Summary
Qui descriviamo un protocollo per preparare ed effettuare colture primarie di cellule ipofisarie da medaka (Oryzias latipes). Le condizioni ottimizzate in questo protocollo prendere importanti parametri quali temperatura, osmolarità e pH in considerazione imitando le condizioni fisiologiche del pesce, consentendo in tal modo risultati fisiologicamente più significativi.
Abstract
Colture cellulari primarie sono un potente strumento comunemente usato dagli scienziati per studiare le proprietà cellulari e i meccanismi delle cellule isolate in un ambiente controllato. Nonostante grandi differenze nella fisiologia tra mammiferi e pesci, protocolli della coltura delle cellule primarie dal pesce sono spesso basata su condizioni di coltura dei mammiferi, spesso con solo lievi modifiche. Le differenze ambientali influenzano non solo la temperatura corporea, ma anche parametri del siero del sangue quali osmolalità, pH e capacità tampone pH. Come mezzi di coltura cellulare e simili soluzioni di lavoro sono destinati a imitare le caratteristiche del liquido extracellulare e/o del siero del sangue in cui una cella è adattata, è fondamentale che questi parametri sono regolati in modo specifico per l'animale in questione.
L'attuale protocollo descrive le condizioni di coltura primaria ottimizzata per medaka (Oryzias latipes). Il protocollo fornisce una procedura dettagliata su come isolare e mantenere sano dissociato cellule ipofisarie per più di una settimana e comprende le seguenti fasi: 1. la regolazione della osmolalità ai valori trovati nel plasma sanguigno di medaka, 2. la regolazione della temperatura di incubazione a temperatura normale medaka (qui nella struttura acquario) e 3. la regolazione del pH e bicarbonato buffer ai valori comparabili ad altre specie di pesci che vivono a temperature simili. I risultati presentati utilizzando il protocollo descritto promuovono risultati fisiologicamente significativi per medaka e possono essere utilizzati come una guida di riferimento di scienziati che fanno colture cellulari primarie da altre specie di mammiferi.
Introduction
Coltura cellulare è uno dei principali strumenti utilizzati nella ricerca biologica molecolare, fornendo un sistema di modello eccellente per rispondere alle diverse domande biologiche che vanno dal normale fisiologia cellulare a drug screening e carcinogenesi1. Cellule primarie, isolate direttamente dal tessuto animale utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici, sono spesso considerate più biologicamente rilevanti rispetto a linee cellulari come la risposta biologica può essere più vicina alla situazione in vivo . Protocolli per la preparazione di colture cellulari primarie dovrebbero essere ottimizzati per ogni tipo di specie e delle cellule di interesse al fine di imitare le caratteristiche a cui una cella è adattata e ottenere risultati fisiologicamente significativi.
Numerosi protocolli descrivono condizioni di coltura per i sistemi cellulari di mammifero, mentre simili protocolli che descrivono condizioni di coltura primaria per celle di pesce sono piuttosto scarsi in confronto. Le cellule sono vulnerabili a rapidi cambiamenti di temperatura, pH e osmolalità e sono particolarmente fragili durante la procedura di dissociazione. Soluzioni saline commerciali e mezzi di coltura utilizzati per colture cellulari di mammifero non sono ottimali per pesci teleostei, soprattutto in termini di sistemi tampone pH e l'osmolalità. È, pertanto, importante misurare e regolare le soluzioni a livelli fisiologicamente rilevanti di questi parametri nelle specie di interesse.
Colture primarie pituitari sono stati effettuati da diverse specie di pesci teleostei, tra cui la carpa comune (Carpio di Cyprinus)2,3, erba carpa (idella di Ctenopharyngodon)4, ciprino dorato (Carassius auratus di )5, trota iridea (Oncorhynchus mykiss)6,7di anguilla europea (Anguilla anguilla), tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebrafish (Danio rerio)9, e Merluzzo bianco (Gadus morhua)10. Oltre alla regolazione della temperatura di incubazione per le specie di interesse, molti di questi protocolli hanno incubato le cellule alle condizioni di mammifero-simili che possono essere non ottimali per le specie di interesse, con un pH da 7.2 a 7.5 in atmosfera umidificata contenenti 3-5% CO2. Inoltre, è poco chiaro se l'osmolalità delle soluzioni utilizzate per la preparazione di molte di queste colture cellulari primarie sono stati adeguati e stabile tra le diverse soluzioni.
