Summary
Her beskriver vi protokoller for genetiske og kemiske validering af c-Fos og Dusp1 som en drug target i leukæmi ved hjælp af in vitro- og in vivo genetiske og humaniseret musemodeller. Denne metode kan anvendes på ethvert mål for genetiske validering og terapeutisk udvikling.
Abstract
Demonstration af tyrosin kinase hæmmere (TKIs) til behandling af kronisk myeloid leukæmi (CML) har indvarslet en ny æra i kræft therapeutics. Men en lille population af celler ikke reagerer på TKI behandling, hvilket resulterer i minimal residual sygdom (MRD); selv de mest potente TKIs undlader at udrydde disse celler. Disse MRD celler fungerer som et reservoir til at udvikle resistens over for behandling. Hvorfor TKI behandling er ineffektive mod MRD celler er ikke kendt. Vækstfaktor signalering er impliceret i støtte MRD celler kan overleve under TKI behandling, men en mekanistisk forståelse, der mangler. Nylige undersøgelser viste, at et forhøjet c-Fos og Dusp1 udtryk som følge af konvergerende mutationer og vækstfaktor signalering i MRD celler mægle TKI modstand. Den genetiske og kemiske hæmning af c-Fos og Dusp1 gengiver CML udsøgt følsomme over for TKIs og hærder CML i både genetiske og humaniseret musemodeller. Vi identificeret disse mål gener ved hjælp af flere microarrays fra TKI-følsomme og -resistente celler. Her, leverer vi metoder til target validering ved hjælp af in vitro- og in vivo musemodeller. Disse metoder kan nemt anvendes på enhver mål for genetiske validering og terapeutisk udvikling.
Introduction
Konstituerende tyrosin kinase aktivitet i BCR-ABL1 fusion onkogen forårsager CML, som giver et rationale for at målrette kinase aktivitet af lille molekyle hæmmere. TKIs succes i behandling af CML patienter revolutioneret begrebet målrettet behandling1,2. Efterfølgende, anti-kinase terapi som præcision medicin blev udviklet for flere andre maligniteter, herunder solide tumorer. Indtil videre er er mere end tredive kinase hæmmere blevet godkendt af United State FDA til behandling af forskellige maligniteter. Mens TKI behandling er meget effektiv til at undertrykke sygdommen, er det ikke helbredende. Desuden en lille population af kræftceller fortsætter under behandling: MRD3,4,5. Selv patienter, der viste komplet remission er tilbage med MRD, som til sidst resultater i tilbagefald, hvis ikke løbende undertrykt. Derfor, udryddelse af MRD celler er nødvendige for at opnå en holdbar eller helbredende reaktion. CML repræsenterer en værdifuld paradigme for at definere begrebet præcision medicin, oncogenesis og rationelle mål-rettet therapeutics, sygdomsprogression og resistens over for lægemidler. Men selv i dag, mekanisme kørsel TKI-induceret celledød i cancerceller er ikke fuldt forstået, eller hvorfor MRD celler (består af leukemic stamceller [LSCs]) er uløseligt resistente over for TKIs4,6. Ikke desto mindre er fænomenet "onkogen afhængighed" til mutant kinase oncoprotein impliceret i TKI effekten hvor akut hæmning af målrettede onkogen af TKIs forårsager en muterede chok, der fører til en massiv proapoptotic svar eller ubevægelighed i celle kontekst-afhængige måde6,7,8,9. Men den mekanistiske understøttelse af onkogen afhængighed mangler. Nylige undersøgelser har impliceret at vækstfaktor signalering ophæver onkogen afhængighed og dermed giver resistens over for TKI terapi10,11,12. Derfor, for at få indsigt i mekanismen af onkogen afhængighed, vi udførte hele-genom udtryk profilering fra BCR-ABL1 afhængige og nonaddicted celler (vokset med vækstfaktorer), som viste, at c-Fos og Dusp1 er vigtige formidlere af onkogen afhængighed13. Den genetiske sletning af c-Fos og Dusp1 er syntetiske dødelige at BCR-ABL1-udtrykker celler og mus bruges i eksperimentet udvikle ikke leukæmi. Derudover helbredt hæmning af c-Fos og DUSP1 af lille molekyle hæmmere BCR-ABL1-induceret CML i mus. Resultaterne viser, at udtrykket niveauer af c-Fos og Dusp1 definerer den apoptotiske tærskel i kræftceller, således at lavere niveauer giver drug følsomhed, mens højere niveauer forårsage resistens over for terapi13.
