Summary
ここでは、移行と時間をかけて、複数の治療条件下で神経膠腫脳腫瘍幹細胞の侵入を定量化する生細胞イメージング技術について述べる。
Abstract
膠芽腫 (GBM) は、現在利用可能な治療オプションとコントロール不良は積極的な脳腫瘍です。急速な拡散と正常脳に広範な浸潤 GBMs のキーが備わっています。再発は、最初の癌の固まりから侵入して、したがって、外科的切除を回避するラジオと化学療法抵抗性脳腫瘍幹細胞 (BTSCs) の存在に起因すると考えられます。したがって、BTSCs と侵襲的能力を対象とする治療はこの病気のそれ以外の場合予後が向上します。当社グループは、他の人を確立し、GBM 患者サンプルから BTSC 文化を特徴としました。これら BTSC 文化は、クローンの自己更新、複数系統の分化と免疫欠損マウスにおける腫瘍発生など根本的な癌幹細胞特性を発揮します。糸球体基底膜の現在の治療法で改善するために BTSC 移行・浸潤のメカニズムの理解が必要です。糸球体基底膜、移行と侵略の研究は神経幹細胞として成長した BTSCs の培養で生育特性を完全に考慮しない既存技術の制限のため一部制限されています。ここでは、我々 は BTSCs の移行と侵略の両方の性質を研究する迅速・定量の生細胞イメージング アッセイをについて説明します。記載されている最初の方法は BTSC 遊走アッセイによる走化性因子のグラデーションの方向への移動を測定します。記載されている 2 番目のメソッドは BTSC 浸潤アッセイ イメージと行列に神経幹細胞からの細胞浸潤を定量化します。ここで説明アッセイは、BTSC 移行と時間が経つと別の処理条件下での侵略の定量化に使用されます。
Introduction
膠芽腫 (GBM) は脳のがんの最も一般的で積極的なフォームそして現在療法にもかかわらず外科的切除を含む続いて放射線、化学療法、患者の生存期間の中央値はわずか 15 カ月1。GBM は侵襲、高度薬剤耐性、および必要な不治の病が新規治療手段を識別するために、固有の生物学に研究を続けた最終的には。GBM の患者の高い死亡率は隣接する正常な脳組織と治療2,3に続く病気の再発につながる血管に沿って移行に広範な細胞侵入によって主に引き起こされる.サイクリングと治療抵抗性が遅い脳腫瘍幹細胞 (BTSCs) と呼ばれるセルのサブセットは、病気の再発につながるという仮説があります。GBM BTSCs は、クローンの自己更新、率、および腫瘍開始する潜在的な4,5,6のプロパティを表示します。BTSCs はまた、親糸球体基底膜腫瘍7,8,9,10の遺伝、分子のおよび表現型の多様性を保持します。これらのプロパティは、糸球体基底膜の研究と新しい治療戦略を探索するための非常に有用なモデル システム BTSCs を確認します。生体内で、これらの幹細胞は腫瘍の形成、成長、および侵入11新生仔ラットの脳に移植したときの対応と非肥満の糖尿病・重度複合免疫不全 (SCID/NOD) マウス4。繰り返し侵襲腫瘍形成生体内で強く、元の腫瘍の細胞および組織学的特性を再現する BTSCs の機能は、腫瘍幹細胞12としての役割をサポートします。
新規治療法は BTSCs のターゲットに開発されているし、GBM の患者の長期予後を向上に役立ちます。現在、限られた治療抵抗性、再発に関連付けられている細胞内移行と侵入過程の理解があります。移行と侵略が異なる現象です。移行は、細胞の動きの基礎となるプロセスであり侵略はまた障壁を物理的に破壊を必要とするのに対し、骨格、接着分子、および焦点のコンタクト ポイントの組み立て/分解の再編を含むなど細胞外マトリックスの13。細胞の遊走・浸潤を勉強の広く受け入れられた方法論は、ボイデン室アッセイ14,15です。この技は、ダブルの部屋は、走化性因子を添加した下部室のメディアで、メディアでいっぱいです。走化性は、非固有走化性因子として特定の成長因子やサイトカイン、ウシ胎児血清を使用してトリガーされます。次の走化性因子のグラデーション、セルは多孔質膜に移行します。エンドポイントでは、移行した細胞を可視化し、細胞診または蛍光染料の染色による膜の下に定量化できます。多孔性コーティングによって遊走アッセイによる浸潤アッセイを変更できます・ ボイデン ・ フィルター型などの細胞外マトリックス成分と私コラーゲンや基底膜のような行列。侵襲的な細胞マトリックスを低下、多孔質フィルターの下を通過、遊走試験と同様の方法で定量化することができます。その他のよく使用される移行の試金傷傷、セルの除外ゾーンの13試金があります。スクラッチ傷アッセイは、細胞膜に隙間を掻くと傷が閉じられるまで一定の間隔でイメージングによる傷の端から細胞の移動を観察することによって実行されます。セルの除外試金、物理的な障壁を使用して細胞の播種前に無細胞ゾーンを作成します。一度削除されたセルが合流、無細胞ゾーンへの細胞の移行はバリアを定期的に16イメージ。