L'attuale protocollo è basato sul precedente lavoro con colture primarie da merluzzo10 e comprende la regolazione della temperatura di incubazione, osmolalità, pH e sistemi tampone pH, tra cui la pressione parziale di anidride carbonica (pCO2), a la fisiologia di medaka (o. latipes). Medaka è un pesce d'acqua dolce di piccole dimensioni (3 – 4 cm), originario dell'Asia. In questi giorni, è utilizzato come una specie di modello in molti laboratori di ricerca del mondo, come è relativamente facile da allevare e altamente resistenti a molti comuni pesci malattie11. Ci sono diversi vantaggi di usando medaka come un modello, tra cui una tolleranza di temperatura da 4 – 40 ° C11, un tempo di generazione breve, gli embrioni trasparenti, un sesso-determinazione genica12e un genoma sequenziato13, come pure molti altri risorse genetiche disponibili.
Le condizioni di coltura primaria in questo protocollo sono ottimizzate per abbinare la temperatura di 26 ° C che medakas sono fornite all'interno della struttura di pesce. Ulteriormente, l'osmolalità è ridotto da 320 mOsm/kg da Atlantic cod vivono in acqua salata a 290 mOsm/kg per medaka vivono in acqua dolce ed è conforme il osmolality normale di medaka plasma14. In confronto, il tipico osmolality del plasma dei mammiferi è nella gamma di 275-295 mOsm15. Pesci di vita in una varietà di temperature e hanno branchie che sono a diretto contatto con acqua, rendendo la capacità buffer e pH del sangue e liquido extracellulare nei pesci diversi da quelli nei mammiferi. Terreni di coltura dei mammiferi di solito includono sistemi di polmonatura che provocano un pH di circa 7.4 quando i media sono equilibrati a un atmosfera standard di 5% CO2 in aria umidificata a 37 ° C. Il pH è dipendente dalla temperatura e il valore di pH neutro (in acqua) aumenta con una diminuzione di temperatura16. Intervalli di pH tipici pesci teleostei al plasma, da 7,7 a 7,917. L'ottimizzazione del presente protocollo hanno compreso una riduzione da pH 7.85 per il merluzzo conservato a 12 ° C a pH 7.75 per medaka mantenuto a 26 ° C aumentando la CO2 da 0,5% al 1%.
Inoltre, la capacità di tampone del bicarbonato è molto diversa in pesci e mammiferi. CO2 è facilmente scambiato attraverso le branchie nei pesci e il pCO2 in acqua è solo una piccola frazione del pCO2 nel polmone18. Modifica la temperatura o il pCO2 cambierà il pH e il tampone del mezzo. Di conseguenza, il pH, né il pCO2 consigliato per l'incubazione di cellule di mammifero è ottimale per le cellule di pesce, e di conseguenza, i terreni di coltura deve essere ottimizzato con sistemi tampone contenente valori fisiologicamente rilevanti per i pesci e la particolare specie di interesse. Questo protocollo descrive come preparare colture cellulari primarie da cadaveri medaka e includere le rettifiche dell'incubazione temperatura, osmolarità, pH e pH tampone apparato, oltre ad altri parametri importanti da considerare quando si prepara la cellula primaria culture da specie di mammiferi.
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Protocol
Esperimenti sugli animali effettuati in questo studio sono stati approvati dall'Università norvegese di Scienze della vita, seguenti linee guida per la cura e il benessere degli animali di ricerca.
1. preparazione delle soluzioni
- Tarare gli strumenti di metro Osmometro e pH secondo le istruzioni del produttore per garantire misurazioni corrette.
-
Preparare 500 mL di Ca2 +- e Mg2 +-libera soluzione tampone fosfato di Dulbecco (dPBS), regolare il pH a 7.75 (punto 1.2.1) e l'osmolalità di 290 mOsm/kg (punto 1.2.2) prima di una filtrazione sterile (punto 1.2.3).
- Aggiustare il pH a 7.75 con un pHmetro calibrato accuratamente aggiungendo gocce di una soluzione di NaOH 1 M mescolando accuratamente la soluzione.
- Misurare l'osmolarità della soluzione utilizzando un Osmometro calibrato e calcolare la quantità di mannitolo necessaria per aumentare l'osmolalità di 290 mOsm/kg. Aggiungere la quantità necessaria di mannitolo e quindi misurare l'osmolarità della soluzione nuovamente per garantire la corretta regolazione.
