Summary
Vi beskriver tre experimentella metoder för att utvärdera aktiviteten hypopigmentering av kemikalier in vitro-: kvantifiering av 1) cellulär tyrosinase aktivitet och 2) melanin innehåll och (3) mätning av melanin genom cellulär melanin färgning och bild analys.
Abstract
Denna studie presenterar laborativa metoder för kvantifiering av hypopigmentering aktivitet in vitro. Melanin, stora pigmentet i melanocyterna, syntetiseras som svar på flera cellulära och miljömässiga faktorer. Melanin skyddar hudcellerna från ultraviolett skador, men har också biofysiska och biokemiska funktioner. Överdriven produktion eller ackumulering av melanin i melanocyter kan orsaka dermatologiska problem, såsom fräknar, pigmentfläckar, melasma och mullvadar. Kontroll av melanogenes med hypopigmentering agenter är därför viktigt hos individer med kliniska eller kosmetiska behov. Melanin bildas främst i melanosomer av melanocyterna i en komplicerad biokemisk process som kallas melanogenes, som påverkas av extrinsic och inneboende faktorer, såsom hormoner, inflammation, ålder och ultraviolett ljus exponering. Vi beskriver tre metoder för att bestämma aktiviteten hypopigmentering av kemikalier eller naturliga ämnen i melanocyterna: mätning av 1) cellulär tyrosinase aktivitet och 2) melanin innehåll och 3) färgning och kvantifiera cellulära melanin med bild analys.
I melanogenes katalyserar tyrosinas det hastighetsbegränsande steget som konverterar L-tyrosin i 3,4-dihydroxifenylalanin (L-DOPA) och sedan till dopaquinone. Hämning av tyrosinas är därför en primär hypopigmentering mekanism. I odlade melanocyter, kan tyrosinase aktivitet kvantifieras genom att lägga till L-DOPA som substrat och mäta dopaquinone produktion av spektrofotometri. Melanogenes kan även mätas genom kvantifiering av melanin-halt. Andelen som innehåller melanin cellulära extraheras med NaOH och melanin är kvantifierade spektrofotometriskt. Slutligen kan den melanin-halten kvantifieras av bildanalys efter Fontana-Masson färgning av melanin. Även om resultaten av dessa in vitro-testmetoder inte får alltid återges i mänsklig hud, används dessa metoder allmänt i melanogenes forskning, särskilt som det första steget att identifiera potentiella hypopigmentering aktivitet. Dessa metoder kan också användas för att bedöma melanocyte aktivitet, tillväxt och differentiering. Konsekventa resultat med de tre olika metoderna försäkrar om validiteten på effekterna.
Introduction
Melanin spelar en avgörande roll i fysiologi, patologi och toxikologin hos flera organ inklusive hud, ögon och hjärna1. De viktigaste funktionerna av melanin är foto-screening och biokemiska effekter. Melanin absorberar infrarött och synliga ljus samt ultraviolett (UV) strålning, ökad absorption priser på kortare våglängder av ljus; Således, melanin skyddar vävnader från skador orsakade av synligt ljus eller UV strålning2. Melanin är en antioxidant och har en affinitet för metaller och andra giftiga kemikalier; Därför kan det skydda vävnader från oxidativ och kemisk stress3. Men orsakar överproduktion av melanin dermatologiska problem.
Kvantitet och kvalitet av melanin i huden och iris är de viktigaste faktorerna för färgen på iris och huden. Individer kan ha olika hud färg preferenser; några gynnar solbrun hud, medan andra föredrar ljusare hudfärger. Beroende på dessa konsumenten profiler, har hypopigmentering kosmetika utvecklats för att tillgodose enskilda marknader för gynnade hud färger4. Studier av hypopigmentering och anti-melanogenic aktivitet är därför viktiga både vetenskapligt och praktiskt.