これらは以前に確立したアッセイは GBM BTSCs または他の異種癌細胞の人口を勉強して移行または付着性、均一な細胞集団がポーズかなり欠点の侵略を勉強するため頻繁に使用されます。ボイデン室アッセイは、エンドポイント測定と細胞運動の速度論的評価のみ生成できます。時間の経過観察は、異文化からの細胞は多くの場合異なるレートで移行考える BTSC 移行の測定の関連性が高いです。など、条件とアッセイのタイミングは、文化の種類ごとに最適化する必要があります、適切なサンプリングと定量化のため時間のかかる労働を必要とします。閉じるアッセイは、BTSCs はラミニン コート プレートで単分子膜条件下で培養した場合でも我々 はオープン スペースへの動きに抵抗しにとどまることを好む BTSCs が表示されることを観察している BTSC 文化に適してはスクラッチとセルの除外他のセルへの近さ。さらに、これらは確立移動分析可視化と実験を通して個々 の細胞の監視を可能にしません。BTSCs BTSC 文化のボイデン商工会議所、傷、およびセル除外ゾーンのアッセイの短所に関する詳細は、などの異種細胞集団で移行の評価のために貴重な時間をかけて個々 のセルの監視です彼ら。比較的必要な高い細胞数は、設定する時間がかかることし、どちらかは急速に平衡または走化性因子のグラデーションを持っていません。など、これらの試金は希少または成長の遅い細胞集団または薬剤のスクリーニングを使用するために理想的ではありません。さらに、これらの試金は BTSCs neurosphere 条件下で栽培にとって特に重要である三次元 (3 D) 形式で侵略を測定には適していません。
ここでは、特に観察及び定量化個々 の BTSCs のと GBM BTSCs 培養神経幹細胞としての侵略のための移行の変更の試金をについて説明します。最初のアッセイは、生細胞タイムラプス イメージングと走化性移行プレートを使用して遊走細胞移行13を計測・ ボイデン ・商工会議所アッセイの適応について説明します。複数井戸のフォーマットで住セルイメージ投射は可視化と複数の処理条件下での細胞移動の定量化のためことができます。ここで説明した 2 番目のアッセイは、回転楕円体浸潤アッセイ13,17、neurosphere 条件下で培養した BTSCs の侵襲性の特性を様々 な治療下での 3 D の細胞外マトリックスに埋め込まれた措置条件。全体的にみて、これらの試金は異種 BTSC 文化の渡り鳥や侵襲的な特性を研究するための前述の方法論よりもはるかに互換性があります。彼らはまた病気の再発および致死率に大きく貢献する移行と侵略の両方を対象とする新しい治療戦略の調査のためのより良い機会を提供します。
Protocol
1. 脳腫瘍幹細胞の培養ひと膠芽腫標本に由来する以前
注: BTSC 文化は以前人間 GBM 患者サンプル6,7,8,9,10から確立されました。
- 70% エタノール, 氷の最後は解凍までにちょうど 37 ° c の水浴中に配置を含むビーカーで低温保存 BTSCs のバイアルを解凍します。15 mL コニカル チューブ内のメディアの 10 mL に融解細胞を希釈し、150 相対的な遠心力 (RCF) は 7 分間で細胞を遠心分離します。
メモ: これらのプロトコルを通じて完全なメディア文化 (ケリーらによって前述の) BTSCs に使用される標準的なメディアを参照します。6、通常成長因子存在。成長因子なしメディア ベース メディアのすべてのコンポーネントが、補われた任意の成長因子なしを指します。 - メディアを吸引、完全なメディアの 8 mL の細胞を再懸濁します、T25 フラスコに電池とメディアを転送します。
- 非付着性の条件下で培養 1 週間後毎日フラスコを監視し、必要に応じて、メディアを破壊する開始または黄橙色の色の変化で酸性になると始まる場合に 1-2 ml の完全なメディアの内容を補います。通路の細胞、神経幹細胞が約 250 μ m、通常 10-14 d (図 1) の間の直径に到達するとき。
注: 異文化 BTSC の倍加時間は異なります。Neurosphere サイズは、眼のマイクロメータを使用して計測できます。 - BTSCs を通過するには、メディアを収集し、メディアをピペッティングによる神経幹細胞すべての細胞を収集し、15 mL の円錐管にそれらを転送するためにフラスコの表面をダウンして 150 メーカで 7 分間チューブを遠心分離します。
注: フラスコは、すべて神経幹細胞が収集されていることを確認するには顕微鏡下で確認できます。5 ml のリン酸塩の追加洗浄緩衝生理食塩水 (PBS) またはメディアは、必要に応じて任意の残りの神経幹細胞を収集するために実行できます。 - 単一セル BTSC 神経幹細胞を分離するには、メディアを吸引に予め温めておいた細胞剥離液 1 mL を加えるし、カップ刻んだ P1, 000 ピペット 800 μ L に設定と BTSC 懸濁液 40 x 7 分の 37 ° C で、孵化させなさい。
注: セルできる培養もはや 37 ° C で、神経幹細胞が分離を行う場合。 - 解離の BTSCs に 5 mL の PBS (と抗生物質ペニシリンとストレプトマイシン) を追加し、7 分 150 メーカで細胞を遠心します。