Nota: La quantità di mannitolo necessario dipende l'osmolalità misurata, che di solito varia tra i diversi lotti. Una molecola di mannitolo è uguale a 1 particella osmotica. - Filtro sterile la soluzione di dPBS utilizzando un filtro da 0,2 µm.
Nota: La soluzione può essere conservata a 4 ° C per almeno 3 mesi.
- Preparare 500 mL di terreno di coltura Leibovitz (L-15) senza L-glutamina e bicarbonato e supplemento esso con 10 mM di NaHCO3 (punto 1.3.1), 4,5 millimetri di glucosio (punto 1.3.2) e 2 mM glutamina commercialmente disponibili (punto 1.3.3). Regolare la soluzione a 290 mOsm/kg (punto 1.3.4), filtri sterili (passo 1.3.5) e aggiungere 2,5 mL di una soluzione di penicillina-streptomicina (punto 1.3.6).
Nota: La soluzione può essere conservata a 4 ° C per almeno 4 settimane.- Aggiungere 420 mg di NaHCO3 per 500 mL di terreno di coltura per ottenere una soluzione di 10 mM.
- Aggiungere 405 mg di glucosio per 500 mL di terreno di coltura per ottenere una soluzione di 4,5 mM.
- Aggiungere 5 mL di brodo di x 100 di una soluzione di glutamina in 500 mL di terreno di coltura per ottenere una soluzione di 2 mM. Mescolare fino a quando tutti i soluti sono dissolti.
- Regolare la soluzione a 290 mOsm/kg con mannitolo utilizzando un Osmometro (come avviene nel passaggio 1.2.2).
- Eseguire una filtrazione sterile del mezzo L-15 utilizzando un filtro di 0,2 µm.
- Dopo la filtrazione sterile, aggiungere 2,5 mL di una soluzione di penicillina-streptomicina, corrispondenti a 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.
- Preparare 50 mL di una soluzione di tripsina con 1 mg/mL del tipo di tripsina (0,1%) II-S sciolto nel dPBS modificate (preparata al punto 1.2). Rendere le aliquote di 2 mL in provette di plastica sterili e conservarli a-20 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Aliquote di 2 mL possono essere memorizzate a-20 ° C per almeno 3 mesi. - Preparare 50 mL di una soluzione di tripsina inibitore utilizzando 1 mg/mL (0,1%) tripsina inibitore tipo ho-s e integrarla con 2 µ g/mL di dnasi disciolto nel dPBS modificate (preparata al punto 1.2). Rendere le aliquote di 2 mL in provette di plastica sterili e conservarli a-20 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Aliquote di 2 mL possono essere memorizzate a-20 ° C per almeno 3 mesi.
2. preparazione delle attrezzature
- Preparare pipette in vetro da fuoco lucidatura la punta per la dissociazione di cella. Fare consigli con 2 categorie di dimensioni diverse (un'apertura media di 0,6-0,8 µm e una piccola apertura di 0,4 – 0,6 µm) giocando con il tempo e la distanza dalla fiamma ruotando contemporaneamente la pipetta. Posizionare le pipette di vetro in un contenitore di vetro pulito ed autoclave (utilizzando la modalità solida a 105 ° C per 45 min).
- Preparare una scatola di polistirolo con ghiaccio.
- Preparare un tubo di plastica con 1,5 mL di dPBS modificate (preparata al punto 1.2) per trasferire i cadaveri per durante la dissezione e tenerlo sul ghiaccio.
- Preparare una provetta da 15 mL con 10 mL di dPBS modificate (preparata al punto 1.2) e tenerlo su ghiaccio fino a quando la dissociazione di cella.
- Preparare fresco o Disgelare aliquote della tripsina e soluzioni di inibitore della tripsina (preparate in punti 1.4 e 1.5) e tenerli sul ghiaccio fino all'utilizzo.
- Impostare il bagno di acqua a 26 ° C prima di iniziare la dissezione per permettere all'acqua di raggiungere la temperatura desiderata prima della dissociazione chimica dei cadaveri.
- Pulire tutti gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% prima, durante e dopo l'uso, tra cui una pinzetta da utilizzare per la dissezione e aghi sottili e una piastra della cera per appuntare il pesce. Utilizzare guanti puliti (cambiare e pulire frequentemente) durante l'intera procedura per evitare una potenziale contaminazione delle cellule.