Melanogenes är den komplexa processen att melanin biosyntes genom en serie enzymatiska och spontana kemiska reaktioner i melanocyterna. En melanocyte omges av cirka 36 keratinocyter och melanocyter är de fabriker av melanin-syntesen som distribuerar sin produkt till närliggande keratinocyter. I huden transporteras melanin produceras och lagras i melanosomal facket av melanocyter till närliggande keratinocyter i epidermis via dendriter.
L-tyrosin serverar ursprungliga substratet för melanogenes och enzymet tyrosinase katalyserar två på varandra följande reaktioner att omvandla L-tyrosin i 3,4-dihydroxifenylalanin (DOPA) och sedan in i dopaquinone. Dessa reaktioner är det hastighetsbegränsande steget i melanogenes5,6. Hypopigmentering aktivitet kan följaktligen först mätas genom att bedöma cellulära tyrosinase aktivitet direkt. Till gör så, melanocyte extrakt som innehåller tyrosinas inkuberas med DOPA och den dopaquinone som produceras i proverna kan mätas genom spektrofotometri på 475 nm. Värdena är normaliserade av protein koncentrationerna av prover och ämnen med hypopigmentering aktivitet resulterar i mindre dopaquinone bildning jämfört med kontroller.
För det andra, hypopigmentering aktivitet kan kvantifieras genom mätning melanin i odlade melanocyter direkt. Efter behandling av celler med testämnet, melanin utvinns under alkaliska förhållanden och melanin innehållet kvantifieras i spektrofotometri vid 400 nm. En hypopigmentering agent kommer att resultera i en lägre melanin-halt än kontroller7.
Slutligen kan aktiviteten hypopigmentering kvantifieras av Fontana-Masson melanin färgning och efterföljande bildanalys. I Fontana-Masson färgning, melanin granulat minska ammoniak-silvernitrat till en synlig svart metalliskt tillstånd och svarta områden av celler i mikroskopiska bilder representerar mängden melanin.
En hypopigmentering agent ger oftast konsekventa och jämförbara resultat med dessa tre metoder, vilket bekräftar att aktiviteten som substansen är giltig. Alternativt kan det vara bra att mäta uttrycket av viktiga gener och proteiner i melanogenes som svar på en testsubstans att undersöka hypopigmentering aktivitet. Utöver tyrosinase är tyrosinas-relaterade proteiner (TRP-1) och dopachrome tautomerase (TRP-2) kritiska enzymer i melanogenes8. De transkription faktorn mikroftalmi-associerade transkriptionsfaktor (MITF) är en mästare regulator i melanogenes och kvantifiering av dess gen/proteinnivåer med uttryck eller en arrangören aktivitet assay kan också användas för att bedöma hypopigmentering aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Medium, föreningar och reagenser
- Förbered B16F10 komplett odlingsmedium. Tillägg Dulbecco's modified örnens medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (SKADEDJUR).
- För att göra 500 mL komplett medium, blanda 445 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 50 mL FBS och 5 mL av PEST i en steriliserad 1 L glasflaska. Efter blandning försiktigt, filtrera medium genom ett 0,2 µm flaska-top filter till en ny steriliserad glasflaska och sedan förvaras vid 4 ° C.
Varning: Alla cell kultur tekniker bör göras i mikrobiologiskt säkra skåp med aseptisk teknik för att säkerställa steriliteten.
- För att göra 500 mL komplett medium, blanda 445 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 50 mL FBS och 5 mL av PEST i en steriliserad 1 L glasflaska. Efter blandning försiktigt, filtrera medium genom ett 0,2 µm flaska-top filter till en ny steriliserad glasflaska och sedan förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda lyseringsbuffert: 20 mM Tris (hydroxymetyl) aminometan som innehåller 0,1% Triton x-100 (v/v) buffert med pH 7,5 (pH justeras med HCl). Denna buffert kan användas för 3 månader om den förvaras vid rumstemperatur (RT). Lägga till proteashämmare lyseringsbuffert precis före användning.
