Summary
We beschrijven drie experimentele methoden voor de evaluatie van de activiteit van de verdikking van chemische stoffen in vitro: kwantificering van 1) cellulaire tyrosinase-activiteit en 2) melanine inhoud, en 3) meting van melanine door cellulaire melanine kleuring en beeld-analyse.
Abstract
Deze studie presenteert laboratoriumtechnieken voor de kwantificering van hypopigmentatie activiteit in vitro. Melanine, de grote pigment in de melanocyten, wordt gesynthetiseerd in reactie op meerdere factoren voor cellulaire en milieu. Melanine beschermt de huidcellen tegen ultraviolet schade, maar heeft ook biofysische en biochemische functies. Buitensporige productie of ophoping van melanine in de melanocyten kan leiden tot dermatologische problemen, zoals sproeten, donkere vlekken, melasma en mollen. Daarom is de controle van melanogenesis met hypopigmentatie agenten is belangrijk bij personen met klinische en cosmetische behoeften. Melanine is hoofdzakelijk gesynthetiseerd in de melanosomes van melanocyten in een complexe biochemische proces genaamd melanogenesis, die wordt beïnvloed door Extrinsieke en intrinsieke factoren, zoals hormonen, ontsteking, leeftijd en blootstelling aan ultraviolet licht. We beschrijven drie methoden om te bepalen van de activiteit van de verdikking van chemicaliën of natuurlijke stoffen in de melanocyten: meting van de 1) cellulaire tyrosinase-activiteit 2) melanine inhoud, en 3) kleuring en kwantificering cellulaire melanine met afbeelding analyse.
In melanogenesis katalyseert tyrosinase de snelheidslimieten stap dat L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (levodopa) en vervolgens naar dopaquinone converteert. Daarom is de remming van tyrosinase een primaire hypopigmentatie mechanisme. In gekweekte melanocyten, kan tyrosinase-activiteit worden gekwantificeerd door levodopa als een substraat toe te voegen en het meten van de dopaquinone productie door spectrofotometrie. Melanogenesis kan ook worden gemeten door het kwantificeren van de melanine inhoud. De melanine bevattende cellulaire fractie wordt geëxtraheerd met NaOH en melanine spectrophotometrically wordt gekwantificeerd. Tot slot kan de melanine inhoud worden gekwantificeerd door beeldanalyse na Fontana-Masson kleuring van melanine. Hoewel de resultaten van deze in-vitrotests kunnen niet altijd worden gereproduceerd in de menselijke huid, worden deze methoden veel gebruikt in melanogenesis onderzoek, met name als de eerste stap om te identificeren van potentiële hypopigmentatie activiteit. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de melanocyt activiteit, groei en differentiatie. Consistente resultaten met de drie verschillende methoden zorgen de geldigheid van de effecten.
Introduction
Melanine speelt een cruciale rol in de fysiologie, pathologie en toxicologie van verscheidene organen waaronder de huid, ogen en hersenen1. Belangrijkste functies van melanine zijn foto-screening en biochemische effecten. Melanine absorbeert nabij-infrarood en zichtbaar licht, alsmede ultraviolette (UV) straling, met verhoogde absorptie tarieven bij kortere golflengten van het licht; melanine beschermt dus weefsels tegen schade veroorzaakt door zichtbaar licht of UV straling2. Melanine is een antioxidant en heeft een affiniteit voor metalen en andere giftige chemische stoffen; het kan daarom weefsels beschermen tegen oxidatieve en chemische stress3. De overmatige productie van melanine veroorzaakt echter dermatologische problemen.
De kwantiteit en kwaliteit van melanine in de huid en iris zijn de belangrijkste determinanten van de kleur van de iris en de huid. Individuen kunnen hebben verschillende huid kleurvoorkeuren; enkele gunst gebruinde huid, terwijl anderen het voordeel van lichtere kleuren van de huid. Afhankelijk van deze consument profielen, zijn hypopigmentatie cosmetica ontwikkeld om te voldoen aan individuele markten voor favoriete huid kleuren4. Dienovereenkomstig, zijn studies van hypopigmentatie en anti-melanogenic activiteiten belangrijk, zowel wetenschappelijk als praktisch.