3. pituitaria dissezione e dissociazione delle cellule
- Eutanasia il pesce immergendolo nella fanghiglia di ghiaccio (0 ° C). Lasciare il pesce nella fanghiglia di ghiaccio per almeno 1 min assicurare un'irreversibile shock ipotermico.
Nota: Dopo pochi secondi si verifica perdita di equilibrio e di immobilizzazione. Assicurarsi che il pesce sia completamente immersa nell'acqua ghiaccio e non giacciono sopra il ghiaccio, come quest'ultimo verrà causare il soffocamento e potenziale pelle brucia invece di uno shock ipotermico rapido e umano. - Rapidamente il pesce in una rete di trasferimento ad una piastra di cera sotto il microscopio di dissezione e distruggere la colonna vertebrale di un punzone dell'ago attraverso il collo.
- Bloccare la testa del pesce alla piastra cera usando aghi sottili, inserendo un ago nella parte anteriore (sopra la bocca) e uno su ciascun lato della testa (dietro al cervello) per stabilizzare la testa prima della dissezione.
- Mostra il pesce sotto il microscopio di dissezione e raschiare delicatamente le scaglie nella parte superiore della testa usando una pinzetta con punta angolata.
- Inserire la punta angolata del forcipe fine sotto la pelle dal lato della testa e rimuovere il tetto del cranio spostando lentamente il forcipe in direzione della bocca, mentre si tiene saldamente il forcipe che racchiude il tetto del cranio.
- Tagliare il midollo spinale completamente usando il forcipe con una punta angolata.
Nota: Il tempo è un fattore importante, in modo da lavorare in modo efficiente e con precisione per limitare il tempo trascorso dalla dissezione dei cadaveri fino a quando le cellule sono placcate nel piatto. Dopo una certa pratica, dissezione pituitaria dovrebbe prendere circa 2 – 3 min per pesce, di cui solo circa 10 s sono necessarie per scegliere l'ipofisi quando il cervello è già esposta. - Capovolgere con attenzione il cervello verso la bocca per esporre l'ipofisi e sezionarlo con una pinza pulita con una punta diritta. Trasferire l'ipofisi a un tubo di plastica contenente 1,5 mL per volta dPBS (per dettagli, vedi punto 2.3) posti su ghiaccio. Controllare la punta della pinza sotto il microscopio per garantire che l'ipofisi è aggiunto correttamente al tubo e nulla è lasciato sul forcipe.
Nota: Sezionare cadaveri come molti come necessario, a seconda del numero di piastre di coltura che stanno per essere preparati contemporaneamente. Come regola generale, calcolare almeno 10 cadaveri da pesce adulto per ogni piatto per avere una densità appropriata delle cellule (che dipende dall'applicazione a valle). - Rotazione verso il basso i cadaveri in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente. Rimuovere il dPBS usando una pipetta di vetro con cautela e prendersi cura per evitare di rimuovere qualsiasi cadaveri.
- Aggiungere 1 mL della soluzione di tripsina (preparata al punto 1.4) per lavare i cadaveri, li spin giù in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s e rimuovere la maggior parte del liquido utilizzando una pipetta di vetro prima di aggiungere un ulteriore 1 mL di soluzione di tripsina.
- Incubare la provetta in un bagno di acqua a 26 ° C per 30 minuti, preferibilmente con agitazione delicata, o in alternativa, toccare il tubo di un paio di volte durante il periodo di incubazione.
- Rotazione verso il basso i cadaveri in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente e assicurarsi che tutti i cadaveri si trovano nella parte inferiore del tubo. Rimuovere la maggior parte della soluzione di tripsina con una pipetta di vetro e aggiungere 1 mL di soluzione di inibitore della tripsina (preparata al punto 1.5) per inattivare la tripsina e lavare i cadaveri.
- Raccogliere i cadaveri nella parte inferiore del tubo di filatura li giù in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente. Rimuovere la maggior parte del liquido con una pipetta di vetro e aggiungere 1 mL di soluzione di inibitore della tripsina (preparata al punto 1.5). Posizionare il tubo su un bagno di acqua a 26 ° C per 20 min, preferibilmente con agitazione delicata, o in alternativa, toccare il tubo di un paio di volte durante il periodo di incubazione per inattivare la tripsina.
