Summary
Vi beskriver tre eksperimentelle metoder for å vurdere hypopigmentation aktiviteten av kjemikalier i vitro: kvantifisering av 1) mobilnettet tyrosinase aktivitet og 2) melanin innhold og 3) måling av melanin av mobilnettet melanin flekker og bilde analyse.
Abstract
Denne studien presenterer laboratorium metoder for kvantifisering av hypopigmentation aktivitet i vitro. Melanin, store pigment i melanocytter, er syntetisert svar på flere mobilnettet og miljømessige faktorer. Melanin beskytter hudceller fra ultrafiolett skade, men har også Biofysiske og biokjemiske funksjoner. Overdreven produksjon eller akkumulering av melanin i melanocytter føre dermatologiske problemer, for eksempel fregner, mørke flekker, melasma og føflekker. Kontroll av melanogenesis med hypopigmentation agenter er derfor viktig for personer med klinisk eller kosmetisk behov. Melanin er primært syntetisert i melanosomes av melanocytter i en kompleks biokjemiske prosess kalt melanogenesis, som er påvirket av ytre og indre faktorer, som hormoner, betennelse, alder og ultrafiolett lys eksponering. Vi beskriver tre metoder for å bestemme hypopigmentation aktiviteten av kjemikalier eller naturlige stoffer i melanocytter: måling av 1) mobilnettet tyrosinase aktivitet og 2) melanin innhold og 3) flekker og kvantifisere mobilnettet melanin med bilde analyse.
I melanogenesis gir tyrosinase hastighetsbegrensning trinnet som konverterer L-Tyrosin til 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) og deretter til dopaquinone. Hemming av tyrosinase er derfor en primær hypopigmentation mekanisme. I kulturperler melanocytter, kan tyrosinase aktivitet kvantifiseres ved å legge L-DOPA som et substrat og måle dopaquinone produksjon av spectrophotometry. Melanogenesis kan også måles ved kvantifisere melanin innholdet. Melanin inneholder mobilnettet brøken ekstraheres med NaOH og melanin er kvantifisert spektrofotometrisk. Endelig kan melanin innholdet kvantifiseres av bildeanalyse etter Fontana-Masson farging av melanin. Selv om resultatene av disse in vitro analyser ikke kan alltid gjengis i menneskelig hud, er disse metodene mye brukt i melanogenesis forskning, spesielt som første skritt å identifisere potensielle hypopigmentation aktivitet. Disse metodene kan også brukes til å vurdere melanocyte aktivitet, vekst og differensiering. Konsistente resultater de tre forskjellige metoder sikre gyldigheten av effekten.
Introduction
Melanin spiller en avgjørende rolle i fysiologi, patologi og toksikologi flere organer inkludert hud, øyne og hjernen1. Hovedfunksjoner av melanin er Foto-screening og biokjemiske effekter. Melanin absorberer nær infrarød og synlig lys samt ultrafiolett (UV) stråling, med økt absorpsjon priser på kortere bølgelengder av lys; dermed beskytter melanin vev fra skader forårsaket av synlig lys eller UV stråling2. Melanin er en antioksidant og har en affinitet for metaller og andre giftige kjemikalier; Det kan derfor beskytte vev fra oksidativt og kjemiske stress3. Men forårsaker overdreven produksjon av melanin dermatologiske problemer.
Kvantitet og kvalitet av melanin i huden og iris er de viktigste faktorer som bestemmer fargen av iris og hud. Enkeltpersoner kan ha forskjellige huden fargen preferanser; noen favoriserer garvet hud, mens andre favorisere lysere hud farger. Avhengig av disse konsument-profiler, er hypopigmentation kosmetikk utviklet for å tilfredsstille enkelte markeder for favoriserte huden farger4. Følgelig er studier av hypopigmentation og anti-melanogenic viktige både vitenskapelig og praktisk.
