Summary
يصف لنا ثلاثة أساليب تجريبية لتقييم النشاط نقص التصبغ للمواد الكيميائية في المختبر: القياس الكمي لمحتوى النشاط أو 2) الميلانين التيروزينات 1) الخلوية و 3) قياس الميلانين بتحليل صورة وتلطيخ الميلانين الخلوية.
Abstract
تقدم هذه الدراسة الطرق المختبرية للتحديد الكمي لنقص التصبغ النشاط في المختبر. هو توليف الميلانين، صبغة رئيسية في الخلايا الصباغية، استجابة للعوامل الخلوية وبيئية متعددة. الميلانين يحمي خلايا الجلد من أضرار الأشعة فوق البنفسجية، ولكن أيضا بالوظائف البيولوجية الفيزيائية والكيميائية الحيوية. الإنتاج المفرط أو تراكم الميلانين في الخلايا الصباغية يمكن أن يسبب مشاكل جلدية، مثل البقع الداكنة والكلف، النمش والشامات. ولذلك، من المهم مراقبة ميلانوجينيسيس مع عوامل نقص التصبغ في الأفراد ذوي الاحتياجات السريرية أو مستحضرات التجميل. أساسا هو توليف الميلانين في الأجسام الصباغية الخلايا الصباغية في عملية بيوكيميائية معقدة تسمى ميلانوجينيسيس، الذي يتأثر بالخارجية والعوامل الجوهرية، مثل الهرمونات، والتهاب، والعمر، والتعرض للضوء فوق البنفسجي. يصف لنا ثلاثة أساليب لتحديد النشاط نقص التصبغ من المواد الكيميائية أو المواد الطبيعية في الخلايا الصباغية: قياس النشاط التيروزينات 1) الخلوية ومحتوى 2) الميلانين، والميلانين الخلوية 3) المصبوغة وتحديد مع الصورة تحليل.
في ميلانوجينيسيس، يحفز التيروزينات هذه الخطوة الحد من معدل تحويل لتيروزين في 3 و 4-ديهيدروكسيفينيلالانيني (L-DOPA)، ومن ثم إلى دوباكوينوني. ولذلك، تثبيط التيروزينات إليه نقص التصبغ الأولية. في الصباغية مثقف، يمكن قياسها كمياً التيروزينات النشاط عن طريق إضافة لدوبا كركيزة وقياس الإنتاج دوباكوينوني التي كانت. ويمكن أيضا قياس ميلانوجينيسيس بالتحديد الكمي لمحتوى الميلانين. يتم استخراج الكسر الخلوية التي تحتوي على الميلانين مع هيدروكسيد الصوديوم وهو كمية الميلانين سبيكتروفوتوميتريكالي. وأخيراً، يمكن قياسها كمياً محتوى الميلانين بتحليل الصور بعد ماسون فونتانا صبغة الميلانين. على الرغم من أن نتائج هذه الاختبارات في المختبر قد لا دائماً تكون مستنسخة في جلد الإنسان، تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع في البحوث ميلانوجينيسيس، خاصة كخطوة أولى لتحديد احتمال نقص التصبغ النشاط. يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب لتقييم الخلايا الصباغية، والنمو، والتمايز. ضمان نتائج متسقة مع ثلاثة أساليب مختلفة صحة الآثار.
Introduction
الميلانين يلعب دوراً حاسما في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، وعلم السموم للعديد من الأجهزة بما في ذلك الجلد والعيون، والدماغ1. المهام الرئيسية الميلانين تأثيرات الصور-الفحص والبيوكيميائية. يمتص الميلانين الخفيفة القريبة من الأشعة تحت الحمراء والمرئية فضلا عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، مع معدلات زيادة امتصاص عند أطوال موجية أقصر من الضوء؛ وهكذا، الميلانين تحمي الأنسجة من الأضرار التي يسببها الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية الإشعاع2. الميلانين هو مضاد للأكسدة وقد تقارب للمعادن وغيرها من المواد الكيميائية السامة؛ ولذلك، يمكن أن تحمي الأنسجة من الإجهاد التأكسدي والكيميائية3. بيد الإفراط في إنتاج الميلانين يسبب مشاكل الأمراض الجلدية.