- Preparare una piastra di coltura cellulare rivestiti con poli-d-lisina di 35mm con un fondo di vetro centrale aggiungendo 2 mL di terreno di L-15 e che lasciare Incubare per almeno 10 min a 26 ° C e con 1% di CO2 in modo che può raggiungere la giusta temperatura ed il pH prima le cellule di placcatura.
Nota: Una piastra di coltura della cellula di plastica può anche essere utilizzata. Il vantaggio principale dell'utilizzo di un piatto con un fondo di vetro centralizzata è che il settore in cui le cellule sono placcate è più piccolo, e pertanto meno cellule ipofisarie sono necessari per ogni piatto. Alcune applicazioni a valle potrebbero richiedere anche un fondo di vetro (cioè, alcune tecniche di imaging). - Impostare la centrifuga raffreddamento per le provette da 15 mL a 4 ° C per consentirgli di raggiungere la temperatura desiderata prima di iniziare la dissociazione meccanica.
- Raccogliere i cadaveri nella parte inferiore del tubo facendo girare giù il tubo con la soluzione di inibitore della tripsina (dal punto 3.11) in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente e assicurarsi che tutti i cadaveri si trovano nella parte inferiore del tubo prima attentamente eliminando la maggior parte della soluzione dell'inibitore della tripsina usando una pipetta di vetro.
Nota: Eseguire tutti i passaggi seguenti del protocollo in un banco di flusso laminare (LAF) certificati per il lavoro di cella evitare una contaminazione delle cellule. - Aggiungere 1 mL di dPBS modificate ghiacciata (preparata al punto 2.4) per i pezzi di tessuto pituitario e succhiare delicatamente i pezzi di tessuto su e giù (6 – 7 x) in una pipetta di vetro lucidati a fuoco (preparata al punto 2.1).
Nota: La temperatura è un aspetto essenziale, quindi tenete tutte le soluzioni a 4 ° C. Da questo punto in poi, è necessario eseguire tutti i passaggi su ghiaccio quando possibile. - Rotazione verso il basso i pezzi di tessuto in una centrifuga da tavolo per 1 – 2 s a temperatura ambiente e trasferire con cautela la parte superiore del dPBS contenente le cellule dissociate (quasi 1 mL) ad un nuovo tubo da 15 mL posizionato su ghiaccio. Evitare di spostare la pipetta verso la parte inferiore del tubo dove vengono lasciati i pezzi di tessuto.
- Ripetere il passaggio 3.16 – 3,17, dissociare le cellule in 1 mL di dPBS ghiacciata alla volta, fino a quando tutti i 10 mL di dPBS viene utilizzato. Iniziare a utilizzare una pipetta di vetro con un interruttore di una pipetta di vetro con un'apertura più piccola verso la fine e apertura di medie dimensioni (per l'ultimo 3 – 4 mL di dPBS aggiunto) della dissociazione. Se ci sono pezzi di tessuto ancora visibili verso la fine della procedura di dissociazione, aumentare il pipettaggio di circa 10 x verso gli ultimi 2 passaggi di dPBS per dissociazione e infine lasciare i pezzi di tessuto residuo. Risospendere delicatamente le cellule ed evitare di creare bolle, in quanto può causare danni cellulari quando le cellule attaccare alla superficie delle bolle.
Nota: Questo è un passaggio fondamentale del presente protocollo e richiede un certo allenamento per ottenere un buon risultato. - Bilanciare il tubo nella centrifuga (pre-raffreddata a 4 ° C) e spin-down le cellule a 200 x g per 10 min a 4 ° C. Assicurarsi di contrassegnare il lato del tubo dove sarà il pellet cellulare.
- Rimuovere con attenzione il tubo da centrifuga e delicatamente trasferisca il surnatante con una pipetta di vetro ad un tubo di plastica vuoto 15 mL direttamente dopo la centrifugazione. Assicurarsi di rimuovere la maggior parte del surnatante ma fate attenzione a non perdere la piccola pallina di cella (spesso invisibili).
- Attentamente e risospendere il pellet cellulare in 50 – 100 µ l di terreno di coltura di L-15.