For at identificere de gener kørsel onkogen afhængighed, udført vi flere hele-genom udtryk profilering eksperimenter vækst faktor og en TKI (imatinib) ved hjælp af både mus- og CML patient-afledte celler (K562). Disse data blev analyseret parallelt med CML patient datasæt fra CD34+ hæmatopoietisk stamceller før og efter behandling med imatinib. Denne analyse viste tre gener (en transkriptionsfaktor [c-Fos], dobbelt specificitet fosfatase 1 [Dusp1], og et RNA-bindende protein [Zfp36]) er almindeligt upregulated i TKI-resistente celler. For at validere betydningen af disse gener i giver resistens over for lægemidler, foretog vi en trinvis i in vitro og i vivo analyse. Udtrykket niveauer af disse gener er blevet bekræftet af real-time qPCR (RT-qPCR) og western blotting i resistente celler. Yderligere, cDNA overekspression og knockdown af shRNA Hårnåle af c-Fos, Dusp1, og Zfp36 viste, at forhøjet c-Fos og Dusp1 udtryk er tilstrækkeligt og nødvendigt at overdrage TKI modstand. Derfor, vi udføres en in vivo validering ved hjælp af musen modeller med c-Fos og Dusp1 kun. For genetiske validering af c-Fos og Dusp1, vi skabt ROSACreERT-inducerbar c-Fosfl/fl mus (betinget knockout)14 og krydsede dem med Dusp1- / - (lige knockout)15 at gøre ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - dobbelt-Transgene mus. Knoglemarv-afledte c-Kit+ celler (fra c-Fosfl/fl-, Dusp1- / --, og c-Fosfl/flDusp1- / -) udtrykker BCR-ABL1 blev analyseret i vitro i en kolonidannende enhed (CFU) analyse, og i vivo af knoglemarvstransplantation i lethally bestrålede mus, at teste kravet om c-Fos og Dusp1 alene eller sammen i udvikling af leukæmi. Ligeledes, de kemiske hæmninger af c-Fos af DFC (difluorinated curcumin)16 og Dusp1 af BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 blev testet in vitro- og in vivo, ved hjælp af BCR-ABL1-udtrykker, knogle marv-afledte c-Kit+ celler fra wild-type (WT) mus. For at bekræfte kravet om c-Fos og Dusp1 i leukemic stamceller, udnyttede vi en CML musen model hvor BCR-ABL1 var specielt induceret i sin stamceller af doxycyclin (Tet-transaktivatoren udtrykker under murine stem cell leukæmi (SCL) gen 3' enhancer forordning)18,19. Vi brugte knoglemarv Lin-Sca+c-Kit+ (LSK) celler fra disse mus i en in vivo transplantation assay. Desuden, vi etableret phopsho-p38 niveauer og udtryk af IL-6 som farmakodynamiske biomarkører for Dusp1 og c-Fos hæmning, henholdsvis, i vivo. Endelig, for at udvide undersøgelsen for menneskelige relevans, patient-afledte CD34+ celler (svarende til c-Kit+ celler fra mus) blev underkastet en langsigtet in vitro-kultur-indlede celle assays (LTCIC) og en in vivo humaniseret musemodel af CML20,21. Immundefekte musene blev transplanteret med CML CD34 + celler, efterfulgt af behandling og analyse af menneskers leukemic celle overlevelse.
I dette projekt udvikler vi metoder til målet identifikation og validering ved hjælp af både genetiske og kemiske værktøjer, ved hjælp af forskellige prækliniske modeller. Disse metoder kan anvendes med succes for at validere andre mål udvikle kemiske modaliteter for terapeutisk udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev foretaget efter retningslinjerne i de institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Cincinnati children's Hospital medicinsk Center (CCHMC). Humant prøvemateriale (Normal BM og der fra CML (p210-BCR-ABL +) leukæmi) blev modtaget gennem institutionelle Review Board-godkendte protokoller (institutionelle Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati children's Hospital Medical Center), og donor-informeret samtykke fra CCHMC og University of Cincinnati.
1. real-time qPCR analyse
- Isolere total RNA fra BaF3 celler vokser i RPMI suppleret med 10% FBS og 10% WEHI brugt næringssubstratet som en kilde til interleukin-3 (IL-3).
- Høste cellerne på logaritmiske fase (99% i live) fra behandlede (IL-3 og imatinib) samt fra ubehandlet prøver, og centrifugeres dem på 435 x g i 3 min. Sundhed og vækststadierne af cellerne er kritisk, da deres gen expression profiler kan ændre sig dramatisk.
- Isolere RNA ved at rense total RNA22. Kvantificere den samlede RNA; derefter, underlagt det DNase behandling23. Konvertere lige store mængder af DNA-fri RNA (2 µg) til cDNA med reverse transkriptase24.
- Udføre qPCRs med gen-specifikke primere (tabel 1). Udføre PCR'er i 20 µL reaktioner i 0,2 mL, tyndvæggede PCR rør med optisk caps, ved hjælp af en 1 x polymerase mix (Se Tabel af materialer), 0,5 µM hver primer, 1 µL af DNA, og vand. Placer reaktionen i thermocycler med følgende cyklus: trin 1, 95 ° C i 10 min. Trin 2, 95 ° C i 15 s; Trin 3 ved 60 ° C i 1 min; Trin 4, skal du gentage trin 2 – 3 40 gange. Udføre alle PCR'er i tre og normalisere realtidsdata til β-actin udtryk før plotning.
2. Western Blotting
Bemærk: Hele-celle ekstrakter blev udarbejdet ved at tilføje 250 µL 1 x lysisbuffer som beskrevet i Kesarwani et al.13 suppleret med protease hæmmer cocktail og fosfatase hæmmer cocktail 2.