Melanogenesis er den komplekse prosessen med melanin biosyntesen gjennom en rekke enzymatisk og spontan kjemiske reaksjoner i melanocytter. En melanocyte er omgitt av ca 36 keratinocytter melanocyttene er melanin syntese fabrikkene som distribuerer sine produkter til nærliggende keratinocytter. I huden transporteres melanin produsert og lagret i melanosomal rommet av melanocytter til nabokommunene keratinocytter i overhuden via dendrites.
L-Tyrosin fungerer som første underlaget for melanogenesis og enzym-tyrosinase gir to påfølgende reaksjoner som konverterer L-Tyrosin til 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og deretter til dopaquinone. Disse reaksjonene er hastighetsbegrensningen trinnet i melanogenesis5,6. Hypopigmentation aktivitet kan derfor først måles ved å vurdere mobilnettet tyrosinase aktivitet direkte. Gjør melanocyte ekstrakter som inneholder tyrosinase er ruges med DOPA og dopaquinone produsert i prøvene kan måles ved spectrophotometry på 475 nm. Verdiene er normalisert av protein konsentrasjoner av prøver og stoffer med hypopigmentation aktivitet resultere i mindre dopaquinone formasjon sammenlignet med kontrollene.
Dernest kan hypopigmentation aktivitet kvantifiseres ved å måle melanin i kulturperler melanocytter direkte. Etter behandling av celler med test materialet, trekkes melanin under alkaliske forhold og melanin innholdet er kvantifisert ved spectrophotometry på 400 nm. En hypopigmentation agent vil resultere i en lavere melanin innhold enn det kontroller7.
Endelig kan hypopigmentation aktiviteten kvantifiseres Fontana-Masson melanin flekker og påfølgende bildeanalyser. Fontana-Masson flekker, melanin granulater redusere ammoniakk-sølv nitrat til en synlig svart metallic tilstand og svarte områder av celler i mikroskop-bildene representerer mengden av melanin.
En hypopigmentation agent gir vanligvis konsekvent og sammenlignbare resultater med disse tre metoder, som bekrefter at aktiviteten av stoffet er gyldig. Alternativt kan det være nyttig å måle uttrykk for viktige gener og proteiner i melanogenesis svar på test stoff som undersøke hypopigmentation aktivitet. Tyrosinase er tyrosinase-relaterte proteiner (TRP-1) og dopachrome tautomerase (TRP-2) viktige enzymer i melanogenesis8. Den transkripsjon faktor mikroftalmi-assosiert transkripsjon faktoren (MITF) er en mester regulator i melanogenesis og måling av genet/protein uttrykk nivåene eller en promoter aktivitet analysen kan også brukes til å vurdere hypopigmentation aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Medium, forbindelser og reagenser
- Forberede B16F10 veksten komplett mediet. Supplement Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (PEST).
- For å gjøre 500 mL komplett medium, bland 445 mL av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 50 mL av FBS og 5 mL av PEST i en 1 L steriliserte glassflaske. Etter miksing forsiktig, filtrere mediet gjennom et 0,2-µm plastflaske-top filter til en ny steriliserte glassflaske og deretter lagre på 4 ° C.
Advarsel: Alle celle kultur teknikker bør foretas i mikrobiologisk sikkerhet regjering bruke steril teknikk for å sikre sterilitet.
- For å gjøre 500 mL komplett medium, bland 445 mL av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 50 mL av FBS og 5 mL av PEST i en 1 L steriliserte glassflaske. Etter miksing forsiktig, filtrere mediet gjennom et 0,2-µm plastflaske-top filter til en ny steriliserte glassflaske og deretter lagre på 4 ° C.
- Forberede lyseringsbuffer: 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane med 0,1% Triton X-100 (v/v) buffer ved pH 7.5 (pH justert med HCl). Denne bufferen kan brukes for 3 måneder når oppbevares ved romtemperatur (RT). Legge til proteasehemmere lyseringsbuffer rett før bruk.
- Forberede tyrosinase hemmer analysebuffer. Forberede 1 M NaH2PO4 (monobasic) og 1 M Na2HPO4 (dibasic) lager løsninger. Bland 46.3 mL Na2HPO4 og 53.7 mL NaH2PO4 å forberede et endelig antall 0.1 M natrium fosfatbuffer (pH 6.8).