Nota: A questo punto, è possibile contare le celle e/o eseguire un test di vitalità (ad esempio una cella contando in presenza del blu di trypan utilizzando un emocitometro), ma state attenti che utilizza parte della sospensione cellulare per questo scopo si abbassa il rendimento. Evitare di utilizzare un volume di sospensione grande quanto aumenta il rischio di diffusione fuori del centro del piatto di cellule. - Goccia a goccia con attenzione le cellule dissociate al centro del piatto di coltura cellulare contenente 2 mL di terreno L-15 (preparato al punto 3.13). Permettono alle cellule di depositarsi sul fondo del piatto per circa 5 min prima di spostarli nell'incubatore, per evitare che le cellule si sono diffuse di fuori la parte sommersa della parte inferiore del vetro.
- Incubare la piastra a 26 ° C e 1% di CO2 per consentire tutte le celle di affondare completamente e attaccare sul fondo del piatto.
- Dopo 30 min, guardate le cellule al microscopio per assicurarsi che essi sono legati alla piastra di coltura.
- Continuare a incubare le cellule a 26 ° C e 1% di CO2.
- Con attenzione cambiare più di (ma non tutto) il mezzo ogni 3 – 4 giorni.
Nota: Evitare di modificare il mezzo più frequentemente, poiché potrebbe disturbare le cellule e farli staccare dal fondo di vetro. Utilizzare le celle per gli esperimenti entro una settimana dopo la semina li.
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Representative Results
Questo protocollo descrive la preparazione di una cultura di cellula primaria da cadaveri medaka e fornisce le cellule sane che possono essere mantenute in una cultura per almeno una settimana. Il protocollo si basa su valori fisiologici rilevanti per medaka14 e inoltre è ottimizzato per il tessuto pituitario in pesci adulti, utilizzando un pH di 7.75 e un'osmolalità di 290 mOsm/kg durante l'intera procedura dalla raccolta del tessuto al placcato cellule in coltura (Figura 1 e Figura 2).
Risultati rappresentativi da esperimenti su colture cellulari primarie di questo protocollo vengono visualizzati in Figura 3, Figura 4e Figura 5. Per i risultati presentati qui, la linea un medaka transgenico, dove luteinizzante ormone (Lh)-cellule gonadotrope esprimere la proteina fluorescente verde (GFP), è stato utilizzato19. La figura 3 Mostra un campo rappresentativo nel piatto di una cultura di cellula primaria dal giorno 0 al giorno 7 dopo la semina, includendo sia sulle immagini di microscopia in campo chiaro e fluorescenti, mostrando le cellule che esprimono GFP Lh-gonadotrope. Con circa 10 cadaveri di medaka adulto per ogni piatto di solito si traduce in una densità di circa 5 x 104 – 1 x 105 celle per ogni piatto dopo la semina. La vitalità delle cellule ipofisarie nella cultura viene calcolata in base al numero totale di cellule che esprimono GFP nella cultura al giorno 1, 3 e 7 dopo il placcaggio, rispetto al giorno 0 (Figura 4). Il grafico riportato nella Figura 4 indica che il numero delle cellule morenti è quasi costante nel tempo, con oltre il 95% delle cellule in vive dopo 1 giorno, mentre oltre il 90% è ancora vivo dopo 3 giorni. Anche se c'è un piccolo declino nell'attuabilità delle cellule con il tempo, la maggior parte delle cellule (circa il 75%) sono ancora viva dopo una settimana nella cultura. Registrazioni elettrofisiologiche delle cellule che esprimono GFP Lh-gonadotrope (eseguite come descritto in Strandabø, et al.) 20 mostrano che le cellule sono in grado di sparare i potenziali di azione spontaneamente dopo 4 giorni nella coltura (Figura 5A). Inoltre, su stimolo della gonadotropina - releasing hormone, un'iniziale transitoria hyperpolarization della membrana cellulare è seguita da un drammatico aumento in frequenza che è concomitante con una depolarizzazione e maggiore durata dell'azione di innesco potenziali (figura 5B).