Melanogenesis is het complexe proces van melanine biosynthese door middel van een reeks van enzymatische en spontane chemische reacties in de melanocyten. Een melanocyt wordt omgeven door ongeveer 36 keratinocyten en melanocyten zijn de melanine synthese fabrieken die verspreiden van hun product aan naburige keratinocyten. In de huid, wordt de melanine geproduceerd en opgeslagen in het compartiment van de melanosomal van melanocyten getransporteerd naar naburige keratinocyten in de opperhuid via dendrites.
L-Tyrosine serveert de eerste substraat voor melanogenesis en het enzym tyrosinase katalyseert twee opeenvolgende reacties die L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en vervolgens naar dopaquinone converteren. Deze reacties zijn de snelheidslimieten stap in melanogenesis5,6. Dienovereenkomstig, hypopigmentatie activiteit kan eerst worden gemeten door cellulaire tyrosinase-activiteit rechtstreeks te bepalen. Om dit te doen, melanocyt extracten met tyrosinase worden geïncubeerd met DOPA en de dopaquinone geproduceerd in de monsters kan worden gemeten door spectrofotometrie op 475 nm. De waarden zijn genormaliseerd door de concentraties van de eiwitten van de monsters, alsmede stoffen met hypopigmentatie activiteit resultaat in minder vorming van de dopaquinone vergeleken met besturingselementen.
Ten tweede, hypopigmentatie activiteit kan worden gekwantificeerd door het meten van melanine in gekweekte melanocyten direct. Na behandeling van cellen met het testmateriaal, melanine wordt gewonnen onder alkalische omstandigheden en de melanine inhoud wordt gekwantificeerd door spectrofotometrie bij 400 nm. Een verdikking agent zal resulteren in een lagere melanine inhoud dan de besturingselementen7.
Tot slot, de verdikking activiteit kan worden gekwantificeerd door Fontana-Masson melanine kleuring en latere beeldanalyse. Melanine korrels Verlaag ammoniak-zilvernitraat aan een zwarte metalen zichtbaarheidsstatus in Fontana-Masson kleuring, en de zwarte gebieden van cellen in de microscopische beelden vertegenwoordigen de hoeveelheid melanine.
Een verdikking agent geeft meestal consistente en vergelijkbare resultaten met deze drie methoden, die bevestigt dat de activiteit van de stof geldig is. Anderzijds kan het zinvol zijn om te meten de uitdrukking van essentiële genen en proteïnen in melanogenesis naar aanleiding van een teststof te onderzoeken van hypopigmentatie activiteit. Naast tyrosinase zijn tyrosinase-gerelateerde eiwitten (TRP-1) en dopachrome tautomerase (TRP-2) essentiële enzymen in melanogenesis8. De transcriptie factor microphthalmia-geassocieerde transcriptiefactor (MITF) is een meester regelgever in melanogenesis en kwantificering van de gene/proteïne expressie niveaus of een promotor activiteit assay kan ook worden gebruikt om te beoordelen van hypopigmentatie activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Medium, verbindingen en reagentia
- B16F10 groeimedium volledig voor te bereiden. De aanvulling Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (PEST).
- Meng om 500 mL van volledige medium, 445 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 50 mL FBS en 5 mL van de PEST in een gesteriliseerde 1 L-fles. Na het mengen zachtjes, filtreer het medium door een 0,2-µm fles-top-filter naar een nieuwe gesteriliseerde glazen fles en vervolgens bewaren bij 4 ° C.
Let op: Alle cel cultuur technieken moeten worden genomen in de microbiologische veiligheid kabinet met behulp van aseptische techniek om steriliteit.
- Meng om 500 mL van volledige medium, 445 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 50 mL FBS en 5 mL van de PEST in een gesteriliseerde 1 L-fles. Na het mengen zachtjes, filtreer het medium door een 0,2-µm fles-top-filter naar een nieuwe gesteriliseerde glazen fles en vervolgens bewaren bij 4 ° C.
- Lysis-buffermengsel bereiden: 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane met 0,1% Triton X-100 (v/v) buffer met een pH 7.5 (pH aangepast met HCl). Deze buffer kan worden gebruikt voor 3 maanden toen bewaard bij kamertemperatuur (RT). Proteaseinhibitors toevoegen aan de lysis-buffermengsel vlak voor gebruik.
- Bereiden tyrosinase-remmer bepaling buffer. 1 M NaH2PO4 (monobasisch) en 1 M Na2HPO4 (dibasische) stamoplossingen voorbereiden. Meng 46.3 mL nb2HPO4 en 53,7 mL NaH2PO4 te bereiden een eindvolume van 0,1 M fosfaatbuffer sodium (pH 6.8).