كمية ونوعية الميلانين في الجلد وقزحية العين هي أهم العوامل المحددة للون قزحية العين والجلد. قد يكون الأفراد تفضيلات لون البشرة المختلفة؛ لصالح بعض الجلد المدبوغة، بينما آخرون يفضلون ألوان البشرة أخف. اعتماداً على هذه التشكيلات الجانبية للمستهلك، استحدثت مستحضرات التجميل نقص التصبغ لإرضاء الأسواق الفردية للجلد يفضل الألوان4. وبناء على ذلك، دراسات النشاط نقص التصبغ ومكافحة ميلانوجينيك أهميتها علمياً وعملياً على حد سواء.
ميلانوجينيسيس هو عملية معقدة تخليق الميلانين الحيوي من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية الانزيمية وعفوية في الخلايا الصباغية. الصباغية واحد محاط بحوالي 36 الكيراتينيه والصباغية الميلانين التوليف المصانع التي تقوم بتوزيع منتجاتها إلى الكيراتينيه المجاورة. في الجلد، ويتم نقل الميلانين تنتج وتخزن في حجرة ميلانوسومال الخلايا الصباغية إلى الكيراتينيه المجاورة في البشرة عبر dendrites.
لام-التيروزين بمثابة الركيزة الأولى ميلانوجينيسيس والتيروزينات إنزيم يحفز اثنين من ردود فعل متتالية تحويل لتيروزين في 3 و 4-ديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) ومن ثم إلى دوباكوينوني. ردود الفعل هذه هي الخطوة الحد من معدل في ميلانوجينيسيس5،6. وبناء على ذلك، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ أولاً بتقييم النشاط التيروزينات الخلوية مباشرة. للقيام بذلك، يتم المحتضنة مقتطفات الصباغية التي تحتوي على التيروزينات مع دوبا ويمكن قياس دوباكوينوني المنتجة في العينات التي كانت في 475 نيوتن متر. القيم التي يتم تطبيع بتركيزات بروتين العينات، والمواد مع نقص التصبغ نتيجة النشاط في تشكيل دوباكوينوني أقل مقارنة مع عناصر التحكم.
ثانيا، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ بقياس الميلانين في الخلايا الصباغية مثقف مباشرة. بعد علاج الخلايا بمادة الاختبار، يتم استخراج الميلانين تحت ظروف قلوية ومحتوى الميلانين هو الكمية التي كانت في 400 نانومتر. سيؤدي إلى انخفاض محتوى الميلانين من ضوابط7عامل نقص التصبغ.
وأخيراً، يمكن قياسها كمياً النشاط نقص التصبغ بصبغة الميلانين فونتانا-ماسون وتحليل الصور اللاحقة. في تلطيخ فونتانا-ماسون، حبيبات الميلانين خفض نترات الأمونيا والفضة لدولة معدني أسود مرئية والمناطق السوداء من الخلايا الموجودة في الصور المجهرية تمثل كمية الميلانين.
عادة ما يعطي عامل نقص التصبغ نتائج متسقة وقابلة للمقارنة مع هذه الأساليب الثلاثة، مما يؤكد أن نشاط المضمون صالحة. وبدلاً من ذلك، قد يكون من المفيد لقياس التعبير عن الجينات الرئيسية والبروتينات في ميلانوجينيسيس استجابة لمادة اختبار لدراسة النشاط نقص التصبغ. البروتينات ذات الصلة التيروزينات (الحزب-1) ودوباتشرومي توتوميراسي (الحزب-2) بالإضافة إلى التيروزينات، الإنزيمات الحيوية في ميلانوجينيسيس8. عامل النسخ مرتبطة بتشوهات عامل النسخ (ميتف) منظم رئيسي في ميلانوجينيسيس والتحديد الكمي لمستويات التعبير الجيني/البروتين أو تحليل نشاط مروج يمكن استخدامها أيضا لتقييم النشاط نقص التصبغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد المتوسطة والمركبات والمواد الكاشفة
- إعداد B16F10 المتوسطة كاملة النمو. تعديل الملحق دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين/ستربتوميسين (مكافحة الآفات).