- Høst fem millioner BaF3 celler på logaritmiske fase (99% i live) fra behandlet (IL-3 og imatinib) samt fra ubehandlet BaF3 celler ved centrifugering ved 435 x g i 3 min. ved 4 ° C. Lyse celler i lysisbuffer (250 µL) af pipettering op og ned 1 x, efterfulgt af en 5 min inkubation ved 80 ° C. Læg instrumenterne i ultralydsbad i lysate til at nedbryde alle DNA med 5 – 6 pulser af 5 s i et koldt rum ved 4 ° C.
- Overførsel af lysate til en 1,5 mL tube og centrifugeres det på 16.000 x g for 5 min at fjerne uopløselige materiale. Ekstrakt kan opbevares ved-80 ° C indtil brug. Varme prøver til 80 ° C i 5 min i en varme blok før læsning. Indlæse 10 µL af prøven ved hjælp af en gel-loading tip på 10% SDS-PAGE gel.
- Løse proteiner på 150 V indtil reference farven når bunden af gelen. Overføre proteinet til nitrocellulose membraner af en elektroforese overførsel på 1 amp for 1 h. Efter overførslen, blokere membraner i 1 x Tris-bufferet saltvand + 0,1% Tween 20 (TBST) med 5% fedtfrit mælk til 1 h og sonde natten over ved 4 ° C med passende antistoffer ved 1:1,000.
- Vaske membraner 3 x til 5 x med TBST i 10 min hver; derefter, sonde med et HRP-konjugerede passende sekundær antistof (1:5, 000 fortynding) ved stuetemperatur i 1 time. TBST bruges afhænger af container størrelse. Sørg for at dykke membran i TBST helt. Vaske den sekundær antistof 3 x til 5 min med TBST.
- Udvikle den skamplet, anvendelse af kemiluminescerende substrat reagens. Bland lige mængder af substratet og buffer fra to flasker, lige før brug. Tilføj substrat til toppen af membran til at dække hele membranen med 1 mL pipette og inkuberes i 1 min. Blots bør være afbildet indenfor 1-10 min for at tilføje substratet.
- Bruger stump pincet, omhyggeligt placere membranen på platformen af imaging system (Se Tabel af materialer), undgå meget af væsken. Vælg en live view og vælg blotting og chemiluminiscence fra menuen. Brug af manuel erhvervelse, erhverve flere eksponeringer på forskellige tidspunkter. Disse filer kan visualiseres og kvantificeres ved hjælp af software til billedbehandling.
3. generation af Knockout mus
- På tværs af c-Fosfl/fl mus med ROSACreERT2 mus til at generere ROSACreERT2c-Fosfl/fl mus13. Hvis du vil oprette dobbelt-knockout (KO) mus, race ROSACreERT2c-Fosfl/fl mus med Dusp1- / - mus til at generere ROSACreERT2c-Fosfl/fl Dusp1- / - mus13. Genotype mus med hale clips efterfulgt af PCR, som beskrevet nedenfor.
-
Genotypebestemmelse:
- At forberede DNA, klip en lille del af halen med en saks og sætte det ind i en 1,5 mL tube. Ætse halen med opvarmet saks. Tilføje 200 µL af 50 mM NaOH til klippede halen i røret og inkuberes ved 95 ° C i en varme blok 1 h.
- Vortex rør godt og derefter, neutralisere ved at tilføje 50 µL 1 M Tris HCl pH 6,8 og vortex igen. Der centrifugeres rør ved maksimal hastighed i 1 minut.
- Udføre PCR'er i 20 µL reaktioner i 0,2 mL, tyndvæggede PCR rør ved hjælp af 1 x Taq polymerase master mix der indeholder farvestof, 0,5 µM hver primer, 1 µL af DNA, og vand. Sted rør i thermocycler og køre de passende cykler, som vist i tabel 2.
- Køre PCR produkt på 2%-agarosegel og billedet ved hjælp af en gel dokumentationssystem.
4. isolering af c-Kit+ celler fra knoglemarven
- Ofre mus efter institutionelle retningslinjer.
Bemærk: Her, musene blev udsat for kuldioxid (CO2) på et i henhold til AVMA anbefalet strømningshastighed indtil døden, blev fastsat ved ophør af åndedræt og hjerterytme, efterfulgt af cervikal dislokation. - Høste benknogler fra mus — to lårben, to forbenede, to iliacs. Ren off alle væv fra knoglerne ved at skrabe væk med en skalpel. Sætte ben knogler i koldt 1 x PBS på isen — 5 mL i en 15 mL tube. Hæld indholdet af røret i en morter og knus det med en pistil.
- Filtrere cellesuspension gennem en 70 µm celle si i en 50 mL skruelåg tube med 10 mL pipette fastgjort, ved hjælp af en pipette. Vask morter og støder flere gange med koldt 1 x PBS, indsamling og tilføje cellesuspension til 50 mL tube. Spin ned knoglemarv på 1.200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern af supernatanten via en vakuum med et glas pipette knyttet. Suspendere celle pellet i 5 mL 1 x PBS med en pipette.