- Förbereda tyrosinase hämmare analysbuffert. Laga 1 M NaH2PO4 (monobasiskt) och 1 M Na2HPO4 (dibasiskt) stamlösningar. Blanda 46,3 mL Na2HPO4 och 53,7 mL av NaH2PO4 att förbereda en slutlig volym av 0,1 M natrium fosfatbuffert (pH 6,8).
- Späd den resulterande blandningen till 1 L (slutlig volym) med H2O. Justera pH-värdet i den slutliga lösningen till 6,8. Denna buffert kan användas för 1 månad när de lagras vid 4 ° C.
- Förbereda tyrosinase substratlösningen: 0,1% 3,4-dihydroxi-L-fenylalanin (DOPA, w/v) upplöst i tyrosinase hämmare analysbuffert (se steg 1.3).
Varning: Förvaras på is under användning. - Du kan också förbereda 100 U/mL svamp tyrosinas. Lös upp det frystorkade svamp tyrosinase i tyrosinase hämmare analysbuffert. Denna lösning kan användas för 2 månader om den förvaras vid – 20 ° C. Den svamp tyrosinase aktivitet liksom cellulära tyrosinase verksamhet beräknas i närvaro av cell material.
FÖRSIKTIGHET: Lösningen är aliquoted innan frysning således upprepad frysning-och-upptining kan undvikas. Förvara lösningen på is under användning. - Laga 1 N NaOH-lösning. Väg upp 4 g NaOH i en mätkolv och lös det i destillerat vatten till 100 mL.
- Förbereda fixering lösning (10% formalin). Späd 27 mL 37% formaldehyd med 73 mL destillerat vatten. Förbereda färska dagligen.
- Förbereda ammoniak silver stamlösning. Förbereda 5 mL 10% silvernitratlösning i en mätkolv. Tillsätt ammoniumhydroxidlösning droppvis tills fällningen är helt upplöst. Tillsätt 200 μl silvernitratlösning (10%). Lösningen blir lätt grumlig.
Varning: Undvik kontakt och inandning. Använd ett dragskåp. - Förbereda ammoniak silver fungerande lösning. Späd 2,5 mL ammoniak silver stamlösning med 7,5 mL destillerat vatten. Använd en gång och sedan kasta.
Varning: Undvik kontakt och inandning. Använd ett dragskåp. - Förbereda 0,1% guld klorid. Förbereda 1 mL 10% guld klorid och lägga till 99 mL destillerat vatten i en mätkolv. Förbereda färska dagligen.
- Förbereda fosfat buffert saltlösning (PBS). Tillsätt 8 g NaCl, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g av Na2HPO4 och 0.24 g KH2PO4 i 800 mL destillerat vatten. Justera pH till 7,4 med HCl. Dilute den resulterande blandningen till 1 L (slutlig volym) med destillerat vatten.
- Bered 5% (w/v) natriumtiosulfat löses i destillerat vatten.
2. cell kultur och behandling
- Använda kommersiellt tillgängliga B16F10 celler. Upprätthålla de B16F10 cellerna i komplett medium. Hålla cell kultur kolven i en fuktad, 5% CO2 atmosfär inkubator vid 37 ° C.
- Förbereda test föreningar, hämmare positiv kontroll och negativa kontrollprover.
- Lös de test föreningarna i de lämpliga lösningsmedel. Lös upp vattenlösliga föreningar i dubbeldestillerat vatten. Lös upp vatten olösliga föreningar i lämpligt organiskt lösningsmedel, t.ex., DMSO.
- Här använda arbutin upplöst i dubbeldestillerat vatten (125 μg/mL) som positiv kontroll för att bedöma hypopigmentering aktiviteten jämfört med test föreningar eller en negativ kontroll. Som en negativ kontroll (fordon-behandlade kontroll), använda lösningar eller buffertar används i provet, t.ex., dubbeldestillerat vatten, DMSO, etanol.
- Cell sådd och behandling
- Frö B16F10 celler på 5 × 104 celler per brunn i 24-väl kultur plattor på komplett medium och inkubera i en CO2 inkubator för 24 h. Efter inkubation, aspirera komplett medium.