- لجعل 500 مل متوسطة كاملة، مزيج مل 445 من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 50 مل من FBS و 5 مل من الآفات في زجاجة زجاج معقمة 1 لتر. وبعد الاختلاط بلطف، تصفية المتوسطة من خلال عامل تصفية أعلى زجاجة 0.2 ميكرون إلى قارورة زجاجية معقمة جديدة والمتجر ثم في 4 درجات مئوية.
تنبيه: ينبغي إجراء جميع تقنيات استزراع خلية في مجلس الوزراء باستخدام تقنية معقمة لضمان العقم الميكروبيولوجية السلامة.
- لجعل 500 مل متوسطة كاملة، مزيج مل 445 من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 50 مل من FBS و 5 مل من الآفات في زجاجة زجاج معقمة 1 لتر. وبعد الاختلاط بلطف، تصفية المتوسطة من خلال عامل تصفية أعلى زجاجة 0.2 ميكرون إلى قارورة زجاجية معقمة جديدة والمتجر ثم في 4 درجات مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت لتحلل: 20 مم أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل) الذي يحتوي على المخزن Triton X-100 (v/v) 0.1% في درجة الحموضة 7.5 (pH تعديلها مع HCl). يمكن استخدام هذا المخزن المؤقت لمدة 3 أشهر عند تخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT). إضافة مثبطات البروتياز إلى المخزن المؤقت تحلل الحق قبل الاستخدام.
- إعداد التيروزينات مثبط الإنزيم المخزن المؤقت. تحضير 1 م نة2بو4 (مونوباسيك) و 1 م غ2هبو4 (مائي) الأسهم الحلول. مزيج من 46.3 مل نا2هبو4 ومل 53.7 نة2بو4 إعداد وحدة تخزين نهائي من 0.1 متر فوسفات الصوديوم العازلة (6.8 درجة الحموضة).
- تمييع الخليط الناتج إلى 1 لتر (الحجم النهائي) مع ضبط O. H2الرقم الهيدروجيني للحل النهائي إلى 6.8. يمكن استخدام هذا المخزن المؤقت لمدة شهر واحد عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد التيروزينات الركازة الحل: 0.1% 3 و 4-ديهيدروكسي-L-فينيلالاناين (دوبا، w/v) حلت في التيروزينات مثبط الإنزيم المخزن المؤقت (راجع الخطوة 1، 3).
تنبيه: الحفاظ على الجليد بينما في الاستخدام. - بشكل اختياري، إعداد 100 التيروزينات فطر يو/مليلتر. حل التيروزينات الفطر المجففة بالتبريد في التيروزينات مثبط الإنزيم المخزن المؤقت. يمكن استخدام هذا الحل لمدة شهرين عند تخزينها في –20 درجة مئوية. يتم حساب نشاط فطر التيروزينات، فضلا عن النشاط الخلوي التيروزينات حضور مواد الخلية.
تنبيه: أن الحل اليكووتيد قبل التجميد ومن ثم تكرار التجميد والذوبان يمكن تجنبها. يبقى الحل على الجليد بينما في الاستخدام. - إعداد 1 هيدروكسيد الصوديوم ن الحل. تزن 4 جم من هيدروكسيد الصوديوم في دورق حجمي وحله في الماء المقطر لجعل 100 مل.
- إعداد تثبيت الحل (الفورمالين 10%). تمييع مل 27 من 37% فورمالدهيد مع 73 مل ماء المقطر. إعداد يومية جديدة.
- إعداد أمونياكال حل الأسهم الفضية. إعداد 5 مل محلول نترات الفضة 10% في دورق حجمي. إضافة حل هيدروكسيد الأمونيوم دروبويسي، حتى يذوب في ترسبات تماما. إضافة 200 ميكروليتر من محلول نترات الفضة (10%). وسوف يصبح الحل غائم قليلاً.
تحذير: تجنب الاتصال واستنشاق. استخدام غطاء دخان. - إعداد حل العامل الفضة أمونياكال. تمييع 2.5 مل من أمونياكال حل الأسهم الفضية مع 7.5 مل ماء المقطر. تستخدم مرة واحدة وثم تجاهل.
تحذير: تجنب الاتصال واستنشاق. استخدام غطاء دخان. - يعد كلوريد الذهب 0.1%. إعداد 1 مل كلوريد الذهب 10% وإضافة 99 مل ماء المقطر في دورق حجمي. إعداد يومية جديدة.