- Med en pipette, tilsættes langsomt suspenderede knoglemarv til toppen af 5 mL af stuetemperatur (temperaturen er kritisk) polysucrose, at tage stor forsigtighed for ikke at forstyrre grænsefladen. Spin på 400 x g ved stuetemperatur i 20 min. med bremsen slukket.
- Indsamle grænsefladen overskyet samlede mono-nukleare celle (TMNC) med en pipette og sætte det ind i en ny 15 mL rør. Bringe volumen op til 10 mL med 1 x PBS for vask, tager 20 µL for at tælle, og drej på 1,200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern supernatanten og gemme pellet på isen for trin 4.6.1.
-
Udføre c-Kit+ celle isolation.
- Følg en microbead kit protokol for c-Kit+ celle isolation. Resuspenderes celle i 80 µL 1 x PBS + EDTA + BSA til 107 celler. Cellesuspension, tilføje 20 µL af CD117 MicroBeads/107 samlede celler. Bland godt med vortexing og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C. Bringe volumen op til 10 mL ved at tilføje 1 x PBS + EDTA + BSA og spin på 1.200 x g ved 4 ° C i 5 min.
- Fjern supernatanten via en vakuum og suspendere celle pellet i 500 µL/108 samlede celler i 1 x PBS + EDTA + BSA. Bruger magnet stå med magnetisk kolonnen vedhæftet, tilsættes 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA og lad det flyde igennem via tyngdekraften i en 15 mL collection tube.
- Når den første buffer tilføjelse er færdig går gennem kolonnen, skal du tilføje cellesuspension til kolonnen, så den kan flyde igennem via tyngdekraften til 15 mL collection tube. Denne flowthrough er den uønskede celle fraktion.
- Kolonnen udvaskes 3 gange med 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA hver gang, så den kan flyde igennem via tyngdekraften i collection tube. Fjern kolonnen fra magneten og sted på toppen af en 15 mL tube.
- Der tilsættes 5 mL af 1 x PBS + EDTA + BSA og straks skylle det med stemplet forsynet med kolonnen. Fjerne stemplet og Gentag flush med en ekstra 5 mL 1 x PBS + EDTA + BSA. Tælle celler i sammentællingen af rumfanget ved hjælp af standard metoder.
- Spin ned celler på 1.200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i komplet IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) for kultur. Kultur disse celler natten over i 2 x 106 celler/1 mL af celle IMDM komplet medier ved at placere dem i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
5. transduktion
-
Retroviral plasmid Transfektion
- Frisk tø HEK293 celler om eftermiddagen før i et vandbad indstillet på 37 ° C. Spin cryotube HEK celler på 435 x g ved stuetemperatur i 3 min. Fjern af supernatanten via en vakuum og suspendere celle pellet i 1 mL af DMEM suppleret med 10% FBS, penicillin, streptomycin og glutamin.
- Tælle cellerne og tilføje den passende mængde til en 10 cm behandlet parabol (~ 4 x 106 HEK293T celler). Tilføje 14 mL af DMEM 10 medier til fadet og bland det godt ved at skubbe op og ned for en ligelig fordeling. Placer fadet i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator natten over.
- Den næste morgen, check sammenløbet af celler under en inverteret lysmikroskop (50% eller mere fungerer godt).
- Kombiner DNA (ønskede retroviral plasmid), PclEco (emballage plasmid), 2 M CaCl2og H20 i en 1,5 mL tube (= 500 µL) ved hjælp af en mikropipette i følgende beløb: 7,5 µg af DNA (BCR-ABL1-YFP) 7,5 µg for pCLeco, 62 µL af 2 M CaCl2 , og vand til en endelige mængden af 500 µL. tilføje 500 µL af 2 x HBS til en anden 1,5 mL tube.
- Tilføje DNA Bland dråbevis til 1,5 mL tube indeholder 500 µL af 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES og 1,5 mM Na2HPO4) mens blanding. Opnå dette ved at angive en vortex til den laveste hastighed og holde HBS rør på det for konstant blande samtidig tilføjer Transfektion mix.
- Give Transfektion mix at udruge for 20-30 min. ved stuetemperatur. Under inkubation, tilføje 25 nM chloroquin HEK celler og læg dem tilbage i inkubatoren. Efter inkubation, tilføje Transfektion mix dråbevis til HEK celler, og derefter forsigtigt swirl medier for at blande Transfektion mix i hele pladen.
- Inkuber celler med mix for ~ 8 h i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Ændre medier på disse celler ved meget langsomt tilføje 14 mL frisk DMEM 10 medier. Pipettering langsomt mod væggen i fadet hjælper med at forhindre enhver stripning af HEK celler. Inkuber celler overnatning i 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Indsamle viral supernatanten med en 10 mL sprøjte, tegne supernatanten ind i sprøjten og fastgør 0,45 µm sprøjte filter. Springet viral supernatanten ind en ny collection tube. Tag den første kollektion af viral supernatanten ~ 16 h senere.
