Summary
Biz kimyasallar tüp bebek hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için üç deneysel yöntemleri tarif: miktar 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve 3) melanin hücresel melanin boyama ve görüntü analizi tarafından ölçümü.
Abstract
Bu çalışmada miktar hipopigmentasyon faaliyet tüp bebek için laboratuvar yöntemleri sunar. Melanin, melanosit, büyük pigment birden çok hücresel ve çevresel faktörler cevaben sentezlenir. Melanin cilt hücrelerini ultraviyole zararlardan korur, ama aynı zamanda biyofiziksel ve biyokimyasal işlevleri vardır. Aşırı üretimi veya melanosit melanin birikimi çiller, siyah noktaları, melazma ve benler gibi dermatolojik sorunlara neden olabilir. Bu nedenle, hipopigmentasyon ajanlar ile melanogenesis kontrolünü klinik veya kozmetik ihtiyaçları olan bireylerde önemlidir. Melanin öncelikle melanosit etkilenir melanogenesis dışsal olarak adlandırılan karmaşık biyokimyasal bir süreç ve hormonlar, iltihap, yaş ve ultraviyole ışık pozlama gibi Intrinsic faktörler melanosomes sentezlenir. Biz, kimyasal madde veya melanosit doğal maddelerin hipopigmentasyon etkinliğini belirlemek için üç yöntem tarif: 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve görüntü ile 3) Boyama ve sayısal hücresel melanin ölçüm analiz.
Melanogenesis, L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ve sonra dopaquinone içine dönüştürür hızı sınırlaması adım Tirozinaz tromboksan. Bu nedenle, Tirozinaz inhibisyonu bir birincil hipopigmentasyon mekanizmadır. Kültürlü melanosit içinde Tirozinaz etkinlik L-DOPA bir substrat ekleyerek ve dopaquinone üretim spectrophotometry tarafından ölçme sayısal. Melanogenesis da melanin içerik miktarının ölçmek. Melanin içeren hücresel kesir NaOH ile elde edilir ve melanin spectrophotometrically sayılabilir. Son olarak, melanin içerik Fontana-Masson melanin boyama aşağıdaki görüntü analizi tarafından sayılabilir. Her ne kadar bu tüp bebek deneyleri sonuçlarını insan cilt her zaman yeniden değil, bu yöntemler melanogenesis araştırma, potansiyel hipopigmentasyon etkinliği tanımlamak için özellikle ilk adımı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemler, melanosit etkinlik, büyüme ve farklılaşma değerlendirmek için de kullanılabilir. Üç farklı yöntem tutarlı sonuçlar etkileri geçerliliğini sağlamak.
Introduction
Melanin fizyolojisi, patoloji ve toksikoloji cilt, göz ve beyin1de dahil olmak üzere çeşitli organlarının kritik bir rol oynamaktadır. Büyük melanin fotoğraf-tarama ve biyokimyasal etkileri işlevlerdir. Melanin ultraviyole radyasyon, ışığın daha kısa dalga boyları artan emme oranları ile yanı sıra yakın kızılötesi ve görünür ışık emer; Böylece, melanin görünür ışık veya UV radyasyon2neden hasar dokuları korur. Melanin bir antioksidan ve metaller ve diğer toksik kimyasal maddeler için bir ilgi vardır; Bu nedenle, o-ebilmek korumak dokulara kimyasal ve oksidatif stres3. Ancak, aşırı melanin üretimini dermatolojik sorunlarına neden olur.
Miktar ve kalite melanin deride ve iris Iris ve cilt rengini en önemli belirleyicileri vardır. Bireyler farklı cilt renk tercihleri olabilir; diğerleri daha açık cilt renkleri lehine iken bazı tabaklanmış deri, iyilik. Bu tüketici profilleri bağlı olarak hipopigmentasyon kozmetik bireysel pazarlar için tercih cilt renkleri4karşılamak için geliştirilmiştir. Buna göre bilimsel ve pratik çalışmalar hipopigmentasyon ve anti-melanogenic aktivitesinin önemlidir.
Melanogenesis melanin biyosentezi melanosit vücudunda kimyasal reaksiyonlar enzimatik ve spontan bir dizi karmaşık işlemidir. Bir melanosit yaklaşık 36 lenfositi tarafından çevrilidir ve melanosit komşu lenfositi onların ürün dağıtmak melanin sentezini fabrikaları vardır. Deride, üretilen ve melanosit melanosomal bölümünde depolanan melanin dendrites epidermis ile komşu lenfositi için taşınır.