- تحضير المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS). أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم، غ 0.2 من بوكل، 1.44 غ غ2هبو4 و 0.24 ز خ2ص4 في 800 مل ماء المقطر. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. ديلوت الخليط الناتج إلى 1 لتر (الحجم النهائي) بالماء المقطر.
- تحضير محلول ثيوكبريتات الصوديوم 5% (w/v) الذائبة في الماء المقطر.
2-الخلية الثقافة والعلاج
- استخدام خلايا B16F10 المتاحة تجارياً. الحفاظ على الخلايا B16F10 في المتوسط كاملة. الاحتفاظ بقارورة ثقافة الخليوي في هوميديفيد، 5% CO2 الغلاف الجوي حاضنة في 37 درجة مئوية.
- إعداد المركبات اختبار ومراقبة إيجابية المانع وعينات المراقبة السلبية.
- حل اختبار المركبات في المذيبات المناسبة. حل مجمعات المياه القابلة للذوبان في الماء المقطر مزدوجة. يحل الماء مركبات غير قابلة للذوبان في المذيبات العضوية المناسبة، على سبيل المثال., [دمس].
- هنا، استخدم اربوتين المذابة في الماء المقطر مزدوج (125 ميكروغرام/مل) كعنصر إيجابي لتقييم النشاط نقص التصبغ بالمقارنة مع المركبات الاختبار أو عنصر تحكم سلبية. كعنصر تحكم سلبية (التحكم بالمعالجة بالمركبات)، استخدم الحلول أو المخازن المؤقتة المستخدمة في عينة الاختبار، مثلاً، الماء المقطر مزدوجة [دمس]، الإيثانول.
- خلية البذر والعلاج
- الخلايا B16F10 البذور في 5 × 104 خلايا/بئر في لوحات الثقافة 24-جيدا باستخدام متوسط كاملة واحتضان في CO2 حاضنة ح 24. وبعد الحضانة، نضح المتوسطة كاملة.
- احتضان الخلايا مع المتوسطة دميم (بدون FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين) التي تحتوي على المركبات الاختبار، عنصر تحكم مثبط، أو عنصر تحكم سلبية في حاضنة CO2 حاء 72 الاختيار خلايا كل 24 ساعة تحت المجهر. بعد هذه الخطوة، انتقل إلى الخطوات من 3-5 لإجراء مزيد من التجارب.
تنبيه: يجب تصفية الخليط من مادة الاختبار والمتوسطة دميم من خلال عامل تصفية 0.2 ميكرومتر.
3-قياس النشاط التيروزينات الخلوية
- باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 2، قم بإزالة الوسائط وشطف الخلايا مرتين مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
- ضع لوحة الثقافة الخلية على الجليد. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل واحتضان لمدة 5 دقائق. ثم جمع استخدام مكشطة خلية الخلية ونقل الخلية ليستي إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي.
- مجانسة الخلية ليساتي مع الخالطون خلية 14,500 لفة في الدقيقة ل 2 ق، 3 مرات على الجليد للحصول على التيروزينات داخل الخلايا. الاستخدام الأمثل شرط محدد الخالطون.
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في × 12,000 ز في 4 درجات مئوية ونقل الخلية طافية إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. الحفاظ على الجليد بينما في الاستخدام.
- نقل 70 ميكروليتر من المادة طافية إلى ميكروسكوبية البوليستيرين 96-جيدا واضحة.
- إضافة 140 ميكروليتر من محلول يحتوي على الركازة التيروزينات (دوبا) إلى ميكروسكوبية البوليستيرين 96-جيدا واضحة وهزه برفق واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
- اختياري، إضافة ميكروليتر 70 حل الفطر التيروزينات U/mL 100 لكل بئر واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
- قياس النشاط التيروزينات في موجه 475 نيوتن متر باستخدام قارئ الميكروسكوبية.
- تطبيع النشاط التيروزينات في تركيز البروتين من كل عينة. قياس تركيز البروتين من كل عينة بمقايسة برادفورد.