- 上清を吸引し、細胞ペレットのサイズによっては、完全なメディアの 1-4 mL で、BTSCs を再懸濁します。
注: 細胞懸濁液は、濃度が正確な細胞数の正確な検出限界を超える場合さらに希釈する必要があります。 - 死んだ細胞を含まない染料を使用して、トリパン ブルーなど実行可能なセルの数をカウント、フラスコまたは関心のプレートに、BTSCs をシード-T25 フラスコ内の完全なメディアの 8 mL で通常、200,000-300,000 細胞。
2. 脳腫瘍幹細胞遊走試験
- 完全なメディア移行分析の実行を計画する前に 1 〜 2 週間の 8 mL の T25 フラスコの種子 200,000 セルします。
注: 使用 BTSC 文化の成長率によってめっきと試金の実行の間の時間が異なります。- 移行に対する薬物治療の効果をテストするには、セルを含むメディアの別の井戸に直接車または薬のストックの該当するボリュームを追加することによって、DMSO など興味の薬剤の適切な車で細胞を前処理します。
- コラーゲンの薄い層でコーティングすることによって、走化性移行プレート (図 2 a) を準備します。
- コラーゲンを塗布する必要があります走化性 96 ウェル プレートの井戸の数を計算します。各条件に対して、少なくとも 3 つの複製井戸があります。
- 株式の 5 mg/mL の希釈における I 型コラーゲン 0.2 mg/mL に純粋な酢酸文化グレード水で 0.14% に希釈します。
- 膜挿入井戸と下貯水池井戸使用されているコラーゲンの 0.2 mg/mL のピペットします。
注: プレートの下部貯水池は 225 μ L を必要とし、膜挿入井戸適切なコーティング用コラーゲン 75 μ L を必要とします。 - 場所 1 h. の 37 ° C でインキュベーターで移行プレートは、コラーゲン コーティングをスクラッチせず井戸からコラーゲン溶液を吸引します。
- 2 洗浄滅菌 1x PBS で x。プレートがすぐに使用されていない、PBS を吸引し、2 週間 4 ° C でそれを格納します。使用前に室温に走化性移行プレートを温めます。
- 走化性移行プレートの下部貯水池を準備します。
- 10% を添加したメディア (成長因子)、なしの 225 μ L をピペットの走化性移行プレート下部貯水池井戸に走化性因子として FBS。
- 泡の作成を避けるために斜めに下貯水池に膜挿入をそっと置きます。
- 膜に細胞の走化性移行プレートの挿入プレート。
- 50,000 セル/mL の細胞密度でメディア (成長因子) なしで BTSCs を解離再懸濁します。別の薬剤治療中の移行を評価する場合は、メディアに薬を追加します。また、種子めっきとき最終的な薬物濃度を維持しながら前処理細胞および制御の細胞の数と等しい。
- 所望の治療条件下で移行プレートの各ウェルにステップ 2.4.1 から BTSCs の 50 μ L をプレートします。
- 走化性移行をイメージします。
- 生細胞イメージング システムに走化性移行プレートを置き、セット プレートの顕微鏡画像を取得する自動イメージング ソフトウェア最大 72 h 使用して商用ソフトウェアのすべての 1-2 h を (材料の表を参照) を右クリックして、タイムライン、24 h のすべての 2 h にスキャンの間隔を設定します。
注: 時間間隔と経過時間の合計、使用 BTSC 文化によって異なります個々 の BTSC 文化経験を積むまで 72 時間 2 h 間隔で開始します。自動画像処理システムが利用できない場合、ビューの同じフィールドの画像は顕微鏡で手動で獲得できます、カメラ、画像処理ソフトウェアに接続されています。 - 画像の取得が完了したら、実験全体のイメージを取得して膜および移行毛穴 (図 2 b、赤のマスク) の背景から細胞を区別する解析ソフトウェアを使用して処理定義を作成.商用ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、新しい処理定義を選択し、BTSCs の処理定義設定、しきい値を成長サイズの 85、調整の 52 の種子のしきい値に設定(ピクセル)-1、200 μ m2の最小面積で。膜の下側にこの処理定義を適用されます。背景膜から細胞を正確に区別されない場合は、この分析を変更します。
- だけ孔を通って移行したセルがカウント 3 つのレプリケート井戸の各膜の下側のセル表面領域としてデータを収集します。2 μ m で細胞の移動をグラフ化 (細胞の面積は移行) (図 2 Cは、図 3) 時間の経過。
注: 相対セルめっきし、最初の時点で膜の上面にカウント数が類似していることを確認 (より小さい 20% すべての井戸の間で変動) 不均等なめっきの効果を避けるためにすべての治療条件の間。商用ソフトウェア 2.5.2,グラフ/エクスポート、し、データをエクスポートし、メトリックをクリックする手順で作成された処理定義の起動によって実行される (材料の表を参照) を使用してデータ コレクション.