L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (BASINCIN) ve sonra dopaquinone içine dönüştürmek iki ardışık tepkileri melanogenesis ve enzim Tirozinaz için ilk substrat tromboksan L-Tyrosine hizmet vermektedir. Bu tepkiler melanogenesis5,6hızı sınırlaması adım vardır. Buna göre hipopigmentasyon etkinlik ilk doğrudan hücresel Tirozinaz etkinliğini değerlendirmek tarafından ölçülebilir. Bunu yapmak için melanosit özleri içeren Tirozinaz BASINCIN ile inkübe ve örnekleri üretilen dopaquinone spectrophotometry, 475 tarafından ölçülebilir nm. Değerleri örnekleri ve hipopigmentasyon faaliyet sonucu denetimleri ile karşılaştırıldığında daha az dopaquinone oluşumunda maddelerle protein konsantrasyonları tarafından normalleştirilmiş.
İkinci olarak, hipopigmentasyon etkinlik melanin kültürlü melanosit içinde doğrudan ölçerek sayısal. Test materyalini hücrelerle tedavi sonra melanin alkali koşullarda elde edilir ve melanin içerik spectrophotometry 400 tarafından sayısal nm. Hipopigmentasyon Ajan daha düşük bir melanin içerik denetimleri7daha neden olur.
Son olarak, hipopigmentasyon etkinlik Fontana-Masson melanin boyama ve sonraki görüntü analizi tarafından sayısal. Fontana-Masson boyama, melanin granülleri amonyak-gümüş nitrat görünür bir siyah metalik durumuna azaltmak ve hücrelerin mikroskobik görüntüler siyah alanlar melanin miktarı gösterir.
Hipopigmentasyon Aracısı genellikle hangi madde etkinliği geçerli olduğunu doğrular Bu üç yöntem ile tutarlı ve benzer sonuçlar verir. Alternatif olarak, bu ifade anahtar genler ve proteinler arasında melanogenesis yanıt hipopigmentasyon etkinliğini incelemek için bir test madde olarak ölçmek yararlı olabilir. Tirozinaz yanı sıra, Tirozinaz kaynaklı proteinler (TRP-1) ve dopachrome tautomerase (TRP-2) kritik melanogenesis8enzimlerdir. Transkripsiyon faktörü mikroftalmia ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) melanogenesis ve miktar onun gen/protein ifade düzeylerinin ana bir düzenleyicisidir veya bir organizatörü etkinliği tahlil hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. orta, bileşikler ve Kimyasalları hazırlanması
- B16F10 büyüme tam orta hazırlayın. Ek Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin (zararlı) değiştiren.
- 500 mL tam orta yapmak için Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 445 mL 50 mL FBS ve haşere 1 L steril cam şişede 5 mL ile karıştırın. Hafifçe karıştırdıktan sonra orta yeni steril cam şişe ve 4 ° C'de sonra mağaza 0.2 µm şişe-üst filtre ile filtre uygulama
Dikkat: Tüm hücre kültürü teknikleri Mikrobiyolojik Güvenlik kısırlık sağlamak için aseptik teknik kullanılarak kabine yapılmalıdır.
- 500 mL tam orta yapmak için Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 445 mL 50 mL FBS ve haşere 1 L steril cam şişede 5 mL ile karıştırın. Hafifçe karıştırdıktan sonra orta yeni steril cam şişe ve 4 ° C'de sonra mağaza 0.2 µm şişe-üst filtre ile filtre uygulama
- Lizis arabellek hazırlamak: % 0,1 Triton X-100 (v/v) arabellek (pH HCl ile düzeltilmiş) pH 7.5 içeren 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane. Bu arabellek-ebilmek var olmak kullanılmış için 3 ay (RT) oda sıcaklığında saklandığında. Proteaz inhibitörleri lizis arabellek kullanmadan önce ekleyin.
- Tirozinaz inhibitörü tahlil arabellek hazırlayın. 1 M NaH2PO4 (yem mono) ve 1 M Na2HPO4 (dibasic) stok çözümleri hazırlayın. 46.3 mL Na2HPO4 ve 53.7 mL 0.1 M sodyum fosfat tampon (pH 6.8) son hacmi hazırlamak için NaH2PO4 karıştırın.