- Fortynne resulterende blandingen til 1 L (siste volum) med H2O. justere pH i den endelige løsningen til 6.8. Denne bufferen kan brukes for 1 måned når lagret på 4 ° C.
- Forbered tyrosinase: 0,1% 3,4-dihydroxy-L-fenylalanin (DOPA, w/v) oppløst i tyrosinase hemmer analysebuffer (se trinn 1.3).
Advarsel: Hold på isen i bruk. - Du kan også forberede 100 U/mL sopp tyrosinase. Oppløse den lyofilisert sopp tyrosinase i tyrosinase hemmer analysebuffer. Denne løsningen kan brukes for 2 måneder når lagret på –20 ° C. Den sopp tyrosinase aktivitet i tillegg til mobilnettet tyrosinase aktivitet beregnes nær cellen materialer.
FORSIKTIG: Løsningen er aliquoted før frysing så gjentatt frysing og tining kan unngås. Holde løsningen på isen i bruk. - Forberede 1 N NaOH løsning. Veie 4 g av NaOH i en volumetriske bolle og oppløse den i destillert vann for å lage 100 mL.
- Forberede fiksering løsning (10% formalin). Fortynne 27 mL 37% formaldehyd med 73 mL destillert vann. Forberede fersk hver dag.
- Forberede ammoniacal sølv lagerløsning. Forberede 5 mL av 10% Sølvnitrat løsningen i en volumetriske kolbe. Legg ammonium hydroksid løsning dropwise, før utløse er fullstendig oppløst. Tilsett 200 μL Sølvnitrat løsning (10%). Løsningen blir litt skyet.
FORSIKTIG: Unngå kontakt og innånding. Bruk avtrekksvifte. - Forberede ammoniacal en fungerende løsning. Fortynne 2,5 mL av ammoniacal sølv lager løsning med 7,5 mL destillert vann. Bruke én gang og deretter kaste.
FORSIKTIG: Unngå kontakt og innånding. Bruk avtrekksvifte. - Forberede 0,1% gull chloride. Forberede 1 mL av 10% gull klorid og legge til 99 mL destillert vann i en volumetriske kolbe. Forberede fersk hver dag.
- Forberede fosfat buffer saltvann (PBS). Legge til 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 i 800 mL destillert vann. Justere pH 7,4 med HCl. Dilute resulterende blandingen til 1 L (siste volum) med destillert vann.
- Forberede 5% (w/v) natrium tiosulfat løsning oppløst i destillert vann.
2. celle kultur og behandling
- Bruke kommersielt tilgjengelige B16F10 celler. Opprettholde B16F10 cellene i fullstendig medium. Holde celle kultur flasken i en fuktet, 5% CO2 atmosfære inkubator på 37 ° C.
- Forberede testen forbindelser, hemmer positiv kontroll og negativ kontroll prøver.
- Oppløse de test forbindelsene i de aktuelle løsemidlene. Oppløse vannløselige forbindelser i dobbel-destillert vann. Oppløse vann uløselig forbindelser i passende organisk løsemiddel, f.eks., DMSO.
- Her, bruke arbutin oppløst i dobbel-destillert vann (125 μg/mL) som en positiv til å vurdere hypopigmentation aktiviteten sammenlignet med test stoffer eller en negativ kontroll. Som en negativ kontroll (kjøretøy-behandlet kontroll), bruke løsninger eller buffere brukes i testprøven, f.eks, dobbel-destillert vann, DMSO etanol.
- Såing og behandling
- Frø B16F10 celler på 5 × 104 celler/godt i 24-brønnen plater ved hjelp av komplett medium og ruge i en CO2 inkubator for 24 timer. Sug opp fullstendig mediet etter inkubasjon.