-
Fibronektin viral koncentration og transduktion
- Tilsættes 2 mL af en 0,1 mg rekombinant humant fibronektin fragment i 1 x PBS til ubehandlet 6-og kultur plader. Forbered så meget fibronektin efter behov, hvilket afhænger af antallet af celler og genotyper. Man kan godt nok transduce 10 million c-Kit+ celler. Inkuber plade natten over ved 4 ° C.
- Den næste dag, fjerne fibronektin fra brønde med en pipette, afpipetteres 2 mL i sterile 2% BSA i 1 x PBS til at blokere pladen, og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur. Fjern BSA via en vakuum og vask grundigt af pipettering 2 mL 1 x PBS derefter fjerne det via en vakuum.
- Straks tilføje frisk indsamlet og filtreret (på 0,45 µm) viral supernatanten op til 5 mL. Der centrifugeres ved 435 x g ved 32 ° C for 2 h. fjerne af supernatanten via en vakuum og Gentag dette trin med ekstra frisk indsamlede viral supernatanten og spin igen. Fjerne den supernatanten via en vakuum og brøndene vaskes ved tilsætning 2 mL 1 x PBS; derefter fjerne det via en vakuum.
- Tilføje c-Kit+ musen celler at var kulturperler overnatning (trin 4.6.6) viral coatede brønde ved blanding celle suspensioner godt og pipettering dem ind nu viral koncentreret fibronektin plade. Drej på 1,200 x g ved 25 ° C til 90 min. lægger cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- 48 h posttransduction, sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 1.200 x g ved 4 ° C i 5 min og resuspend dem i FACS buffer #1 (1 x PBS + 0,5% BSA) at 6 x 106/mL. Bestemme procentdelen af BCR-ABL1 positive celler af måling procentdelen af YFP positive ved hjælp af flowcytometri.
- Erhverve begivenheder med standardproceduren. Først, gate live cellerne baseret på frem og side scatter. Derefter, gate YFP positive levende celler undtagen YFP-negativecells bestemmes af negativ kontrol (figur 4).
6. kolonidannende UnitAssays
- Tø methylcellulose med cytokiner for mus ved stuetemperatur i 1 – 2 h. alikvot 3 mL af methylcellulose i FACS rør ved hjælp af en 5 mL sprøjte uden nål. Form YFP-positive celler i en celle sorteringsanlæg.
- Spin cellerne ned og suspendere pellet i IMDM komplet media. Tælle celler for at være forgyldt og udvande dem for at få 5.000 YFP-positive celler i 100 µL af IMDM komplet media.
- Tilsæt 100 µL af cellesuspension indeholdende 5.000 YFP-positive celler og de passende hæmmere til 3 mL af methylcellulose (Se Tabel af materialer). Vortex høje at blande det for 10-30 s.
- Efter de fleste af luft bobler er undsluppet, skal du bruge en 1 mL sprøjte til plade 1 mL af medier i tre Repliker 3 cm plader af skubbe medier på den ene side og langsomt vippe plade i en cirkulær bevægelse at spredes jævnt.
- Den endelige koncentration af hæmmere bruge er imatinib på 3 µM, DFC på 0,2 µM og BCI på 0,5 µM, alene eller i kombination. Hvor det er relevant, skal du slette c-Fos ved plettering cellerne med 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) tilføjet til methylcellulose.
- Efter plating, sætte pladerne i en stor petriskål med en åben skål indeholdende 2 mL sterilt vand i midten. Dække de store petriskål og omhyggeligt inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Optage koloni numre efter en uge i yderklædningen ved at tælle det samlede antal kolonier under et mikroskop.
- Analysere et par kolonier fra passende plader til c-Fos sletning af PCR. Indsamle kolonierne ved at suge dem med en P1000 spids. Løsne cellerne i 500 µL 1 x PBS ved at vaske aflæsse i PBS flere gange. Spin celle suspensioner ved 6.000 x g i 1 min og udtrække DNA fra celle pellet ved hjælp af en genomisk DNA isolering kit.
- Bruge genomisk DNA til PCR ved hjælp af primere mFos-FP3 og mFos-RP5, som beskrevet i tabel 2. Analysere PCR-produkter på en 2%-agarosegel og billedet ved hjælp af en gel dokumentationssystem.
- En grafisk præsentation af kolonierne, pletten kolonier, ved hjælp af Iodonitrotetrazolium chlorid. 10 mg Iodonitrotetrazolium chlorid i 10 mL vand til at opnå en 1 mg/mL opløsning opløses. Filter sterilisere den løsning ved hjælp af en Luer lock med 0,2 µm filter knyttet til en 10 mL sprøjte under sterile forhold i vævskultur hætte.
- I vævskultur hood, tilføje 100 µL af Farvningsopløsningen dråbevis omkring CFU plade; Vær omhyggelig med ikke at glide eller forstyrre kolonier. Inkuber plader natten over i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator. Kolonierne vil blive mørk rødlig brune. Ved hjælp af en hvid baggrund i sterile vævskultur hood, tage billeder af farvede CFU pladen.