- 1 L (son hacim) elde edilen karışıma H2O. ayarlama 6,8 için nihai çözüm pH sulandırmak. Bu arabellek-ebilmek var olmak kullanılmış için 1 ay 4 ° C'de saklandığında
- Tirozinaz substrat çözeltisi hazırlamak: %0,1 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (BASINCIN, w/v) çözünmüş Tirozinaz inhibitörü tahlil arabellekte (Adım 1.3 için bakınız).
Dikkat: buz kullanımda iken tutun. - İsteğe bağlı olarak, 100 U/mL mantar Tirozinaz hazırlayın. Lyophilized mantar Tirozinaz Tirozinaz inhibitörü tahlil arabelleği geçiyoruz. Bu eriyik-ebilmek var olmak kullanılmış için 2 ay –20 ° C'de saklandığında Mantar Tirozinaz etkinlik hem de hücresel Tirozinaz etkinliği hücre malzemeleri huzurunda hesaplanır.
Dikkat: böylece donma donma ve çözdürme önlenebilir tekrar önce bölünmemeli çözümdür. Çözüm buz kullanımda iken üzerinde tutun. - 1 N NaOH çözüm hazırlamak. Volumetric flask NaOH 4 g tartmak ve distile su 100 mL yapmak geçiyoruz.
- Fiksasyon çözüm (% 10 formalin) hazırlayın. 73 mL distile su ile % 37 formaldehit 27 mL seyreltik. Taze günlük hazırlayın.
- Ammoniacal gümüş hisse senedi çözüm hazırlamak. 5 mL % 10 gümüş nitrat çözeltisi içinde volumetric flask hazırlayın. Amonyum hidroksit çözüm dropwise, çökelti tamamen eriyene kadar ekleyin. Gümüş nitrat çözümü (% 10) 200 μL ekleyin. Belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak biraz bulutlu.
Dikkat: iletişim ve inhalasyon önlemek. Bir duman başlığı kullan. - Ammoniacal gümüş çalışma çözüm hazırlamak. Ammoniacal gümüş hisse senedi çözüm 2.5 mL 7,5 mL distile su ile sulandırmak. Bir kez kullanabilir ve sonra atın.
Dikkat: iletişim ve inhalasyon önlemek. Bir duman başlığı kullan. - %0,1 altın klorür hazırlayın. 1 mL % 10 altın klorür hazırlamak ve 99 mL distile su içinde volumetric flask ekleyin. Taze günlük hazırlayın.
- Fosfat tampon serum (PBS) hazırlayın. NaCl, 8 g 0.2 gram KCl, 1.44 g Na2HPO4 ve KH2PO4 800 mL distile su içinde 0,24 g ekleyin. HCl. Dilute 1 M'ye (son hacim) elde edilen karışımı ile distile su ile pH 7.4 için ayarlayın.
- %5 (w/v) sodyum thiosulfate çözeltisi distile suda hazırlayın.
2. hücre kültür ve tedavi
- Piyasada bulunan B16F10 hücreler kullanın. B16F10 hücreleri tam ortamda korumak. Oksijen, hücre kültürü şişeyi tutmak % 5 CO2 atmosfer kuluçka 37 ° C'de
- Test bileşikleri, inhibitörü pozitif kontrol ve negatif kontrol örnekleri hazır olun.
- Uygun çözücüler olarak test bileşikler geçiyoruz. Suda çözünen bileşikler çift distile suda çözülür. Uygun organik çözücü, örneğinsu çözünmez bileşikler geçiyoruz., DMSO.
- Burada, çift distile suda (125 μg/mL) çözünmüş arbutin test bileşikleri veya bir negatif kontrol ile karşılaştırıldığında hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için olumlu bir denetim olarak kullanın. Negatif bir denetim (Denetim araç tedavi) çözümler veya kullanılan test örneği, örneğin, çift distile su, DMSO, içinde arabellekleri kullanmak etanol.
- Hücre tohum ve tedavi
- Tohum B16F10 hücreleri 5 × 104 hücreleri/24-şey kültür levha tam orta kullanarak iyi ve CO2 kuluçka 24 h için kuluçkaya. Kuluçka sonra tam orta Aspire edin.
- (Olmadan FBS ve % 1 penisilin/streptomisin) DMEM orta test bileşikleri, inhibitörü kumanda veya CO2 kuluçka 72 h. onay hücreler mikroskop altında her 24 saat için bir negatif kontrol içeren hücreleri kuluçkaya. Bu adımdan sonra adım 3-5 daha fazla deneyler için gidin.
