | |
| pcopneo, G418 ポジセレクション用ショウジョウバエ発現ベクター | ATCC | 37409 | |
| 無血清ショウソソ培地 Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | ハイブリドーマはICAM-1に対する抗体を分泌します。 |
| 臭化シアン活性化セファロース 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | 結合性抗ICAM抗体を用いたセファロースの調製に利用されます。 |
| MasterFlex タンジェンシャルフローコンセントレータ | コールパーマー | 77601-60 7592-40 | 上澄み液濃度を含む ICAM-1 と ICAM-1 の透析に使用されます スーパーナント |
| セントラメートラボ タンジェンシャルフローシステム | ポールラボ | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | 上澄み液濃度を含む ICAM-1 と スーパーナント |
| Ni-NTA アガロース | QIAGEN | 30210 | |
| 透析チューブ | Spectra/Por | 131384 | |
| パパイン パパイヤラテックス | Sigma | P3125 | |
| マウス CD107a BDに対するヒト抗体 | Bioscences | 555798 | クローン H4A3 |
| Ansell ナチュラルブルーグローブ | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene ポリプロピレンハサミ型鉗子 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 6320-0010 | |
| ストレプトアビジン | ProZyme | SA10 | |
| 共焦点顕微鏡 | ニコン | TiE 倒立顕微鏡 PFS による長期画像安定性制御、60X オイル対物レンズ、405、458、488、514、561、640 nm の励起ライン付きレーザー 4 個、GaAsP 検出器 2 個、高感度 PMT、DIC 透過光、プログラム可能な X、Y、Z ステージ 複数の位置と大面積のステッチング、 タイムラプス機能、ライブイメージング用のTokai-Hit温度およびCO2制御チャンバー、防振テーブル | |
| TIRF顕微鏡 | ANDR | アンドールレボリューションXDシステム、405,488,561および640ラインのレーザー、DIC透過光、横河CSU-X1共焦点イメージング用スピニングディスクヘッド、100/1.49 NA対物レンズ、Andor iXon X3 EM-CCDカメラ、 対物レンズヒーター、パーフェクトフォーカスシステム(PFS)搭載圧電電動ステージMetaMorph | |
| Premier Image Analysis Software | 分子デバイス |
参考文献
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clin....
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