7. transplantation og dødelighed Assay
- Lethally bestråle musene med split stråling ved hjælp af en 137 Cs-baserede Gamma-ray med en dosis på 7,0 Gy efterfulgt af 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h apart før transplantation.
- Transplantation 4 x 104 usorteret YFP-positive (beregnet på grundlag af procentdelen af YFP) celler med 3 x 105 normal knoglemarv celler som bærer i hver musen gennem halen vene injektion.
- Efter en uge med transplantation, bestemme engraftment ved at analysere YFP-positive celler fra perifert blod ved hjælp af FACS.
-
Udføre en hale vene bløder og FACS analyse.
- Varm bur af mus under en varmelampe med forsigtighed for ikke at overophede eller brænde dem.
- Afholde en mus i en mus Tilbageholderen og nick hale vene med en steril kniv. Forsigtigt mælk hale fra forreste til bageste, giver en blod drop at akkumulere. Indsamle blod med en heparinized kapillarrør, indtil det er fyldt (indsamle omkring 75-100 µL). Styrte blodet fra det fyldte kapillarrør i en blod collection tube indeholder EDTA og bland godt.
- Lyse de røde blodlegemer ved at tilføje 30 – 40 µL af blod til 3 mL 1 x RBC lysisbuffer (150 mM ammoniumklorid, 10 mM kaliumbicarbonat og 0,13 mM EDTA). Bland godt, invertere røret flere gange. Inkuber ved stuetemperatur i 10-15 min. Spin på 1.200 x g ved 4 ° C for 5 min. Fjern af supernatanten via en vakuum og suspendere pellet i 2 mL 1 x PBS til en vask.
- Drej på 1,200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern supernatanten og suspendere det i FACS buffer #1. Foretage FACS analyse, som beskrevet ovenfor i trin 5.2.5–5.2.66. Kortsigtede butik den resterende blod i collection tube, som kan bruges til forskellige andre formål, ved 4 ° C.
- Transplanterede mus, der viste 10-40% YFP-positive celler i det perifere blod blev brugt til eksperimentet. Mus, der havde mindre end 2% af YFP-positive celler blev udelukket fra undersøgelsen.
- Forberede tamoxifen på 20 mg/mL i majsolie på 60 ° C med intermitterende vortexing indtil fuldstændig opløst, og opbevar den ved 4 ° C i mørke for varigheden af behandlingen. Efter en uge med transplantation, slette c-Fosfl/fl allel ved at indsprøjte tamoxifen (100 mg/kg i majsolie) intraperitoneal (i.p.) ind i musene, hver dag i tre på hinanden følgende dage. Det er vigtigt, at musene er vejes for at bestemme hvor meget tamoxifen til at injicere. Efter tamoxifen behandling (hvis relevant), gruppere mus for lægemiddelsbehandlinger (n = 5/gruppe).
- Overvåge mus for leukæmi progression og overlevelse og bestemme leukemic byrde (YFP-positive celler af FACS) ugentlige op til otte uger i overlevende mus.
- Analysere blod til c-Fos sletning, hvor det er relevant, som beskrevet ovenfor i afsnit 6. Registrere antallet af overlevende mus hver dag og plot overlevelse kurven for enden af eksperimentet ved hjælp af en graftegning software.
8. Transgene mus Model af BCR-ABL1 leukæmi
-
LSK isolation
- Vedligeholde Scl-tTA Transgene mus på doxycyclin chow at forhindre et udtryk af BCR-ABL1. Fire uger før transplantation, tage mus off doxycyclin chow for BCR-ABL1 udtryk.
- Isolere TMNCs fra Scl-tTA Transgene mus, som beskrevet ovenfor i afsnit 4. Suspendere TMNCs i FACS buffer #2 (1 x PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) at opnå 106 celler/mL.
- Nedbryder TMNCs for slægt-positive celler ved at tilføje 10 µL af afstamning celle påvisning cocktail biotin (biotin-konjugeret monoklonalt antistof mod CD5 [rotte IgG2a], CD11b [rotte IgG2a], CD45R [B220] [rotte IgG2a], Anti-7-4 [rotte IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rotte IgG2a], og Anti-Ter-119 [rotte IgG2b]) pr. 1 x 106 celler. Inkuber celler ved 4 ° C for 10 min. i mørke, efterfulgt af en vask med 5 mL af FACS buffer #2, og drej på 1,200 x g ved 4 ° C i 5 min. aspirat supernatanten helt og suspendere celler i 400 µL af FACS buffer #2.
- Tilsæt 5 µL af anti-biotin antistof-FITC-konjugat, 1,2 µL af Ly-6A/E (Sca1) PECy7 og 2.4 µL af CD117 (c-Kit) APC antistoffer for op til 108 millioner celler. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 10 min. Skyl ved at bringe mængden op til 5 mL med FACS buffer #2; derefter centrifugeres ved 1.200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern supernatanten og suspendere celle pellet i 500 µL af FACS buffer #2.
- Filtrere cellesuspension ind i en blå filter-cap FACS rør.