- Verdun het resulterende mengsel 1 L (eindvolume) met H2O. aanpassen de pH van de definitieve oplossing voor de 6,8. Deze buffer kan worden gebruikt voor 1 maand wanneer opgeslagen bij 4 ° C.
- Bereid tyrosinase substraat oplossing: 0,1% 3,4-dihydroxy-L-fenylalanine (DOPA, w/v) opgelost in tyrosinase-remmer bepaling buffer (zie stap 1.3).
Let op: Houd op ijs terwijl in gebruik. - Optioneel, bereiden 100 U/mL paddestoel tyrosinase. Los van het gelyofiliseerd paddestoel tyrosinase in tyrosinase-remmer bepaling buffer. Deze oplossing kan worden aangewend voor 2 maanden wanneer opgeslagen bij –20 ° C. De paddestoel tyrosinase-activiteit, evenals de cellulaire tyrosinase-activiteit worden in aanwezigheid van cel materialen berekend.
Let op: De oplossing is aliquoted voordat dus bevriezen herhaald invriezen en ontdooien kan worden vermeden. Bewaar deze oplossing op ijs terwijl in gebruik. - Bereiden 1 N NaOH oplossing. Weeg 4 g van NaOH in een maatkolf en ontbinden in gedestilleerd water te maken van 100 mL.
- Bereid fixatie-oplossing (10% formaline). Verdun 27 mL van 37% formaldehyde met 73 mL gedestilleerd water. Dagelijks vers bereid.
- Ammoniakale zilveroplossing voorraad voor te bereiden. Bereiden 5 mL 10% zilvernitraat, oplossing in een maatkolf. Voeg ammoniumhydroxide-oplossing ontkleuring, totdat het neerslag volledig is opgelost. Voeg 200 l zilvernitraatoplossing (10%). De oplossing wordt licht bewolkt.
Let op: Vermijd contact en inhalatie. Gebruik een zuurkast. - Bereiden ammoniakale zilveroplossing werken. Verdun 2,5 mL ammoniakale zilveroplossing voorraad met 7,5 mL gedestilleerd water. Één keer gebruiken en vervolgens verwijderen.
Let op: Vermijd contact en inhalatie. Gebruik een zuurkast. - 0,1% goud chloride bereiden. Bereiden 1 mL 10% goud chloride en 99 mL gedestilleerd water toe te voegen in een maatkolf. Dagelijks vers bereid.
- Bereiden fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). Voeg 8 g NaCl, 0.2 g van KCl, 1,44 g nb2HPO4 en 0,24 g KH2PO4 in 800 mL gedestilleerd water. Breng de pH op 7.4 met HCl. Dilute het resulterende mengsel 1 L (eindvolume) met gedestilleerd water.
- Bereid natrium thiosulfate-oplossing van 5% (m/v) opgelost in gedestilleerd water.
2. cel cultuur en behandeling
- Verkrijgbare B16F10 cellen worden gebruikt. De B16F10 cellen in volledige medium handhaven. Houd de cel cultuur kolf in een bevochtigde, 5% CO2 sfeer incubator bij 37 ° C.
- Test verbindingen, positieve controle van de Inhibitor van de omwenteling, en negatieve controlemonsters voorbereiden.
- Los van de verbindingen van de test in de geschikte oplosmiddelen. Ontbinden wateroplosbare verbindingen in tweemaal gedestilleerd water. Water onoplosbare stoffen in passende organisch oplosmiddel, bijvoorbeeldontbinden., DMSO.
- Hier, gebruik Arbutine als positieve controle op de activiteiten van de verdikking in vergelijking met test verbindingen of een negatieve controle beoordelen in tweemaal gedestilleerd water (125 μg/mL) opgelost. Als een negatieve controle (voertuig-behandeld), gebruik maken van de oplossingen of buffers gebruikt in het monster, bijvoorbeeld, tweemaal gedestilleerd water, DMSO, ethanol.
- Cel zaaien en behandeling
- Zaad B16F10 cellen op 5 × 10-4 cellen per putje in 24-well cultuur platen met volledige medium en broeden in een CO2 incubator gedurende 24 uur. Na incubatie, gecombineerd het volledige medium.