- Inkubera cellerna med DMEM medium (utan FBS och 1% penicillin/streptomycin) som innehåller antingen test föreningar, en hämmare kontroll eller en negativ kontroll i en CO2 inkubator för 72 h. Kontrollera celler varje 24 h under mikroskopet. Efter detta steg, gå till steg 3-5 för ytterligare experiment.
Varning: Blandningen av testämnet och DMEM medium bör filtreras genom ett 0,2 μm filter.
3. mätning av cellulära Tyrosinase aktivitet
- Med den metod som beskrivs i steg 2, ta bort media och skölj celler två gånger med 300 μL av kall PBS.
- Placera cell kultur plattan på is. Tillsätt 300 μL lyseringsbuffert och inkubera i 5 min. Sedan samla cellen lysate använder en cell skrapa och överföra cellen lysate till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Homogenisera cellen lysate med en cell Homogenisatorer vid 14.500 rpm för 2 s, 3 gånger på is att få intracellulära tyrosinas. Använd den optimala skick specifikt för homogenisatorn.
- Centrifugera i 10 min vid 12.000 × g vid 4 ° C och överföra cellen supernatanten till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Håll på isen under användning.
- Överföra 70 μL av supernatanten till en 96-väl klar polystyren mikroplattan.
- Lägg till 140 μL av en lösning innehållande tyrosinase substrat (DOPA) att en 96-väl klar polystyren mikroplattan, skaka försiktigt och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Valfritt, tillsätt 70 μl 100 U/mL svamp tyrosinase lösning till varje brunn och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Mäta tyrosinase aktiviteten vid en våglängd på 475 nm med microplate reader.
- Normalisera aktiviteten tyrosinase protein koncentrationen av varje prov. Mätning av protein koncentrationen av varje prov med en Bradford assay.
4. mäta Melanin-halt
- Med den metod som beskrivs i steg 2, ta bort media och skölj celler två gånger med 300 μL av kall PBS.
- Placera cell kultur plattan på is. Tillsätt 300 μL lyseringsbuffert och inkubera i 5 min. Sedan samla cellen lysate använder en cell skrapa och överföra cellen lysate till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Centrifugera i 10 min vid 12.000 × g vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ny tub och åtgärd totalprotein koncentration för normalisering. Mätning av protein koncentrationen av varje prov med en Bradford assay.
- Tillsätt 300 μL av 1 N NaOH till varje pellet och inkubera vid 60 ° C för 1 h.
- Centrifugera upplöst lösningen för 10 min vid 12.000 × g vid 4 ° C.
- Överföra 200 μL av supernatanten till en 96 brunnar mikroplattan.
- Mäta melanin innehållet vid en våglängd på 400 nm.
- Normalisera melanin innehållet i protein koncentrationen.
5. Fontana – Masson färgning
- Fontana – Masson färgning
- Tvätta cellerna två gånger med 300 μL av kall PBS.
- Tillsätt 200 μl 10% formalin till varje brunn och inkubera i 1 h vid 4 ° C.
- Skölj med destillerat vatten.
- Tillsätt 200 μl av pre värmde ammoniak silver arbetar lösning och inkubera i 1 timme vid 37 ° C eller tills cellerna blir gul/brun färg.
FÖRSIKTIGHET: Placera nyblandade ammoniak silver fungerande lösning i 58 – 60° C vattenbad och ger tillräcklig tid för temperaturen temperera. - Ta bort ammoniak silver fungerar lösningen och skölj med destillerat vatten.
- Ta bort destillerat vatten. Tillsätt 200 μl 0,1% guld klorid och inkubera i 2 min på RT.
- Ta bort 0,1% guld klorid lösningen och skölj med destillerat vatten.
- Ta bort destillerat vatten. Tillsätt 200 μl av natriumtiosulfat lösning (5% w/v) och inkubera i 2 min.
- Ta bort natrium tiosulfat lösningen och skölj med destillerat vatten.