- Gate levende celler ved hjælp af videresendelse og side scatter. Vælg derefter de lin- celler, der viste MFI (betyde fluorescens intensiteten af mindre end 102) at få LSK celler c-Kit+ og Sca1+ på et biexponential plot fra Lin- moder, og sortere dem (figur 7 C).
- Indsamle de sorterede celler og centrifugeres dem ved 1.200 x g ved 4 ° C i 5 min.
-
Transplantation
- Lethally bestråle BoyJ mus med en split stråling dosering af 7.0 Gy efterfulgt af 4,75 Gy efter 3 h før transplantation.
- Indsprøjtes 3 x 103 til 5 x 103 BCR-ABL1-LSK celler med 0,3 x 106 hjælper knoglemarv celler fra WT BoyJ mus via hale vene (i.v.) i de bestrålede BoyJ mus.
- Fire uger posttransplantation, analysere de modtagende mus for CD45.1 og CD45.2. Opnå TMNC fra de perifere blod af hale vene blødning som beskrevet i trin 7.4. Resuspend celler i 100 µL af FACS buffer. Inkuber celler med 1 µL af CD45.1-FITC og CD45.2-PE antistoffet ved stuetemperatur i 1 time.
- Cellerne vaskes ved at bringe op for lydstyrken til 3 mL med FACS buffer og spin på 1.200 x g ved 4 ° C for 5 min. Fjern supernatanten og resuspend det i 200 µL 1 x PBS.
- Analysere procentdelen på CD45.1 og CD45.2 ved første gating live cellerne baseret på frem og side scatter, efterfulgt af gating FITC - og PE-positive celler baseret på den unstained prøve.
- Gruppere musene i fire grupper (n = 6 pr. gruppe). Starte behandling med imatinib (75 mg/kg 2 x dagligt) alene og i kombination med DFC + BCI (begge stoffer blev givet ved en dosis på 10 mg/kg 2 x dagligt).
- Ligeledes behandle andre grupper med kombinationer af imatinib (75 mg/kg) + curcumin (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) og imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) i tre måneder, 2 x en dag ved injiceres i.p.
- Analysere mus 1 x om måneden i seks måneder for leukemic kimærisme ved beregning af procentdelen af CD45.2 positive celler i det perifere blod af hale vene blødning som beskrevet i trin 7.4.
9. i Vivo evaluering af BCI og DFC aktivitet
-
Phospho-p38 analyse
- Tage tre leukemic mus (8-12 uger gammel), der blev transplanteret med BCR-ABL1-udtrykker c-Kit+ celler, som beskrevet i afsnit 7. Injicere musene med BCI (10 mg/kg) ved at indsprøjte i.p. fire uger posttransplant.
- Måle niveauet af phospho-p38 perifert blod TMNC ved hjælp af fosforylering flow flowcytometri kit efter leverandørens anvisninger. Indsamle blod fra hver mus før og 6 h efter narkotika injektion. Isolere TMNCs af RBC udtynding og lave dem som følger.
- Tilsættes 4 mL RBC lysis opløsning pr. 100 µL af perifert blod. Blandes og inkuberes i isbad i 5 min til lyse RBC. Spin ned celler ved 1.200 x g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten. Gentag lysis 1 x mere.
- Efter det andet trin af lysis vaske celle pellets med 1 mL 2% BSA i PBS. Fix cellerne ved at tilføje 100 µL af fiksering og permeabilization løsninger og Ruger i 20 min. ved 4 ° C i mørke. Pellet cellen ved centrifugering ved 1.200 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Vask pellets med 1 mL af 1 x permeabilization vask. Blokere cellerne ved at tilføje 300 µL af 2% BSA i permeabilization wash buffer ved stuetemperatur for 20 min. opdele celler i tre lige store delprøver på 100 µL (~ 1 x106).
- Tilføj 1 µL af samlede p-38 antistof, 1 µL af phospho-p38 antistof eller 1 µL af isotype IgG kontrol, henholdsvis hver delprøve af faste celler, og der inkuberes natten over ved 4 ° C.
- Vaske cellerne 1 x med 5 mL 2% BSA i PBS og inkuberes med sekundær antistof (1 µL af Alexa Fluor-488 konjugeret) i 1 time ved stuetemperatur. Vaske cellerne 1 x igen og suspendere dem i 200 µL 1 x PBS.
- Erhverve data af FACS og analysere dem ved flow flowcytometri analyse software.
- Fratrække MFI i kontrolelementet IgG fra MFI af de eksperimentelle prøver. MFI værdier af phospho-p38 derefter normaliseres til de samlede p-38 til at bestemme phospho-p38 niveauer efter BCI injektion.
-
Kvantitativ gen expression analyse af c-Fos target gener
- Tage tre leukemic mus (8-12 uger gammel), der blev transplanteret med BCR-ABL1-udtrykker c-Kit+ celler som beskrevet i afsnit 7. Indsamle de perifere blod fra hver musen og derefter indsprøjtes musene med 10 mg/kg hver DFC + BCI.