- Incubeer de cellen met medium van de DMEM (zonder FBS en 1% penicilline/streptomycine) dat test verbindingen, een inhibitor van de omwenteling-besturingselement, of een negatieve controle in een CO2 incubator voor 72 h. selectievakje cellen elke 24 uur onder de Microscoop. Na deze stap, ga naar stap 3-5 voor verdere experimenten.
Let op: Het mengsel van de teststof en DMEM medium moet worden gefilterd door een filter van 0,2 micrometer.
3. meting van de cellulaire Tyrosinase-activiteit
- Met behulp van de methode beschreven in stap 2, verwijderen van media en spoel tweemaal met 300 μL van koude PBS cellen.
- Plaats de cel cultuur plaat op ijs. Voeg 300 μL van lysis buffer en incubeer gedurende 5 min. Vervolgens verzamelen de lysate met behulp van een cel schraper cel en de cel lysate overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis.
- Meng de cel lysate met een homogenizer van de cel bij 14.500 TPM voor 2 s, 3 keer op ijs te verkrijgen van intracellulaire tyrosinase. Gebruik de optimale conditie specifiek voor de homogenizer.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 12.000 × g bij 4 ° C en de cel supernatant overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis. Houd op ijs terwijl in gebruik.
- 70 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een 96-Wells duidelijk polystyreen microplate.
- Toevoegen van 140 μL van een oplossing met tyrosinase substraat (DOPA) naar een 96-Wells duidelijk polystyreen microplate, schud voorzichtig en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Optioneel, 70 μL van 100 U/mL paddestoel tyrosinase oplossing toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Meten van de tyrosinase-activiteit bij een golflengte van 475 nm met behulp microplate-lezer.
- Normaliseren de tyrosinase-activiteit aan de eiwitconcentratie van elk monster. Meet de eiwitconcentratie van elk monster door een analyse van Bradford.
4. meten van melanine inhoud
- Met behulp van de methode die is beschreven in stap 2, verwijderen van media en spoel tweemaal met 300 μL van koude PBS cellen.
- Plaats de cel cultuur plaat op ijs. Voeg 300 μL van lysis buffer en incubeer gedurende 5 min. Vervolgens verzamelen de lysate met behulp van een cel schraper cel en de cel lysate overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 12.000 × g bij 4 ° C.
- Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en maatregel totaal eiwitconcentratie voor normalisatie. Meet de eiwitconcentratie van elk monster door een analyse van Bradford.
- 300 μL van 1 N NaOH toevoegen aan elke pellet en Incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur.
- Centrifugeer de opgeloste oplossing voor 10 min bij 12.000 × g bij 4 ° C.
- 200 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een 96-Wells-microplate.
- Meten van de melanine inhoud bij een golflengte van 400 nm.
- Normaliseren van de melanine inhoud aan de eiwitconcentratie.
5. Fontana – Masson kleuring
- Fontana-Masson kleuring
- Wassen cellen tweemaal met 300 μL van koude PBS.
- 200 μl van 10% formaline toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Spoelen met gedistilleerd water.
- Voeg 200 μl voorverwarmde ammoniumstikstof zilver werkoplossing en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, of totdat de cellen geel/bruin van kleur worden.
Let op: Plaats van vers gemengde ammoniumstikstof zilveren werkoplossing in een waterbad 58-60° C en laat voldoende tijd voor de temperatuur equilibreer. - Verwijder ammoniumstikstof zilver werkoplossing en naspoelen met gedestilleerd water.
- Verwijder gedestilleerd water. Voeg 200 μL van 0,1% goud chloride en incubeer gedurende 2 min op RT.
- Verwijderen van 0,1% goud chloride oplossing en naspoelen met gedestilleerd water.
- Verwijder gedestilleerd water. Voeg 200 μL van natrium thiosulfate oplossing (5%, w/v) en incubeer gedurende 2 min.
- Verwijderen van natrium thiosulfate oplossing en naspoelen met gedestilleerd water.
- Verwijder gedestilleerd water. Voeg 200 μL van nucleaire snel rood en incubeer gedurende 5 min.
- Verwijderen van nucleaire snel rood en spoel met leidingwater.
- Verwijderen van leidingwater en observeren van de gekleurde cellen onder een microscoop.
- Fontana-Masson kleuring (drempel analyse met behulp van ImageJ)
Opmerking: Een voorbeeld van het imago-analyseprocedure ImageJ softwarematig wordt weergegeven in de aanvullende materialen.- Open het programma ImageJ.