- 生細胞イメージング システムに走化性移行プレートを置き、セット プレートの顕微鏡画像を取得する自動イメージング ソフトウェア最大 72 h 使用して商用ソフトウェアのすべての 1-2 h を (材料の表を参照) を右クリックして、タイムライン、24 h のすべての 2 h にスキャンの間隔を設定します。
3. 脳腫瘍幹細胞 Neurosphere 浸潤アッセイ
- T25 フラスコ浸潤アッセイの実行を計画する前に 1 〜 2 週間の完全なメディアの 8 mL の種子 200,000 セルします。
注: めっきから分析を実行するタイミングは、使用 BTSC 文化の増殖率に依存します。- 前処理細胞、神経幹細胞は侵入のためにめっきされる準備ができている前に所定の時間のコースのための望ましい集中にフラスコに関心の化合物を追加します。
- 平均 neurosphere サイズが約 150-200 μ m まで待つ通常、これは 7-14 d は、使用されている BTSC カルチャに応じてかかります。
注: それはフラスコ内で球サイズの分布を観察する典型的です。 - ヒントし優しくフラスコを混ぜてピペットと BTSC 細胞の 500 μ L を各治療条件の 1.5 mL の円錐管に移動これは 3 つのレプリケート井戸をプレートに使用されます。
注: 手順 3.3.1 - 3.3.2、オプションですが新しい BTSC 文化の最初の侵入実験をお勧めします。- 井戸に終わる神経幹細胞の密度を決定するには、ステップ 3.3 のように 1.5 mL チューブを準備します。優しく、神経幹細胞をミックスし別 96 ウェル プレートに 100 μ L を移動、5 分のために重力によって解決する神経幹細胞ができます。
- それを混雑することがなくイメージングされる井戸の地域で複数の神経幹細胞を確保するために、顕微鏡下で細胞の数を確認します。
注: 侵入細胞直径近隣の神経幹細胞とやり取りしなくてもトリプルに十分なスペースが必要です。ウェルあたりの細胞数は、ウェルあたりの細胞数を数える T25 フラスコから 3.3 の手順で 1.5 mL の円錐管にまたはより少ない細胞を追加することによって調整できます。
- 氷の上ステップ 3.3 からセルで 1.5 mL の円錐管を置き、氷の上の 3.5 3.7 の手順を実行します。
- 5 分の 1.5 mL の円錐管の下部に重力によって解決し、氷の上のラベルの付いた 96 ウェル プレートを prechill 神経幹細胞ができます。
- 細胞外マトリックス蛋白質で、細胞を再懸濁します。
- 準備 500 μ L 0.4 mg/mL のタイプ I のコラーゲン溶液処理条件ごとに氷の上: (成長因子) なしメディアの 459 μ L、5 mg/mL コラーゲン原液 40 μ と 0.92 μ L 滅菌 1N の追加 NaOH (表 1)。
注: コラーゲン溶液の 500 μ L は処理条件ごとに必要な: それぞれの 3 つの複製の井戸と過剰の 200 μ L 100 μ L。薬物治療は、ソリューションのメディア コンポーネントから減算、望ましい最終的な集中でここで追加する必要があります。このプロトコルの使用を記述するタイプ I コラーゲン細胞外マトリックス蛋白質;ただし、任意の細胞外マトリックス蛋白質をテストできます。また、BTSC の侵略、成長因子や FBS の遅い率がある文化が侵略の率を高めるためのメディアで補うことが。 - ステップ 3.5 から神経幹細胞が落ち着いて後は、下部に収まった neurosphere ペレットを失うことがなく多くの可能なメディアとして吸い出しなさい。優しく 3.6.1 の手順で、コラーゲン溶液の 500 μ L で、神経幹細胞を再懸濁します。
- 準備 500 μ L 0.4 mg/mL のタイプ I のコラーゲン溶液処理条件ごとに氷の上: (成長因子) なしメディアの 459 μ L、5 mg/mL コラーゲン原液 40 μ と 0.92 μ L 滅菌 1N の追加 NaOH (表 1)。
- 氷の上の 96 ウェル プレートの 3 つの複製井戸にコラーゲンと neurosphere 混合物の 100 μ L を追加します。5 分間氷の上解決する神経幹細胞を許可します。
- 96 ウェル プレートをコラーゲン重合させる 5 分間 37 ° C の定温器に転送します。
- 96 ウェル プレートのイメージをすぐに準備します。
- 96 ウェル プレートをトレイの生細胞イメージング システムやメッキ、侵攻が始まる前に時 neurosphere サイズの参照としてイメージを取得するには顕微鏡のステージ上に配置します。
- 侵入率が頭打ちになった; まで 1 時間ごとに画像を取得します。通常、これは 24 時間以内に発生します。
注: イメージの間隔は、使用されている機器によって変更できます。侵略の頻度が異なる BTSC 文化のイメージングの間隔および合計の経過時間を変更もできます。