4-قياس محتوى الميلانين
- باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 2، قم بإزالة الوسائط وشطف الخلايا مرتين مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
- ضع لوحة الثقافة الخلية على الجليد. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل واحتضان لمدة 5 دقائق. ثم جمع استخدام مكشطة خلية الخلية ونقل الخلية ليستي إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في × 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية على تركيز بروتين الكلي أنبوب وتدبير جديد للتطبيع. قياس تركيز البروتين من كل عينة بمقايسة برادفورد.
- إضافة 300 ميكروليتر من هيدروكسيد الصوديوم ن 1 إلى كل بيليه واحتضان عند 60 درجة مئوية ح 1.
- الطرد المركزي الحل المنحل لمدة 10 دقائق في × 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
- نقل 200 ميكروليتر من المادة طافية إلى ميكروسكوبية 96-جيدا.
- قياس محتويات الميلانين في طول جه 400 نانومتر.
- تطبيع محتويات الميلانين إلى تركيز البروتين.
5-فونتانا-ماسون تلطيخ
- تلوين فونتانا-ماسون
- تغسل الخلايا مرتين مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
- إضافة 200 ميكروليتر من الفورمالين 10% لكل بئر واحتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية.
- شطف مع الماء المقطر.
- إضافة 200 ميكروليتر من الفضة أمونياكال المعالجون مسبقاً يعمل الحل واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية أو حتى تصبح الخلايا في اللون الأصفر/البنى.
تنبيه: ضع الحل العامل الفضي أمونياكال طازجة مختلطة في حمام مائي 58 – 60 درجة مئوية وإتاحة وقت كاف لدرجة الحرارة إلى حجته. - إزالة الفضة أممونياكال يعمل الحل والشطف بماء مقطر.
- إزالة الماء المقطر. إضافة 200 ميكروليتر من كلوريد الذهب 0.1% واحتضان لمدة 2 دقيقة في الرايت
- إزالة الحل 0.1% كلوريد الذهب والشطف بماء مقطر.
- إزالة الماء المقطر. إضافة 200 ميكروليتر من حل ثيوكبريتات الصوديوم (5%، w/v)، واحتضان لمدة 2 دقيقة.
- إزالة الحل ثيوكبريتات الصوديوم والشطف بماء مقطر.
- إزالة الماء المقطر. إضافة 200 ميكروليتر من "الأحمر سريع النووية" واحتضان لمدة 5 دقائق.
- إزالة "الأحمر سريع النووية" والشطف بماء الصنبور.
- إزالة ماء الصنبور ومراقبة الخلايا الملون تحت مجهر.
- تلوين فونتانا-ماسون (عتبة التحليل باستخدام إيماجيج)
ملاحظة: يظهر مثال إجراء تحليل الصورة باستخدام برنامج إيماجيج في "المواد التكميلية".- افتح برنامج إيماجيج.
- حدد ملف | فتح | صورة مجهر.
- حدد صورة | ضبط | تلوين عتبة.
- لقياس المنطقة الملون مع فونتانا-ماسون، تعيين شريط المعلمة سطوع إلى الصفر وضبط شريط السطوع للبحث عن النقطة التي يتم تضمين كافة الخلايا الملون (البنى الداكن أو الأسود).
- تحليل حدد | تحليل الجزيئات. حدد المربع تلخيص في إطار تحليل الجزيئات واضغط موافق. الحصول على النتيجة الموجزة ولصقها في جدول بيانات.
ملاحظة: وصف المعلمات مربع الناتجة كما يلي:
الشريحة: اسم كل صورة
Count: عدد الخلايا الملون
المساحة الكلية: المساحة الإجمالية للخلايا التي تم جردها
متوسط حجم: المنطقة/العدد الإجمالي
المجال %: الملون إلى مجموع مساحة المنطقة × 100%؛ ويحسب إجمالي المساحة تلقائياً. - حساب النسبية المنطقة الملون مع الميلانين باستخدام القيمة من "المساحة الإجمالية".