Figura 1: Panoramica della tecnica cultura pituitario cellula primaria. Cadaveri sono sezionati con una pinzetta e trasferiti in una provetta di plastica contenente dPBS modificate sul ghiaccio (passaggio 1 del protocollo) fino a quando la digestione enzimatica di cadaveri con tripsina a 26 ° C (passaggio 2), seguita da un'inattivazione con un inibitore della tripsina a 26 ° C (non mostrato). La dissociazione meccanica dei cadaveri enzimaticamente digeriti con una pipetta di vetro è eseguita con cura in dPBS su ghiaccio (passaggio 3), seguita da una centrifugazione a 4 ° C (fase 4). Infine, il pellet cellulare è dissolto in terreno di coltura e le cellule placcate fuori in una piastra di coltura delle cellule (passo 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dettagli della dissezione pituitario medaka. (A) la testa di un medaka immobilizzato (vista dorsale) è bloccato su una lastra di cera, e la cima del tetto del cranio viene rimosso con una pinzetta per esporre la parte superiore del cervello. (B), il midollo spinale viene interrotta, e il cervello ribaltato verso la parte anteriore della testa, tale che l'ipofisi è esposto. (C), l'ipofisi sono raccolti con una pinza pulita, raffinata. Punta di freccia indica l'ipofisi nel pannello B e C. Barra della scala = 1.000 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cultura pituitario cellula primaria Medaka. Questi pannelli mostrano immagini ad alta risoluzione confocal di una cultura di cellula primaria pituitaria medaka rappresentante al giorno 0, giorno 3 e giorno 7 dopo la semina. Il pannello superiore mostra le immagini di microscopia in campo chiaro di un campo rappresentativo nel piatto, il pannello centrale Mostra immagini di microscopia fluorescente dello stesso campo di vista visualizzazione delle celle che esprimono GFP Lh-gonadotrope, e il pannello inferiore è una sovrapposizione dei due. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: vitalità del pituitary medaka cellule in cultura. Questa figura mostra la redditività delle colture cellulari di primaria pituitaria misurata al giorno 0, 1, 3 e 7 dopo la semina. I numeri sono calcolati utilizzando il software open-source CellProfiler V2 e sono basati sul numero totale di cellule che esprimono GFP Lh-gonadotrope per piatto in diversi momenti, rispetto al tempo 0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: registrazioni elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie. Questi pannelli mostrano registrazioni elettrofisiologiche da una cella che esprimono GFP Lh-gonadotrope in una coltura di cellule primarie eseguita al giorno 4 dopo la semina, risultati (A) una rappresentanza traccia dei potenziali d'azione spontanei, seguita da (B) una stimolazione con gonadotropina - releasing hormone Gnrh1 per 10 s. La stimolazione Gnrh1 induce una risposta bifase con un hyperpolarization della membrana cellulare, seguita da una depolarizzazione e maggiore durata dei potenziali d'azione (misurato a 50% di picco) da 8,9 ± 3,0 ms prima la stimolazione a 29,2 ± 9,9 ms dopo il stimolazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sistemi di coltura in vitro delle cellule forniscono strumenti potenti per i ricercatori di rispondere a una pletora di diverse domande biologiche se utilizzato nel modo giusto1. È importante ricordare che le cellule dissociate che hanno perso le loro connessioni con le cellule vicine possono essere ottenuti differenti proprietà funzionali che avevano originariamente in vivo. Per evitare di essere a rischio di mal interpretare i risultati ottenuti da esperimenti in vitro , è importante considerare la regolare procedura di cultura la cellula primaria al tipo delle cellule e specie di interesse. Anche moderati adeguamenti delle procedure di coltura e soluzioni utilizzate sono spesso sufficienti per alterare profondamente le condizioni della coltura di uno specifico tipo cellulare.
Questo protocollo descrive condizioni ottimizzate per la preparazione e mantenimento di colture cellulari primarie da cadaveri medaka adulto, che possono essere ottenute regolando parametri come la temperatura, osmolarità, pH e pCO2 delle soluzioni utilizzate, a corrispondono alle condizioni fisiologiche di questa specie. Il pH è dipendente dalla temperatura e deve, pertanto, essere adeguato anche tra specie diverse di pesci teleostei vivono alle diverse temperature17. Il osmolality di tutte le soluzioni utilizzate durante la dissociazione delle cellule e coltura deve essere rettificato al fine di migliorare la condizione delle cellule. Soprattutto, se c'è una discrepanza nel osmolality tra diverse soluzioni utilizzate durante la procedura di isolamento, può avere effetti devastanti sulla qualità di cultura, che porta ad una diminuita vitalità (i risultati inediti degli autori). Soluzioni iperosmotico causerà le cellule a ridursi (e viceversa), quindi interferire con l'integrità della membrana e la membrana proteina funzione21. Un punto importante in questo contesto è che i parametri quali osmolalità e pH non sono solitamente misurato né stabile tra lotti diversi di buffer commerciali e mezzi di coltura utilizzati in condizioni di coltura dei mammiferi. Differenze di osmolarità e pH tra diverse soluzioni utilizzate durante la procedura di isolamento dovrebbero essere evitate a tutti i tempi.