- Inkuber celler med DMEM medium (uten FBS og 1% penicillin/streptomycin) som inneholder enten test forbindelser, en inhibitor kontroll eller en negativ kontroll i en CO2 inkubator for 72 h. Sjekk celler hver 24 h under mikroskop. Etter dette trinnet, gå til trinn 3-5 for videre studier.
FORSIKTIG: Blandingen av testen stoffet og DMEM medium bør filtreres gjennom et 0,2 μm filter.
3. måle mobilnettet Tyrosinase aktivitet
- Med metoden beskrevet i trinn 2 Fjern medier og skyll celler to ganger med 300 μL kaldt PBS.
- Sett celle kultur plate på is. Legger 300 μL lyseringsbuffer og ruge i 5 min. Deretter samle cellen lysate bruker en celle skraper og overføre cellen lysate til en 1.5-mL microcentrifuge tube.
- Homogenize cellen lysate med en celle homogenizer på 14.500 rpm 2 s, 3 ganger på is å få intracellulær tyrosinase. Bruk betingelsen optimal spesifikke for homogenizer.
- Sentrifuge for 10 min 12.000 × g på 4 ° C og overføre cellen supernatant slik 1.5-mL microcentrifuge. Hold på isen i bruk.
- Overføre 70 μL nedbryting av til en 96-brønns klart polystyren microplate.
- Tilsett 140 μL av en løsning som inneholder tyrosinase substrat (DOPA) til en 96-brønns klart polystyren microplate riste forsiktig og ruge 2 h på 37 ° C.
- Valgfritt, tilsett 70 μL av 100 U/mL sopp tyrosinase løsning i hver brønn og Inkuber 2 h på 37 ° C.
- Måle tyrosinase aktivitet på en bølgelengde på 475 nm bruker microplate reader.
- Normalisere tyrosinase aktiviteten til protein konsentrasjonen av hvert utvalg. Måle protein konsentrasjonen av hver prøve av en Bradford analysen.
4. måle Melanin innhold
- Med metoden beskrevet i trinn 2 Fjern medier og skyll celler to ganger med 300 μL kaldt PBS.
- Sett celle kultur plate på is. Legger 300 μL lyseringsbuffer og ruge i 5 min. Deretter samle cellen lysate bruker en celle skraper og overføre cellen lysate til en 1.5-mL microcentrifuge tube.
- Sentrifuge for 10 min 12.000 × g på 4 ° C.
- Overføre nedbryting til en ny rør og måle totale protein konsentrasjon for normalisering. Måle protein konsentrasjonen av hver prøve av en Bradford analysen.
- Legger 300 μL 1 N NaOH til hver pellets og ruge ved 60 ° C i 1 time.
- Sentrifuge oppløst løsningen for 10 min 12.000 × g på 4 ° C.
- Overføre 200 μL nedbryting av til en 96-brønnen microplate.
- Måle melanin innholdet på en bølgelengde på 400 nm.
- Normalisere melanin innholdet i protein konsentrasjonen.
5. Fontana-Masson flekker
- Fontana-Masson flekker
- Vask celler to ganger med 300 μL kaldt PBS.
- Tilsett 200 μL av 10% formalin hver brønn og Inkuber 1t på 4 ° C.
- Skyll med destillert vann.
- Tilsett 200 μL forvarmes ammoniacal sølv arbeider løsning og ruge 1t på 37 ° C eller til cellene blir gul/brun i fargen.
FORSIKTIG: Plasser fersk blandet ammoniacal en fungerende løsning i et vannbad for 58-60° C og gi tilstrekkelig tid for temperaturen å equilibrate. - Fjern ammoniacal sølv arbeider løsning og skyll med destillert vann.
- Fjern destillert vann. Tilsett 200 μL av 0,1% gull klorid og Inkuber i 2 minutter på RT.
- Fjerne 0,1% gull chloride løsning og skyll med destillert vann.
- Fjern destillert vann. Tilsett 200 μL av natrium tiosulfat løsning (5%, w/v) og ruge i 2 minutter.
- Fjerne natrium tiosulfat løsning og skyll med destillert vann.