النسبي الميلانين الملون المنطقة (%) = قيمة مجموع المنطقة الخلوية لاختبار عينة/متوسط المساحة الإجمالية لمراقبة × 100، أي،
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجمع نتائج تمثيلية للنشاط نقص التصبغ اربوتين، مكافحة--ميلانوجينيك، في B16F10 الصباغية موضحة أدناه. ويبين الشكل 1A أن اربوتين قمعها إلى حد كبير النشاط التيروزينات الخلوية مقارنة مع مراقبة المعالجة بالمركبات. وبالمثل، انخفضت محتوى الميلانين من خلايا حفز مع اربوتين انخفاضا كبيرا بالمقارنة مع عناصر التحكم (الشكل 1B). صور مجهرية لخلايا ملطخة بوصمة عار فونتانا-ماسون مبينة في الشكل 1. العلاج اربوتين تناقص مجال الصباغ الأسود مقارنة مع عنصر التحكم.
الشكل 1 : اربوتين قمعت ميلانوجينيسيس في الخلايا الصباغية. B16F10 الخلايا تعامل مع اربوتين (125 ميكروغرام/مل) ل h. 72 ألف النشاط التيروزينات الخلوية. ب-محتوى الميلانين. ج. كان تصور الميلانين مع ماسون فونتانا وصمة عار. تكون البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 4). أجريت المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب (قيمp < اعتبرت 0.05 إحصائيا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد عرضنا بروتوكولات لتقييم النشاط نقص التصبغ لاختبار المركبات باستخدام الخلايا الصباغية مثقف. وأظهرت نتائج الممثل أثر نقص التصبغ اربوتين، مثبط التيروزينات تثبيط التيروزينات النشاط والخلوية محتوى الميلانين. هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع في ميلانوجينيك مكافحة نشاط البحث. باستخدام هذه الاختبارات، حددنا أيضا بنجاح العديد من المركبات الحيوية النشطة التي لها تأثيرات مثبطة ميلانوجينيسيس على الخلايا B16F10 في الماضي العقد9،10،،من1112، 13 , 14.
ويتم إنتاج الميلانين بالأجسام الصباغية في خلايا صبغة مختلفة، بما في ذلك الخلايا الصباغية في الجلد. في هذه الدراسة، كنا B16F10 خلايا سرطان الجلد التي تنتج الميلانين، الذي يسبب المتوسطة الثقافة لتصبح بني أو أسود داكن15. الصباغية الابتدائية قد تكون أدوات هامة بيولوجيا لدراسة آثار المجراة في، ولكن نظراً لمحدودية قدرتها التكاثري والتغير في تعمل المتولدة، تعتبر الصباغية مثقف يعول عليها في المختبر نموذجي16. ميلانوجينيسيس هذا الخط خلية قابل للمقارنة مع تلك الخلايا الصباغية الابتدائية. ويمثل هذا الأسلوب أفضل البيئة الخلوية من مقايسة نشاط فطر التيروزينات، الذي هو المحتضنة الإنزيم مباشرة مع اختبار الركيزة ونقص التصبغ مركب.
قبل إجراء هذه التجارب، قد يكون من الضروري إجراء المقايسة بروميد 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) أو فحوصات مماثلة، مثل المقايسة خلية البنفسجي، مع compound(s) اختبار. إذا كان اختبار مادة يؤثر على تكاثر الخلايا أو معارض سيتوتوكسيسيتي، ثم يمكن أن تتأثر بنمو الخلايا الصباغية، والنتائج التي قد لا تمثل بشكل صحيح بنشاط التيروزينات الخلوية. المواد الكيميائية أو المواد الطبيعية غالباً ما يكون بعض سيتوتوكسيسيتي بتركيزات عالية، وهذا أهمية خاصة بالنسبة للمواد مع نشاط معتدل. كما أنه ليس غير المألوف للمواد والخلية مقتطفات الطبيعية لتعزيز انتشار والتمايز. ونتيجة لذلك، ينبغي النظر في احتمال بيواكتيفيتي إضافية تسبب نمو الخلايا، على الرغم من أن هذه التأثيرات على نمو الخلايا يمكن تعديلها بتطبيع النشاط مع تركيز البروتين.