- Selecteer bestand | Open | Microscoop afbeelding.
- Selecteer afbeelding | Aanpassen | Kleur drempel.
- Voor het meten van het gebied dat is gekleurd met Fontana – Masson, de lat helderheid parameter op nul en aanpassen van de helderheid-balk om te zoeken naar het punt waarop alle gekleurde cellen (zwart of donker bruin) opgenomen.
- Selecteer analyseren | Analyseren van deeltjes. Schakel het selectievakje samenvatten in het venster van de deeltjes analyseren en druk op OK. Het summiere resultaat verkrijgen en plak in een werkblad.
Opmerking: De beschrijving van de resulterende vak parameters zijn als volgt:
Segment: Naam van elke afbeelding
Aantal: Aantal gekleurde cellen
Totale oppervlakte: Totale oppervlakte van de getelde cellen
Gemiddelde grootte: Totale gebied/Count
% Gebied: gekleurd gebied/totaal gebied × 100%; totale oppervlakte wordt automatisch berekend. - Bereken de relatieve gebied gekleurd met melanine met behulp van de waarde van de totale oppervlakte.
Relatieve melanine gekleurd gebied (%) = waarde van cellulaire oppervlakte van test sample/gemiddelde oppervlakte van controle × 100, dat wil zeggen,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten voor de activiteit van de verdikking van de Arbutine, een anti-melanogenic samengestelde, in B16F10 melanocyten staan hieronder. Figuur 1A blijkt dat Arbutine sterk onderdrukt de cellulaire tyrosinase-activiteit in vergelijking met de controle van voertuig-behandeld. Ook was de melanine inhoud van cellen gestimuleerd met Arbutine aanzienlijk verminderd in vergelijking met de besturingselementen (figuur 1B). Microscopische beelden van cellen gekleurd met Fontana-Masson vlek worden weergegeven in Figuur 1 c. Arbutine behandeling daalde het gebied van zwart pigment in vergelijking met het besturingselement.
Figuur 1 : Arbutine onderdrukt melanogenesis in de melanocyten. B16F10 cellen werden behandeld met Arbutine (125 μg/mL) voor 72 h. A. Cellulaire tyrosinase-activiteit. B. melanine inhoud. C. melanine werd gevisualiseerd met Fontana-Masson vlek. Gegevens zijn de middelen ± SEM (n = 4). Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de Student t-test (p -waarden < 0.05 werden beschouwd als statistisch significant). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij presenteerden protocollen voor de beoordeling van de activiteit van de verdikking van de test verbindingen met behulp van gekweekte melanocyten. De representatieve resultaten toonde het effect van de verdikking van de Arbutine, een tyrosinase-remmer die geremd tyrosinase-activiteit en cellulaire melanine inhoud. Deze methoden worden veel gebruikt in anti-melanogenic activiteit onderzoek. Met behulp van deze tests, hebben we ook met succes verschillende bioactieve stoffen die melanogenesis remmende effecten op B16F10 cellen in het verleden hebben vastgesteld decennium9,10,11,12, 13 , 14.
Melanine wordt geproduceerd door melanosomes in verschillende pigment cellen, met inbegrip van melanocyten in de huid. In deze studie gebruikten we B16F10 melanoom cellen die melanine, waardoor het kweekmedium produceren tot donker bruin of zwart15. Primaire melanocyten zou biologisch belangrijke instrumenten voor het bestuderen van in vivo effecten, maar wegens hun beperkte proliferatieve capaciteit en de variabiliteit in fenotypen gegenereerd, gekweekte melanocyten worden beschouwd als een betrouwbare in-vitro model16. Melanogenesis van de cellijn van deze is vergelijkbaar met die van de primaire melanocyten. Deze methode vertegenwoordigt de cellulaire omgeving beter dan de paddestoel tyrosinase-activiteit assay, waarin het enzym is direct geïncubeerd met de substraat en verdikking teststof.