Il tasso di successo di questo protocollo è migliorato da addestramento, così è previsto i ricercatori hanno bisogno di tempo per familiarizzare con le varie fasi della tecnica. Per esempio, il tempo da dissezione di cadaveri fino a quando le cellule sono placcate nel piatto è inversamente correlato alla salute delle cellule. La dissociazione meccanica di cadaveri utilizzando una pipetta di vetro è un passo particolarmente critico del protocollo e richiede un certo allenamento per ottenere un buon risultato. La procedura di dissociazione può introdurre stress osmotico e meccanico che è dannoso per le cellule. L'aggiunta di piccoli volumi di dPBS modificate nei ripetuti passaggi per la dissociazione meccanica garantisce una procedura di dissociazione più delicata dove già dissociate cellule vengono trasferite ad un nuovo tubo e rimasto intatto, mentre il ricercatore continua a dissociare le cellule supplementari dal tessuto in un nuovo volume di dPBS.
Questo protocollo è ottimizzato per cellule ipofisarie medaka adulto. Diverse specie, tessuti o anche diverse fasi della vita dell'animale all'interno del tessuto stesso richiedono ottimizzazioni delle condizioni cultura. Per esempio, cellule ottenute da animali immaturi possono essere più fragile e quindi più sensibili verso l'apoptosi e la morte delle cellule e, così, può richiedere la necessità di adeguare il protocollo, soprattutto verso una procedura di dissociazione più delicato. La dissociazione meccanica utilizzando una pipetta di vetro è una fase molto critica della procedura, come una dissociazione meccanica troppo attenta porterà ad un guadagno inferiore, mentre uno troppo ruvido può indurre apoptosi e/o delle cellule morte. Se gli enzimi differenti sono considerati per dissociazione, potrebbe essere necessario usare una concentrazione di tempo e degli enzimi di digestione diversi. Cadaveri di Medaka sono molto piccole e relativamente facile da dissociare utilizzando il protocollo descritto. Tuttavia, le ottimizzazioni per altre specie potrebbero richiedere l'uso di un filtro a rete dopo la dissociazione per rimuovere i detriti. Il successo di questo protocollo dipende anche in gran parte la procedura in condizioni sterili per evitare di contaminare le cellule.
Il numero delle cellule di seme per ogni piatto dipende dal numero di cadaveri all'inizio, così come il successo della procedura di dissociazione. Ci sono circa circa 15.000 cellule in un pituitaria intatto medaka adulto. Tuttavia, le cellule vengono perse durante il processo di dissociazione e questo deve essere contabilizzato nel calcolo del numero di cadaveri necessari per un esperimento. Utilizzando almeno 10 cadaveri per ogni piatto di solito provoca una densità di circa 50.000 – 100.000 cellule per ogni piatto. Questa densità, aggregazione non forma in qualsiasi quantità significativa, anche dopo 7 giorni nella cultura. Notevolmente, aggregazione sembra essere densità dipendente, come più densa delle cellule sono seminate, più sembrano aggregare. Alcune procedure possono richiedere una cultura più densa e, di conseguenza, la densità di semina ottima dovrebbe essere considerata in base all'applicazione a valle. È un punto importante da prendere in considerazione quando si pianifica il numero di cadaveri da utilizzare per ogni piatto.
Più comuni applicazioni a valle utilizzano colture cellulari primarie entro i primi giorni dopo la semina. I risultati presentati qui, dall'attuabilità delle cellule alle registrazioni elettrofisiologiche, dimostrano che è possibile ottenere buoni risultati da colture cellulari primarie preparati usando il protocollo descritto per fino a 1 settimana dopo la semina. Tuttavia, culture possono essere conservate più a lunghe, e le cellule sane sono ancora presenti dopo oltre 2 settimane in cultura (i risultati inediti degli autori). Le condizioni ottimizzate presentate in questo protocollo facilita risultati fisiologicamente significativi e può essere utile per altri scienziati preparazione di colture cellulari primarie dalle cellule di mammiferi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato dall'Università norvegese di Scienze della vita e Consiglio della ricerca della Norvegia, concessione numero 243811 e 244461 (programma di acquacoltura). Siamo grati a Lourdes Catto Tan dell'Università norvegese di Scienze della vita per mantenere la struttura di pesce.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
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