- 彼らは時間の経過とともに行列を侵略 BTSCs の増加の表面領域を決定します。
注: 類似する必要がある 3 つのレプリケート井戸の平均として計算されるめっき時にセルの表面の面積 (より小さい 20% すべての井戸の間で変動) BTSC 侵略の違いはないことを確認する別の治療条件の間数またはメッキ神経幹細胞のサイズによって強く影響を受けます。- 生細胞解析システム イメージ獲得のため対物レンズ 10 倍を使用し、3 つ複製井戸の井戸あたり 4 つの画像を取得します。まあのパーセントの合流点として表される相対セル面積を決定するには、具体的には井戸の背景の上のセルをハイライト処理定義を設定します。商用ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、新しい処理定義を選択し、0.99 に最大 0.8、300 μ m2、および、偏心する最小の領域に分割調整を設定します。この分析は、背景から細胞を正確に区別されない場合に変更します。
注: 時間の経過と共に画像 neurosphere 侵略する他の方法を使用している場合お勧め 3 つが時間の経過とともに井戸を複製用の複数のフィールドの表示を取得します。しかし、ない間隔ごとに正確な同じビュー フィールドを画像収集データの標準誤差が増加します。各画像の侵入細胞の表面積を測定するのに役立ちますコンピューター ソフトウェアを使用できます。 - 各時点ですべての井戸の表面領域 (相対または絶対) 合計セルとしてデータを収集し、3 つのレプリケート井戸の意味を決定します。時間の経過と共に増加のセル領域をプロットすることによって BTSCs の侵略をグラフ化します。
注: データ収集ソフトウェアを用いた 3.10.1、メトリック、グラフ/エクスポート、しをクリックする手順で作成された処理定義を起動して (材料の表を参照) を実行できるし、にデータをエクスポート.
- 生細胞解析システム イメージ獲得のため対物レンズ 10 倍を使用し、3 つ複製井戸の井戸あたり 4 つの画像を取得します。まあのパーセントの合流点として表される相対セル面積を決定するには、具体的には井戸の背景の上のセルをハイライト処理定義を設定します。商用ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、新しい処理定義を選択し、0.99 に最大 0.8、300 μ m2、および、偏心する最小の領域に分割調整を設定します。この分析は、背景から細胞を正確に区別されない場合に変更します。
Representative Results
ここでは、BTSC 移行や侵略を研究する生細胞イメージングの試金を使用して得ることができるデータの例について述べる。BTSCs は単一のセルとしてメッキし、浮遊細胞 (図 1) として育てることができます。述べること BTSCs メッキ私型の薄膜層で被覆が走化性移行板の膜挿入の井戸の中 (図 2 a) コラーゲン、解離することができます。個々 の BTSCs は、アッセイの先頭膜挿入の上に均等に分散しています。24-72 時間の期間は、細胞膜に付着、コラーゲン被覆表面に沿って移動および移行貯水池で走化性因子への膜の下側に 96 の小孔のいずれかを介しても。黄色、青、毛穴と赤の膜の下に細胞膜上に細胞を強調表示した後セル見ることができる (黄色のセルが青の間隙に近づいて) 上孔に入る底面 (赤血球出口孔を終了してing ブルー孔) (図 3)。重要なは、細胞は薬物治療と治療上の介在の BTSC (図 2 b) に及ぼす影響を研究する車両処理制御の細胞の走化性移行プレートにメッキをすることができます。走化性移行プレート上部と膜挿入の下部の両方の細胞のイメージングが可能です。したがって、時間の経過とともに細胞移動の定量化は、(図 2) 膜の下側に移行して細胞をカウントすることによって可能です。
我々 は、BTSCs が完全に解離しない場合、セル気孔を通って移行していない小さな細胞 (図 4 a) として残っているを発見しました。それも重要でしていないプレート 2,500 以上に BTSCs/よく細胞凝集膜 (図 4 b) の下側への移行ではなく、この結果として。最後に、泡膜のめっきセル、下部貯水池の上に膜を置くことを挿入と正確なイメージングと定量 (図 4) を妨げるよう井戸を挿入を避けるために不可欠です。