- Ta bort destillerat vatten. Tillsätt 200 μl av nukleära snabbt rött och inkubera i 5 min.
- Ta bort kärn snabbt röda och skölja med kranvatten.
- Ta bort kranvatten och iaktta de färgade cellerna i Mikroskop.
- Fontana – Masson färgning (tröskelvärde analys använder ImageJ)
Obs: Ett exempel på bilden analysförfarandet med ImageJ programvara visas i den kompletterande material.- Öppna programmet ImageJ.
- Välj fil | Öppen | Mikroskopbilden.
- Välj bild | Justera | Färg tröskel.
- För att mäta området färgas med Fontana – Masson, ange parametern ljusstyrkefältet till noll och justera ljusstyrka baren för att hitta den punkt där alla färgade celler (svart eller mörkbrun) ingår.
- Välj analysera | Analysera partiklar. Markera rutan sammanfatta i fönstret analysera partiklar och tryck OK. Sammanfattande resultat och klistra in i ett kalkylblad.
Obs: Beskrivningen av de resulterande ruta parametrarna är följande:
Segment: Namnet på varje bild
Antal: Antalet färgade celler
Total yta: Total yta av räknade celler
Genomsnittlig storlek: Totalt område/Count
% Område: målat område sammanlagt område × 100%; total yta beräknas automatiskt. - Beräkna relativt området färgas med melanin med hjälp av värdet av totala areal.
Relativa melanin betsad yta (%) = värdet av totala cellular provningsområdet prov/genomsnittligt totalt för kontroll × 100, dvs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat för aktiviteten hypopigmentering av arbutin, en anti-melanogenic förening, i B16F10 melanocyter visas nedan. Figur 1A visar det arbutin signifikant suppression av cellulära tyrosinase aktiviteten jämfört med kontrollen behandlade. Likaså minskade den melanin-halten i celler stimuleras med arbutin signifikant jämfört med kontroller (figur 1B). Mikroskopiska bilder av celler som färgas med Fontana-Masson fläcken visas i figur 1 c. Arbutin behandling minskade området av svart pigment jämfört med kontrollen.
Figur 1 : Arbutin undertryckta melanogenes i melanocyterna. B16F10 celler behandlades med arbutin (125 μg/mL) för 72 h. A. Cellulära tyrosinase aktivitet. B. Melanin-halt. C. Melanin var visualiserat med Fontana-Masson fläck. Data är den medel ± SEM (n = 4). Statistiska jämförelser utfördes med Students t-test (p -värden < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterade protokoll för att utvärdera aktiviteten hypopigmentering av test föreningar använder odlade melanocyter. De representativa resultat visade hypopigmentering effekten av arbutin, en tyrosinas-hämmare som hämmade tyrosinase aktivitet och cellulära melanin-halt. Dessa metoder används i anti-melanogenic aktivitet forskning. Med dessa testmetoder, vi har också framgångsrikt identifierat flera bioaktiva föreningar som har melanogenes hämmande effekter på B16F10 celler tidigare decennium9,10,11,12, 13 , 14.
Melanin är producerad av melanosomer i olika pigment celler, inklusive melanocyter i huden. I denna studie använde vi B16F10 melanomceller som producerar melanin, vilket orsakar odlingssubstratet att bli mörk brun eller svart15. Primära melanocyter kan vara biologiskt viktiga verktyg för att studera Invivo effekter, men på grund av deras begränsade proliferativ kapacitet och variabiliteten i fenotyper genereras, odlade melanocyter anses en tillförlitlig in vitro-modell16. Melanogenes av denna cellinje är jämförbara med primära melanocyter. Denna metod bättre representerar den cellulära miljön än svamp tyrosinase aktivitet analysen, där enzymet direkt inkuberas med substrat och hypopigmentering test förening.