Voordat u deze experimenten uitvoert, kan het nodig zijn om het 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay of vergelijkbare tests, zoals de cel violet assay, met de test verbinding(en) te voeren zijn. Als een teststof invloed op celproliferatie of cytotoxiciteit vertoont, dan melanocyt groei zouden kunnen worden aangetast, en de resultaten misschien niet correct vertegenwoordigen de cellulaire tyrosinase-activiteit. Chemicaliën of natuurlijke stoffen hebben vaak enkele cytotoxiciteit bij hoge concentraties, en dit is vooral belangrijk voor stoffen met milde activiteit. Het is ook niet ongewoon voor stoffen en natuurlijke extracten ter bevordering van cel proliferatie en differentiatie. Bijgevolg, het potentieel voor extra topicale celgroei veroorzaakt moet worden onderzocht, hoewel deze effecten op de celgroei kunnen worden aangepast door het normaliseren van de activiteit met de eiwitconcentratie.
Verschillende mechanismen kunnen resulteren in hypopigmentatie onafhankelijk van tyrosinase-activiteit. Melanogenesis is een complexe biosynthetic traject waarbij meerdere signaaltransductie trajecten en transcriptie factor activiteiten17. De expressie van belangrijke genen en proteïnen en melanogenic signaaltransductie trajecten kan daarom worden bestudeerd voor een diepgaande studie van hypopigmentatie. MITF is een belangrijke transcriptiefactor in melanogenesis en α-melanocyt-stimulerende hormoon (α-MSH) kan stimuleren melanogenic signaaltransductie trajecten18,19. Afhankelijk van hun bekende biologische kenmerken, kunnen verwante signaaltransductie trajecten verder worden bestudeerd.
Bij het meten van melanine inhoud, moeten de verkregen waarden ook worden genormaliseerd door de eiwitconcentratie, zodat de resultaten correct de melanine inhoud per cel of per cultuur gebied20 vertegenwoordigen. Bovendien, wordt fenol-rood-free medium aanbevolen in de samengestelde behandeling stap om te voorkomen dat de negatieve effecten van fenol rood op de absorptie.
Voor de melanine kleuring, gebruikten we de Fontana-Masson vlek, die argentaffin stoffen, detecteert zoals melanine en argentaffin cellen21. Deze techniek wordt ook gebruikt voor paraffine of bevroren sectie monsters na de deparaffinization stap. De in dit experiment gebruikte reagentia zijn schadelijk; contact en inhalatie moeten worden vermeden, en de reagentia moeten alleen worden gebruikt in een zuurkast waar mogelijk. Na kleuring, wordt ImageJ gebruikt voor het berekenen van de gebrandschilderde gebied. Met Fontana-Masson kleuring, kan het moeilijk te interpreteren zwakke vlekken in dunbevolkte positieve cellen; Dit is echter niet een probleem voor melanine-rijke melanocyten. De zilvernitraat, ammoniumstikstof zilver, natrium thiosulfate en ammoniumhydroxide gebruikt in de experimenten moeten voorzichtig behandeld worden als gevolg van hun toxiciteit.
Dit zijn de algemeen gebruikte methoden op het gebied van melanogenesis en verdikking zijn, omdat ze snelle, handige, rendabele en betrouwbare zijn. Deze methoden kunnen nuttig zijn voor onderzoekers die willen identificeren van nieuwe verbindingen of extracten met anti-melanogenic of pro-melanogenic activiteiten. Ze kunnen ook worden gebruikt om de celgroei melanocyt of cellulaire activiteit te beoordelen. Een beperking is de reproduceerbaarheid van de resultaten op de menselijke huid, dat is een complex orgaan waarin homeostase wordt beheerd in reactie op verschillende ecologische, chemische en biologische factoren. Hypopigmentatie agenten bevestigd door in vitro methoden hebt daarom geen significante effecten op de menselijke huid in vivo.
Kortom zijn deze protocollen een belangrijke eerste stap in de screening test compounds voor hun remmende effecten op de melanogenesis. Wij stellen voor dat deze methoden niet alleen het remmende effect op melanogenesis, maar ook de betrokken mechanisme kunnen uitleggen. Nadat bioactieve kandidaat-verbindingen zijn geïdentificeerd, verder testen kan leiden tot studies van de biologische mechanismen of commerciële toepassingen, gevolgd door in vivo gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen aan verslag.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Korea Instituut voor Planning en evaluatie voor technologie in voedsel, landbouw en bosbouw (IPET) via de Agri-dierziekte Technology Development Program, gefinancierd door het ministerie van landbouw, voedsel en plattelandsontwikkeling zaken (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) en de School van de biowetenschappen en de biotechnologie voor BK21 PLUS, Universiteit van Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F.
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E.
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