次、BTSC 侵略、周囲のマトリックスに神経幹細胞からのイメージし、(図 5 a) 96 ウェル プレート形式で時間をかけて定量化できることを示す.侵略は、彼らは時間の経過とともに行列を侵入するように細胞の表面の面積を定量化することで測定できます。画像解析ソフトを使用して、処理定義は、オーバーレイのセルにマスクの表面領域 (図 5 b) 時間の経過と共に自動定量化を可能にすることで適用されました。BTSC の侵略 (図 6) の全体のプロセスを簡単に観察する、BTSC 侵略の時間経過のビデオも作成できます。さらに、蛍光顕微鏡は、エクスプレスの赤色けい光たんぱく質 (RFP) 緑色蛍光タンパク質 (GFP) などの蛍光タンパク質 BTSCs の画像に使用できます。ここでは、彼らのような基底膜マトリックス (図 7) に侵入するように個々 の BTSCs を追跡するために GFP のゾル性細胞質の形を表現する BTSCs の時間経過のビデオを作成しました。この BTSC neurosphere 浸潤能の測定は直接 (図 8 a) の行列に神経幹細胞から BTSC 侵入に及ぼす影響を評価するためにレプリケート井戸に追加する薬物治療もできます。レプリケート井戸における複数神経幹細胞の数量を計算し、(図 8 b) 複数の濃度で薬の効果を評価するために時間の経過とともにグラフ化できます。
上記プロトコルに従わない場合は、信頼性と正確なデータを取得できないことにつながることができます。大きすぎて BTSC 細胞を埋め込み、直径 200 μ m より大きいフィールドのビュー (図 8) ですべての球を正確に定量化するのには大きすぎる焦点の平面をリードします。同様に、障害、神経幹細胞を埋め込み、4 ° C で行列を維持するためには、フォーカスのない均等に、凝固した細胞外マトリックス (図 8 正確なデータの収集ができなくなり、同じ平面上にない球につながることができます。).
図 1: BTSCs を養殖します。これらのパネルは、神経幹細胞に単一セルから成長している文化の 14 d の期間にわたる BTSCs の代表的な例です。14 日でここに示されている神経幹細胞、通過に適したサイズです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BTSC 移行の住セルイメージ投射します。これは、(A) 96 ウェル走化性移行プレートの例はマイク BTSCs 移行抗体を実行する前にコラーゲン タイプの薄い層でコーティングします。画像表示 i) すべての 3 つのプレート (蓋、膜の挿入、および貯水池) の部品並べて、ii) すべて 3 部分が分離膜挿入、iv) 膜の挿入] の下に表示のクローズ アップ イメージの上面の iii) のクローズ アップ画像、および v) 下部貯水池のクローズ アップ画像。(B) 実験の開始 (0 h)、24 h BTSC 移行の代表的なイメージです。画像のフォーカスがセルされたメッキもともと膜挿入の上に。走化性移行プレートの下部に移行した細胞は、赤色でハイライトされます。0 h、少数の細胞は膜の下側に移行しています。24 h 後移行した細胞の数が劇的に増加が。薬対車両 X 細胞の 24 h での画像の比較は、薬物治療が BTSC の移行を減少させることを示しています。スケール バーを表す 600 μ m。 このパネル (C) 次の BTSC 移行の定量化車両あるいは薬物 X による前処理を示しています。グラフは、薬物治療に BTSCs の移行に強い影響があることを示しています。データ ポイントが 3 つの技術的なレプリケート井戸の平均との誤差範囲を表す標準偏差 (SD)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
アニメーション図 3: BTSC 移行タイムラプス ビデオ。このビデオは、私コラーゲン被覆タイプを使用して BTSCs の移行を示しています走化性移行プレート。細胞膜挿入の上に黄色で強調表示されます、膜挿入の下部に移行して細胞が赤で強調表示されます、膜で毛穴が青でハイライトされます。フォーカスの面は、膜の下側の画像セルに設定されます。ビデオは、コマ撮り画像 51 h のすべての時間を撮影し、1 秒あたり 4 フレームでコンパイルを使用して作成されました。スケール バーを表します 200 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
図 4: 移行試験セットアップのエラーの例です。(A) このパネルめっきが走化性移行プレートの上部の膜挿入前に完全に解離しない BTSCs の例を示しています。球の大きさや膜細孔のサイズが小さいは、セル、下部貯水池へ移行することができます。(B) このパネルはセルが多すぎますがメッキされた移行アッセイの例を示します。細胞の凝集細胞遊走と干渉し、定量化を損ないます。(C) このパネルは、BTSCs がメッキされた膜挿入時のバブル形成の例を示します。泡画質の悪さと移行の正確な定量化を防ぐ。スケール バーを表す 600 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: BTSC neurosphere 浸潤アッセイ。これらのパネルの例を示す BTSCs 0.4 mg/mL タイプに、neurosphere から侵入コラーゲン マトリックス 6 時間の期間にわたって。