Innan du utför dessa experiment, kan det vara nödvändigt att utföra de 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid (MTT) assay eller jämförbara analyser, såsom cell violett analysen, med att testa andra. Om testämnet påverkar cellproliferation eller uppvisar cytotoxicitet, sedan melanocyte tillväxt kan påverkas, och resultaten kan inte korrekt representerar aktiviteten cellulära tyrosinas. Kemikalier eller naturliga ämnen har ofta vissa cytotoxicitet vid höga koncentrationer och detta är särskilt viktigt för ämnen med mild aktivitet. Det är inte heller ovanligt att ämnen och naturliga extrakt för att främja cell proliferation och differentiering. Potentialen för ytterligare bioaktivitet orsakar celltillväxt ska följaktligen prövas, även om dessa effekter på celltillväxt kan justeras genom att normalisera aktiviteten med protein koncentrationen.
Olika mekanismer kan resultera i hypopigmentering oberoende av tyrosinas aktivitet. Melanogenes är en komplex biosyntetisk väg som involverar flera cellsmedierade reaktioner och transkription faktorn verksamhet17. Uttrycket av viktiga gener och proteiner och melanogenic cellsmedierade reaktioner kunde därför undersökas för en djupgående studie av hypopigmentering. MITF är en viktig transkriptionsfaktor i melanogenes och α-melanocyte-stimulerande hormon (α-MSH) kan stimulera melanogenic signaltransduktion vägar18,19. Beroende på deras kända biologiska egenskaper, kunde relaterade cellsmedierade reaktioner studeras ytterligare.
Vid mätning av melanin-halt, bör de erhållna värdena också normaliseras av protein koncentrationen, så att resultaten korrekt representera melanin innehållet per cell eller kultur område20. Dessutom rekommenderas fenol-red-gratis medium i sammansatta behandling steg att undvika de negativa effekterna av fenolrött på absorbansen.
För melanin färgning, använde vi Fontana-Masson fläcken, som upptäcker argentaffin ämnen, såsom melanin och argentaffin celler21. Denna teknik används också för paraffin eller frusen del prover efter steget avparaffinering. De reagenser som används i detta experiment är skadliga; kontakt och inandning bör undvikas och reagenserna bör användas endast i dragskåp när så är möjligt. Efter färgning, används ImageJ för att beräkna det färgade området. Med Fontana-Masson färgning, kan det vara svårt att tolka svag färgning i glest positiva celler; dock kan detta inte vara en fråga för melanin-rika melanocyter. Silvernitrat, ammoniak silver, natriumtiosulfat och ammoniumhydroxid används i experiment ska hanteras med försiktighet på grund av deras giftighet.
Dessa är allmänt används är metoder i fältet melanogenes och hypopigmentering eftersom de är snabba, praktisk, kostnadseffektiv och pålitlig. Dessa metoder kan vara användbara för utredare som vill identifiera nya föreningar eller extrakt med anti-melanogenic eller pro-melanogenic verksamhet. De kan också användas för att bedöma melanocyte celltillväxt eller cellulär aktivitet. En begränsning är reproducerbarheten för resultaten på mänsklig hud, som är ett komplext organ där homeostas upprätthålls svar på olika miljö, kemiska och biologiska faktorer. Hypopigmentering agenter bekräftas av dessa in vitro-metoder kanske därför inte signifikanta effekter på mänsklig hud Invivo.
I sammandrag är dessa protokoll ett viktigt inledande steg i screening test föreningar för deras hämmande effekter på melanogenes. Vi föreslår att dessa metoder kan förklara inte bara de hämmande effekterna på melanogenes utan också mekanismen som är inblandade. Efter bioaktiva kandidat föreningar identifieras, ytterligare testning kan leda till studier av biologiska mekanismer eller kommersiella tillämpningar, följt av i vivo användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar till rapport.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Korea Institute i planeringen och utvärderingen för teknik i livsmedel, jordbruk och skogsbruk (IPET) genom programmet Agri-bioindustri teknik utveckling, finansierade av ministeriet för jordbruk, livsmedel och landsbygdens frågor (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) och skolan av biovetenskap och bioteknik för BK21 PLUS, Korea University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F.
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E.
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