Dikkat: Bu test madde ve DMEM orta karışımı 0,2 mikron filtre ile filtre.
3. ölçme hücresel Tirozinaz etkinliği
- 2. adımda açıklanan yöntemi kullanarak, medyayı çıkarın ve soğuk PBS 300 μL iki kez hücrelerle durulayın.
- Hücre kültür plaka Buza koyun. 300 μL lizis arabelleği ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. Sonra hücreyi bir hücre kazıyıcı kullanarak lysate toplamak ve lysate hücre 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
- 14.500 devirde 2 için bir hücre homogenizer ile cep lysate homojenize s, hücre içi Tirozinaz elde etmek için 3 kez buz üzerinde. Homogenizer için en uygun koşul özel kullanın.
- 12.000 × g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve hücre süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Buz kullanımda iken üzerinde tutun.
- 70 μL süpernatant ile bir 96-şey açık polistren Mikroplaka aktarın.
- 140 μL Tirozinaz substrat (BASINCIN) bir 96-şey açık polistren Mikroplaka için içeren bir çözüm eklemek, yavaşça sallayın ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
- İsteğe bağlı, her şey için 70 μL 100 U/mL mantar Tirozinaz çözüm ekleyin ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
- Bir dalga boyu 475 adresindeki Tirozinaz etkinliği ölçmek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.
- Her örnek protein konsantrasyonu Tirozinaz faaliyete normalleştirmek. Her örnek protein konsantrasyonu tarafından Bradford tahlil ölçmek.
4. ölçüm Melanin içeriği
- 2. adımda açıklanan yöntemi kullanarak, medyayı çıkarın ve soğuk PBS 300 μL iki kez hücrelerle durulayın.
- Hücre kültür plaka Buza koyun. 300 μL lizis arabelleği ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. Sonra hücreyi bir hücre kazıyıcı kullanarak lysate toplamak ve lysate hücre 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
- Santrifüj için 12.000 × g 4 ° C'de 10 dakika
- Süpernatant normalleştirme için yeni bir tüp ve ölçü toplam protein konsantrasyonu aktarın. Her örnek protein konsantrasyonu tarafından Bradford tahlil ölçmek.
- 1 N NaOH 300 μL her Pelet ekleyin ve 1 h için 60 ° C'de kuluçkaya.
- Çözünmüş çözüm için 12.000 × g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
- 200 μL süpernatant, 96-şey Mikroplaka aktarın.
- 400 bir dalga boyu melanin içeriği ölçmek nm.
- Protein konsantrasyonu melanin içindekilere normalleştirmek.
5. Fontana-Masson boyama
- Fontana-Masson boyama
- Hücreleri iki kez soğuk PBS 300 μL ile yıkayın.
- Her şey için % 10 formalin 200 μL ekleyin ve 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- Distile su ile durulayın.
- Önceden ısıtılmış ammoniacal gümüş çözüm çalışma 200 μL ekleyin ve 1 h 37 ° C'de veya hücreleri sarı/kahverengi renkte olana için kuluçkaya.
Dikkat: Taze karıştırılmış ammoniacal gümüş çalışma çözüm bir 58 – 60 ° C su banyosunda yerleştirin ve equilibrate sıcaklık için yeterli zaman sağlar. - Ammoniacal gümüş çözüm çalışma kaldırmak ve distile su ile durulayın.
- Distile su kaldırın. %0,1 altın klorür 200 μL ekleyin ve RT. 2 min için kuluçkaya
- % 0.1 altın klorür çözümü kaldırmak ve distile su ile durulayın.
- Distile su kaldırın. Sodyum thiosulfate çözüm (%5, w/v) 200 μL ekleyin ve 2 min için kuluçkaya.
- Sodyum thiosulfate çözümü kaldırmak ve distile su ile durulayın.
- Distile su kaldırın. Nükleer hızlı kırmızı 200 μL ekleyin ve 5 min için kuluçkaya.
- Nükleer hızlı kırmızı kaldırmak ve musluk suyuyla durulayın.
- Musluk suyu çıkarın ve lekeli hücreler mikroskopla gözlemlemek.
- Fontana-Masson (eşik analizi kullanarak ImageJ) Boyama
Not: Ek malzemeler ImageJ yazılımını kullanarak görüntü analiz yordamı örneği görüntülenir.- ImageJ programını açın.
- Dosyayı seçin | Açık | Mikroskop görüntü.