ここでは、各時点で (A) 位相コントラストの画像が表示されます (B) オーバーレイ、代表的な定量的なマスクを持つプロトコル手順 3 で詳しく説明。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: BTSC neurosphere 侵略タイムラプス ビデオで I 型コラーゲン。このビデオは 0.4 mg/mL に、neurosphere から BTSCs の侵略型コラーゲン マトリックス (図 5 aの静止画も表示)。画像は 12 h 10 × 対物すべての時間を使用して取得された、1 秒あたり 4 フレームでコンパイルされます。スケール バーを表す 300 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
図 7: BTSC neurosphere は基底膜のようなマトリックスの時間経過のビデオを侵略します。このビデオは、BTSCs、基底膜のような行列に neurosphere からその表現ゾル性細胞質 GFP の侵略を示しています。画像は 48 h の 4 × 対物 30 分毎を使用して取得した、秒 8 コマでコンパイルされました。スケール バーを表します 800 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
図 8: 治療 BTSC neurosphere 浸潤アッセイ。車両や X. イメージは時間ごとを取得した薬の指示された濃度で基底膜のようなマトリックスで埋め込まれた BTSC (A) 神経幹細胞ここに示す画像は、めっき前後 16 h の時に撮影します。スケール バーを表します 200 μ m。 (B) プロトコル手順 3 の説明に従って周囲のマトリックスに神経幹細胞からの BTSCs の侵略の毎時間、定量化を行った。データ ポイントが 3 つの技術的なレプリケート井戸の意味と誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を表します。(C) このパネルは、BTSC 神経幹細胞に埋め込まれたタイプ私コラーゲン定量に対して大きすぎる球を示しています。スケール バーを表します 300 μ m。 (D) BTSC 神経幹細胞はマイク完全に設定していないコラーゲン タイプの埋め込みこのパネルに表示されます。スケール バーを表します 300 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
| コラーゲン液調製法 | |
| 株式 [コラーゲン] (mg/ml) | 5 |
| 決勝 [コラーゲン] (mg/ml) | 0.4 |
| 必要な井戸の数: | 5 |
| 合計量 (μ l) | 500 |
| ストック コラーゲン (μ l) のボリューム | 40 |
| 1N NaOH (μ l) のボリューム | 0.92 |
| メディア (μ l) のボリューム | 459 |
表 1: 0.4 mg/mL の調製タイプ I コラーゲン溶液。知られている開始と型の目的の最終的な濃度のとおり私コラーゲン溶液。リストされているボリュームは、3 つのレプリケート井戸に加えて、余分な 2 つにプレートを神経幹細胞に十分なプロトコル手順 3 で詳細に説明されているように単一の治療条件を含めることができます。
Discussion
考えると癌細胞が活発に増殖して、これは細胞遊走の研究の潜在的な技術的な挑戦を引き起こします。ここで説明した移行アッセイ、BTSCs めっき成長因子なしの増殖を制限して走化性プレートの走化性因子のグラデーションに完全に 72 時間以上平衡しません。さらに、細胞は、時間の経過とともに住セルイメージ投射を使用して監視されていると広範な細胞分裂が行われないように、セルを視覚的に監視できます。移行試験の成功は、単一のセルに完全に神経幹細胞を分離し、めっき前に細胞数を正確にカウントすることが重要です。球をめっきやクランプ、結果 (図 4 aおよび4 b) 小孔を介して移行から細胞を防ぐことができますあまりにも多くの細胞をメッキします。走化性移行板の細胞をめっきするときまたは下部貯水池に膜挿入を配置するときの泡の作成を避けるために重要です。泡は焦点面を変更し、正確な定量化 (図 4) を防止できます。プレート全体は、このアッセイは、走化性因子に対する生体関連表面に移行し、さらに付着する細胞を必要とこれはセル板孔に移動するために表面を与えるためにコラーゲンの薄い層でコーティングする必要があります。