آليات مختلفة يمكن أن يؤدي نقص التصبغ مستقلة عن نشاط التيروزينات. ميلانوجينيسيس هو مسار السكروز معقد ينطوي على عدة ممرات توصيل الإشارات والنسخ عامل الأنشطة17. ولذلك، يمكن النظر في التعبير عن الجينات الأساسية والبروتينات وممرات توصيل الإشارات ميلانوجينيك لإجراء دراسة متعمقة لنقص التصبغ. ميتف عامل نسخ مهم في ميلانوجينيسيس ويمكن أن تحفز α-الصباغية-تحفيز هرمون (α-مش) ميلانوجينيك الإشارات تنبيغ مسارات18،19. اعتماداً على خصائصها البيولوجية المعروفة، ويمكن دراسة سبل توصيل الإشارات ذات الصلة كذلك.
عند قياس محتوى الميلانين، القيم التي يتم الحصول عليها ينبغي أيضا تطبيع بتركيز البروتين، حيث أن النتائج تمثل بشكل صحيح محتوى الميلانين كل خلية أو كل ثقافة المنطقة20. بالإضافة إلى ذلك، ينصح المتوسطة خالية من الأحمر الفينول في الخطوة العلاج المركب لتجنب الآثار السلبية للفينول الحمراء على امتصاص.
لقد استخدمنا لصبغة الميلانين، وصمة عار فونتانا-ماسون، الذي يكشف عن المواد أرجينتافين، مثل خلايا الميلانين وأرجينتافين21. كما يستخدم هذا الأسلوب البارافين أو عينات القسم المجمد عقب الخطوة ديبارافينيزيشن. الكواشف المستخدمة في هذه التجربة الضارة؛ وينبغي تجنب الاتصال واستنشاق، والكاشفات ينبغي أن تستخدم فقط في غطاء دخان كلما كان ذلك ممكناً. بعد تلطيخ، يستخدم إيماجيج لحساب المنطقة الملون. مع فونتانا-ماسون تلطيخ، قد يكون من الصعب تفسير تلطيخ باهتة في الخلايا إيجابية قليلة؛ ومع ذلك، هذا قد لا يكون مشكلة بالنسبة الصباغية الميلانين الغنية. نترات الفضة، والفضة أمونياكال، ثيوكبريتات الصوديوم، وهيدروكسيد الأمونيوم المستخدمة في التجارب التي يجب أن تعالج الرعاية بسبب سميتها.
وهذه على نطاق واسع المستخدمة أساليب في ميدان ميلانوجينيسيس ونقص التصبغ لأنهم سريع ومفيد وفعالة من حيث التكلفة وموثوق بها. قد تكون هذه الأساليب مفيدة للمحققين الذين يرغبون في التعرف على مركبات جديدة أو مقتطفات مع أنشطة مكافحة--ميلانوجينيك أو ميلانوجينيك للمحترفين. ويمكن استخدامها أيضا لتقييم نمو الخلايا الصباغية أو النشاط الخلوي. واحد الحد من إمكانية تكرار نتائج نتائج على جلد الإنسان، وهو جهاز معقد فيه الحفاظ على التوازن في الاستجابة لمختلف العوامل البيئية والكيميائية والبيولوجية. ولذلك، قد لا يكون نقص التصبغ وكلاء تؤكدها هذه الأساليب في المختبر آثار كبيرة على جلد الإنسان المجراة.
وباختصار، هذه البروتوكولات خطوة أولية هامة في فحص المركبات الاختبار لآثارها المثبطة في ميلانوجينيسيس. ونحن نقترح أن هذه الأساليب يمكن أن يفسر ليس فقط الآثار المثبطة على ميلانوجينيسيس ولكن أيضا الآلية التي ينطوي عليها. بعد أن يتم التعرف على المركبات النشطة بيولوجيا المرشح، إجراء مزيد من التجارب قد تؤدي إلى دراسات الآليات البيولوجية أو التطبيقات التجارية، تليها المجراة في الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف للتقرير.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها معهد كوريا لتخطيط وتقييم التكنولوجيا في مجال الأغذية والزراعة، والحراجة (إيبيت) من خلال "برنامج تطوير التكنولوجيا" الزراعية-الصناعة البيولوجية، تموله وزارة الزراعة والأغذية، والشؤون الريفية (مافرا ) (116159-02-2-WT011) ومدرسة علوم الحياة والتكنولوجيا الحيوية ل BK21 بالإضافة إلى ذلك، جامعة كوريا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F.
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E.
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