- Görüntü seçin | Ayarlamak | Renk eşiği.
- Fontana-Masson ile lekeli alan ölçmek için parlaklık parametre çubuğu sıfır olarak ayarlayın ve hangi tüm lekeli hücreleri (siyah veya koyu kahverengi) dahil edilir noktası bulmak için parlaklık çubuğu ayarlayın.
- Seçin analiz | Parçacıklar analiz. Analiz parçacıkları penceresini özetleme kutusunda onay kutusunu seçin ve Tamam'ıtıklatın. Özet sonuçları elde etmek ve bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.
Not: Elde edilen kutusu parametrelerin açıklaması aşağıdaki gibidir:
Dilim: Her resmin adını
Sayısı: Lekeli hücre sayısı
Toplam alan: Toplam alan sınırlı sayıda hücre
Ortalama boyutu: Toplam alan sayısı /
% Alanı: alan/Toplam alan lekeli × %100; Toplam alan otomatik olarak hesaplanır. - Göreli hesaplamak alan Toplam alan değerini kullanarak melanin ile lekeli.
Göreli melanin lekeli alan (%) = test örnek/ortalama Toplam alan denetimi × 100, Yani, toplam hücresel alan değeri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbutin, bir anti-melanogenic temsilcisi sonuçları hipopigmentasyon etkinliği için melanosit aşağıda gösterilmektedir B16F10 bileşik. Şekil 1A o arbutin, önemli ölçüde araç tedavi denetimi ile karşılaştırıldığında hücresel Tirozinaz etkinlik bastırılmış gösterir. Benzer şekilde, hücre arbutin ile uyarılan melanin içerik önemli ölçüde denetimleri (şekil 1B) ile karşılaştırıldığında düşürüldü. Mikroskobik görüntüleri ile Fontana-Masson leke lekeli hücre şekil 1 ciçinde gösterilir. Arbutin tedavi alan siyah pigment denetimle göre azalmıştır.
Resim 1 : Arbutin bastırılmış melanosit melanogenesis. B16F10 hücreleri arbutin (125 μg/mL) için 72 h. A. ile tedavi edildi Hücresel Tirozinaz etkinlik. B. Melanin içerik. C. Melanin görselleştirildiği Fontana-Masson leke ile. Veri anlamına gelir ± SEM vardır (n = 4). İstatistiksel karşılaştırmalar gerçekleştirilen Öğrenci t-testi kullanarak (p değerleri < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz kültürlü melanosit kullanarak test bileşiklerin hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için protokol sundu. Temsil edici sonuçlar arbutin, Tirozinaz etkinlik ve hücresel melanin içerik inhibe bir Tirozinaz inhibitörü hipopigmentasyon etkisini gösterdi. Bu yöntemler anti-melanogenic aktivite araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu deneyleri kullanarak, biz de başarıyla geçmişte melanogenesis B16F10 hücreleri üzerinde inhibitör etkisi olduğu birçok biyoaktif bileşikler belirledik on yıl9,10,11,12, 13 , 14.
Melanin melanosomes deride melanosit dahil olmak üzere çeşitli pigment hücrelerdeki tarafından üretilmektedir. Bu çalışmada, biz orta kültür koyu kahverengi veya siyah15olmak neden olan melanin üretmek B16F10 Melanom hücreleri kullanılır. Birincil melanosit içinde vivo etkileri eğitimi için biyolojik olarak önemli araçlar olabilir ama sınırlı proliferatif kapasitelerini ve oluşturulan fenotipleri değişkenlik nedeniyle, kültürlü melanosit güvenilir tüp bebek modeli16kabul edilir. Bu hücre kültürünü Melanogenesis bu birincil melanosit ile karşılaştırılabilir. Bu yöntem daha iyi hangi enzim doğrudan bileşik substrat ve hipopigmentasyon testi ile inkübe mantar Tirozinaz etkinliği tahlil daha hücresel ortamı temsil eder.