ここで説明した BTSC 移行プロトコルは、既存のプロトコルと比較してさまざまな治療条件をテストするためのより少ないセルを必要とする個々 のセル移行の速度論的評価を使用できます。これは実験のため細胞の大規模な数を収集することは困難することができます非常にゆっくりと成長の文化にとって重要です。走化性移行プレートの低気孔密度は走化性因子のグラデーションでは、72 時間以上の遅い平衡によりより効果的に時間の長い期間にわたって走化性移行の生物学的プロセスを模倣します。プロトコルは試金措置移行と侵略ではないことを確認する走化性移行プレートにコラーゲン コーティングの非常に薄い層を持っている最適化されていました。それはまたコーティング膜挿入コラーゲン マトリックスに準拠するいるとイメージングと単一細胞の定量を容易します。ただし、技術の 1 つの制限は、時間をかけて複数の井戸間移行の定量化大幅簡素化および商業ソフトウェアを使用して迅速な (材料の表を参照してください)。移行アッセイの顕著な利点前述のように、他の細胞型プロトコルの広範囲な適応性。それはどちらか成長が遅い、準拠、またはゆっくりと移行困難な細胞の走化性の移行を定量化するため特に役に立つでしょう。
BTSC 浸潤能の測定の成功のため、200 μ m より大きい球が一貫してイメージを作成し、(図 5) を定量化は大きすぎて焦点面を持っているよりもサイズが大きくなる前に神経幹細胞を収集するために必要です。さらに、神経幹細胞は、塊および他の細胞との集約を開始できます。これは、正確で一貫性のあるデータの集録を影響します。さらに、神経幹細胞の氷、フォーカス (図 5) の単一の平面にイメージを作成する神経幹細胞を許可する間にコラーゲン、井戸の底に落ち着くことが不可欠です。同様に、これはイメージの質 (図 5) に悪影響を与える可能性がありますもマトリックスの形成を破壊できるようにプレートを移動することがなく完全に設定するのにはコラーゲンを許可することが重要です。BTSC 侵略アッセイは、ここで説明したのための主な利点の 1 つは adherently 成長しなくて、神経幹細胞と培養 BTSCs が直接侵入のため評価されることができます。さらに、任意の細胞外マトリックスは、細胞外マトリックスを特定の組織からの個々 のコンポーネントを使用するか、市販の基底膜の混合物を使用しての BTSC 神経幹細胞を埋め込むことができます。特定したり、侵入の特定のメカニズムをテスト細胞外マトリックスを指定することができます。たとえば、このプロトコルでは、特定のマトリックス成分が低下することが知られている遺伝子のマトリックス メタロペプチダーゼファミリー家族の個々 のメンバーをターゲットの効果を評価することが可能です。また、このプロトコルは BTSC 神経幹細胞を球として成長したセルは同様の方法で使用できます。例として mammospheres または tumorspheres; として大腸癌細胞培養乳癌細胞ただし、これは球の文化として育てることができる細胞の種類方法を制限します。移行および浸潤アッセイの他の利点は、彼らが設定しやすく、96 ウェル フォーマットで作業、データは時間の経過と共に定量化。
全体的にみて、治療後糸球体基底膜の再発を防ぐために BTSC 移行および侵略の調査を容易にするための方法論の開発が不可欠です。ここで説明した移行プロトコルでは、以前に確立された移行法、特に GBM BTSCs の研究に比べて多くの利点を提供しています。この改良された移行プロトコルには BTSCs neurosphere 条件下で培養・ 96 ウェル コラーゲン被覆走化性移行板の単一細胞をメッキの解離が含まれます。生細胞イメージング システムを使用して、BTSCs の移行を監視およびできる時間をかけて量を示されます。ここで説明した浸潤アッセイの行列に神経幹細胞から BTSC 侵入の監視が可能です。この試金によって、96 ウェル プレートでコラーゲン マトリックス、または別のタンパク質が豊富な細胞外マトリックスに神経幹細胞を埋め込むことがあります。生細胞タイムラプス イメージング システムとプレートのイメージングは時間をかけてさまざまな治療条件下で BTSC 侵略の分析のためことができます。これらの試金はしたがって、BTSC 移行と侵略の基になるメカニズムを理解することを望んでの科学者に貴重なツールを提供します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、テクニカル サポートのための Rozina のハッサムと Orsolya Cseh をありがとうございます。この研究プロジェクトは、カナダの財団からの補助金によって (H. Artee Luchman とサミュエル ・ ワイス) に技術革新と (H. Artee Luchman とサミュエル ・ ワイス) にもカナダの幹細胞ネットワークの部分で支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
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