- Fjern destillert vann. Tilsett 200 μL av kjernefysiske Fast rødt og ruge i 5 min.
- Fjerne kjernefysiske Fast rødt og skyll med vann fra springen.
- Fjerne vann fra springen og observere farget cellene under et mikroskop.
- Fontana-Masson flekker (terskel analyse bruker ImageJ)
Merk: Et eksempel på bildet analyse prosedyren bruker ImageJ programvare vises i tilleggsresultater materialer.- Åpne programmet ImageJ.
- Velg fil | Åpne | Mikroskopet bildet.
- Velg bilde | Justere | Farge terskelen.
- For å måle modulen med Fontana-Masson, sette parameteren lysstyrkelinjen til null og justere lysstyrkelinjen for å finne punktet der alle farget celler (svart eller mørk brun) er inkludert.
- Velg analysere | Analysere partikler. Merk Oppsummer i vinduet analyser partikler og trykk OK. Få Sammendrag resultatet og lime inn i et regneark.
Merk: Beskrivelse av resulterende boksen parametrene er som følger:
Skive: Navnet på hvert bilde
Antall: Antall farget celler
Totalareal: Areal av telles cellene
Gjennomsnittlig størrelse: Totale området/teller
% Området: farget området/totalt området × 100%. totalareal beregnes automatisk. - Beregne relative området beiset med melanin bruker verdien av areal.
Relativ melanin farget område (%) = verdi av total mobil test prøve/gjennomsnittlig areal av kontroll × 100, dvs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant resultatene for hypopigmentation aktivitet av arbutin, en anti-melanogenic sammensatte, i B16F10 melanocyttene er vist nedenfor. Figur 1A viser at arbutin betydelig undertrykt mobilnettet tyrosinase aktiviteten sammenlignet med bilen-behandlet kontrollen. Tilsvarende var melanin innholdet i cellene stimulert med arbutin betydelig redusert sammenlignet med kontrollene (figur 1B). Mikroskopiske bilder av celler med Fontana-Masson flekken er vist i figur 1 c. Arbutin behandling redusert området av svart pigment sammenlignet med kontrollen.
Figur 1 : Arbutin undertrykt melanogenesis i melanocytter. B16F10 celler ble behandlet med arbutin (125 μg/mL) for 72 h. A. Mobilnettet tyrosinase aktivitet. B. Melanin innhold. C. Melanin var visualisert med Fontana-Masson flekken. Data er betyr ± SEM (n = 4). Statistiske sammenligninger ble utført med Student t-test (p -verdier < 0,05 ble ansett å være statistisk signifikant). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presentert protokoller for evaluering av hypopigmentation aktiviteten til test forbindelser med kulturperler melanocytter. Representant resultatene viste hypopigmentation effekten av arbutin, en tyrosinase inhibitor som hemmet tyrosinase aktivitet og cellular melanin innhold. Disse metodene er mye brukt i anti-melanogenic aktivitet forskning. Bruker disse analyser, vi har også identifisert flere bioaktive forbindelser som har melanogenesis hemmende effekt på B16F10 celler i siste tiåret9,10,11,12, 13 , 14.
Melanin er produsert av melanosomes i ulike pigment cellene, inkludert melanocytter i huden. I denne studien brukte vi B16F10 melanom cellene som produserer melanin, som forårsaker kultur medium å bli mørk brun eller svart15. Primære melanocytter kan være biologisk viktig verktøy for å studere i vivo effekter, men deres begrenset proliferativ kapasitet og variasjon i fenotyper generert, kultivert melanocytter anses som en pålitelig i vitro modell16. Melanogenesis av denne cellen linjen sammenlignes med de av primære melanocytter. Denne metoden representerer bedre mobilnettet miljø enn sopp tyrosinase aktivitet analysen, der enzymet er direkte ruges med substrat og hypopigmentation test sammensatte.