Bu deneyler gerçekleştirmeden önce 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) tahlil veya test compound(s) ile hücre Menekşe tahlil gibi karşılaştırılabilir deneyleri gerçekleştirmek gerekli olabilir. Bir test madde hücre çoğalması etkiler veya sitotoksisite sergiler, sonra melanosit büyüme etkilenebilir ve sonuçları doğru hücresel Tirozinaz etkinlik gösterebilir değil. Kimyasal madde veya doğal maddelerin kez bazı sitotoksisite yüksek konsantrasyonlarda var ve bu özellikle hafif aktivite ile maddeler için önemlidir. Ayrıca maddeler için nadir değildir ve tanıtmak için doğal özler hücre çoğalması ve farklılaşma. Hücre büyümesi üzerindeki bu etkileri protein konsantrasyonu aktivitesiyle normalleştirme tarafından ayarlanmış olabilir, ancak sonuç olarak, ek bioactivity hücre büyümesi neden için potansiyel incelenmelidir.
Çeşitli mekanizmalar hipopigmentasyon Tirozinaz etkinliğini bağımsız neden olabilir. Melanogenesis birden çok sinyal iletim yollarının ve transkripsiyon faktörü faaliyetleri17içerir karmaşık bir biyosentetik yoludur. Bu nedenle, anahtar genler ve proteinler ve melanogenic sinyal iletim yollarının ifade hipopigmentasyon derinlemesine bir çalışma için muayene. MITF melanogenesis bir önemli transkripsiyon faktördür ve α melanosit uyarıcı hormon (α-MSH) melanogenic sinyal iletim yollarının18,19teşvik edebilirsiniz. Onların bilinen biyolojik özelliklere bağlı olarak, ilgili sinyal iletim yollarının daha da okudu.
Böylece sonuçları doğru melanin içerik kültür alanı20veya hücre başına temsil melanin içerik ölçerken, elde edilen değerler de protein konsantrasyonu tarafından normalleştirilmiş. Ayrıca, fenol-kırmızı-Alerjik orta bileşik tedavi adımda Absorbans fenol red olumsuz etkilerini önlemek için tavsiye edilir.
Melanin boyama için melanin ve argentaffin hücreleri21gibi hangi argentaffin maddeler, algılar Fontana-Masson leke kullandık. Bu teknik de parafin veya dondurulmuş bölüm örnekleri deparaffinization adım takip için kullanılır. Bu deneyde kullanılan reaktifler zararlıdır; iletişim ve inhalasyon kaçınılmalıdır ve reaktifler sadece bir duman mahallede mümkün olduğunda kullanılmalıdır. Boyama sonra ImageJ lekeli alanını hesaplamak için kullanılır. Fontana-Masson boyama zayıf seyrek pozitif hücreleri boyama yorumlamak zor olabilir; Ancak, bu melanin zengini melanosit için bir sorun olmayabilir. Gümüş nitrat, ammoniacal gümüş, sodyum thiosulfate ve deneylerde kullanılan amonyum hidroksit onların toksisite nedeniyle dikkatle ele alınmalıdır.
Bunlar yaygın olarak kullanılan yöntemleri melanogenesis ve hipopigmentasyon alanında, hızlı, kullanışlı, düşük maliyetli ve güvenilir çünkü. Bu yöntemler roman bileşikleri veya özleri ile anti-melanogenic veya pro-melanogenic etkinliklerin tanımlanması isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir. Melanosit hücre büyümesini veya hücresel hareketlilik değerlendirmek için de kullanılabilir. Karmaşık bir organ homeostazı çeşitli çevresel, kimyasal ve biyolojik faktörler cevaben saklanır insan derisi sonuçlarına tekrarlanabilirlik bir kısıtlamadır. Bu nedenle, bu yöntemlerle tüp bebek doğruladı hipopigmentasyon ajanlar insan derisi içinde vivo üzerinde önemli etkileri olabilir.
Özet olarak, bu test bileşenleri, melanogenesis üzerindeki inhibitör etkileri için eleme önemli bir ilk adım kurallarıdır. Bu yöntemler sadece da dahil mekanizması melanogenesis inhibitör etkisi açıklayabilir öneririz. Biyoaktif aday bileşikler tanımlanır sonra daha fazla test çalışmaları biyolojik mekanizmaları veya ticari uygulamalar, ardından neden olabilir içinde vivo kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir açıklamaları rapor var.
Acknowledgments
Bu eser Kore Enstitüsü planlama ve değerlendirme için gıda, tarım ve Ormancılık (IPET) Tarım Bakanlığı, gıda ve kırsal işleri (MAFRA tarafından finanse edilen ağrı-Bioindustry teknoloji geliştirme programı aracılığıyla teknolojisi tarafından desteklenen ) (116159-02-2-WT011) ve okul Yaşam Bilimleri ve biyoteknoloji BK21 Plus, Kore Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F.
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E.
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