Før du utfører disse eksperimentene, kan det være nødvendig å utføre 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysen eller sammenlignbare analyser, for eksempel celle fiolett analysen, med test-compound(s). Hvis en test stoff påvirker celle spredning eller utstillinger cytotoksisitet, deretter melanocyte vekst kan påvirkes, og resultatene kan ikke riktig representerer mobilnettet tyrosinase aktiviteten. Kjemikalier eller naturlige stoffer har ofte noen cytotoksisitet på høye konsentrasjoner, og dette er spesielt viktig for stoffer med mild aktivitet. Det er også ikke uvanlig at stoffer og naturlige ekstrakter å fremme celle spredning og differensiering. Følgelig bør potensialet for ytterligere bioactivity forårsaker cellevekst undersøkes, selv om disse effektene på cellevekst kan justeres ved å normalisere aktiviteten med protein konsentrasjonen.
Ulike mekanismer kan føre hypopigmentation uavhengig av tyrosinase aktivitet. Melanogenesis er en kompleks biosyntetiske veien som involverer flere signaltransduksjon trasé og transkripsjon faktor aktiviteter17. Derfor kan uttrykk for viktige gener og proteiner og melanogenic signaltransduksjon trasé undersøkes for en grundig studie av hypopigmentation. MITF er en viktig transkripsjon faktor i melanogenesis α-melanocyte-stimulerende hormone (α-MSH) kan stimulere melanogenic signal signaltransduksjon trasé18,19. Avhengig av sine kjente biologiske egenskaper, kunne relaterte signaltransduksjon trasé bli studert videre.
Når måle melanin innhold, bør gis verdiene også normaliseres ved at protein, slik at resultatene skal representere melanin innholdet per celle eller per kultur området20. I tillegg anbefales fenol-rød-fri medium i sammensatte behandling trinn å unngå de negative effektene av fenol red på absorbance.
For melanin flekker, brukte vi Fontana-Masson flekken, som oppdager argentaffin stoffer, slik som melanin og argentaffin celler21. Denne teknikken brukes også for parafin eller frosne delen prøver etter deparaffinization trinn. Reagenser i dette eksperimentet er skadelig; kontakt og innånding bør unngås og reagensene skal brukes bare i avtrekksvifte mulig. Etter brukes ImageJ til å beregne stained området. Fontana-Masson flekker, kan det være vanskelig å tolke svak farging i tynt positiv celler. men kan dette ikke være et problem for melanin-rik melanocytter. Den sølv nitrat, ammoniacal sølv, natrium tiosulfat og ammonium hydroksid brukes i forsøkene bør håndteres med forsiktighet på grunn av deres toksisitet.
Dette er mye brukt er metoder i melanogenesis og hypopigmentation fordi de er raske, praktiske, kostnadseffektive og pålitelige. Disse metodene kan være nyttig for etterforskerne som vil identifisere romanen forbindelser eller ekstrakter med anti-melanogenic eller pro-melanogenic. De kan også brukes til å vurdere melanocyte cellevekst eller cellular aktivitet. En begrensning er reproduserbarhet av resultater på menneskelig hud, som er et komplisert organ som vedlikeholdes homeostase svar på ulike miljø, kjemiske og biologiske faktorer. Hypopigmentation agenter bekreftet av disse metodene i vitro har derfor ikke signifikante effekter på menneskelig hud i vivo.
Oppsummert er disse protokollene et viktig første skritt i screening test forbindelser for deres hemmende effekt på melanogenesis. Vi foreslår at disse metodene kan forklare ikke bare hemmende effekt på melanogenesis, men også mekanismen involvert. Når bioaktive kandidat forbindelser er identifisert, ytterligere testing kan føre til studier av de biologiske mekanismer eller kommersielle programmer, etterfulgt av i vivo bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer rapporten.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Korea Institute for treningsplanlegging og -analyse for teknologi i mat og jordbruk skogbruk (IPET) gjennom Agri-Bioindustry teknologi utvikling programmet, finansiert av Landbruksdepartementet, Food and Rural Affairs (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) og skolen av biovitenskap og bioteknologi for BK21 pluss, Universitetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F.
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E.
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