- Indsamle de perifere blod 6 h efter narkotika injektion. Isolere TMNCs af RBC udtømning, som beskrevet ovenfor. Pellet TMNCs og suspendere dem i et phenol-baserede lysisbuffer (Se Tabel af materialer).
- Udføre RT-qPCR analyse (som beskrevet i afsnit 1) til Bcl2l11, Lif og IL-6 ved hjælp af gen-specifikke primere (vist i tabel 1).
10. langsigtede kultur-indlede celle Assay
Bemærk: En LTCIC analyse blev udført som beskrevet tidligere25.
- Vokse en mus fibroblast cellelinje MS-5 i MEMα til confluency i en T175 vævskultur kolbe. Trypsinize cellerne, som beskrevet ovenfor for HEK293T. Suspendere celler i MEMα på 2 x 106 celler/mL. Tag 10 x 106 celler i en 50 mL konisk slange og bestråle på 80 Gy. Fortynd celler til 0,5 x 106 celler/mL i MEMα suppleret med 10% FBS (M10) medier. Plade 2 mL pr. brønd i en 12-godt plade og Inkuber i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator natten over.
- Den næste dag, forberede hydrocortison natrium hemisuccinate ved at opløse 2,5 mg i 5 mL af MEMα (1 M-opløsning). Filter-sterilisere hydrocortison løsning ved hjælp af en 0,2 µm sprøjte filter i biosikkerhed hætte. Fortynd hydrocortison ved seriel fortynding i MEM at opnå en 100 µM løsning. Tilføje 250 µL af dette til 25 mL af human langsigtede næringssubstratet (HLTM) (Se Tabel af materialer) lige før at bruge, at opnå en endelig koncentration på 1 µM.
- Spin ned CML-CD34+ og UCP3 TMNCs og suspendere dem i HLTM af korte vortexing, og bestemme greverne af en hemocytometer.
- Vakuum off M10 medier fra den 12-godt plade med stroma celler og erstatte det med patient celle 1 mL (CML-CD34+ [10.000] og UCP3 TMNCs [1 x 106]) suspension i HLTM. Brug tre brønde pr. stof kombination pr. celletype.
- Fortynd narkotika bestande til 2 x den nødvendige koncentration i HLTM. Der tilsættes 1 mL af medier med narkotika til ovennævnte cellerne til at opnå en 1 x drug koncentration. Erstat halvdelen af medierne med frisklavede HLTM hver uge i fem uger.
- I slutningen af perioden på seks uger LTC-IC assay, indsamle nonadherent celler ind i et rør fra kulturerne. Trypsinize vedhængende celler og kombinere dem med de tilsvarende nonadherent celler.
- Vaske cellerne og assay for CFUs i methylcellulose medium indeholdende 30% føtalt kalveserum, erythropoietin (3 enheder/mL), SF (50 ng/mL), og IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), og granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) (20 ng / mL). bestemme greverne af en hemocytometer.
- Plade 5 x 104 celler i tre replikater. Fryse ned de resterende celler i 20% FBS og 10% DMSO. Arrangere plader i en stor petriskål med en åben skål indeholdende vand i midten. Dække de store petriskål omhyggeligt og Inkuber i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator for to uger.
- Score kolonierne to uger senere. I nogle tilfælde er kun en del af harvest analyseret for CFUs). Beregning af det samlede antal LTCIC i den indledende cellesuspension ved at ekstrapolere baseret på CFUs fremstillet af en del af høsten i celle. Den gennemsnitlige CFU output pr. LTC-IC er 8.
Bemærk: For eksempel, hvis oprindeligt 1 x 106 celler blev forgyldt i en brønd, efter fem uger, 0,5 x 106 celler er høstet, og for CFU, 5 x 104 celler blev forgyldt og 50 CFUs blev indhentet. Dette svarer til 500 CFUs/1 million forgyldt celler. Dividere dette tal med 8 for at få LTCIC, som er 62,5.
11. humaniseret musen Model ved hjælp af CML CD34+ celler
- Sublethally bestråle de 8 uger gamle NOD scid gamma mus, udtryk for menneskelige IL3, GM-CSF og SCF (NSGS), med en enkelt dosis af 7.0 Gy (700 rads) med 50 rads/min.
- Injicere 3 x 106 CD34+ markerede celler fra BCR ABL1 positive CML kronisk fase patienter til de bestrålede mus ved intravenøs injektion.
- Efter to uger af transplantation, bestemme leukemic engraftment i knoglemarven ved FACS ved hjælp af musen - og menneske-specifikke antistoffer mod CD45.
-
Udføre en FACS-analyse.
- Tage knoglemarvspunktat fra lårben af de transplanterede mus. Lyse røde blodlegemer ved hjælp af RBC lysisbuffer som beskrevet ovenfor og indsamle TMNCs ved centrifugering. Vaske pellet 1 x med koldt 1 x PBS.
- Blokere cellerne med menneskelige FcR blok og mus FcR blok efterfulgt af farvning med antihumant CD45 FITC og anti-mus CD45 APCCy7 natten over ved 4 ° C. Udføre FACS-analyse på LSRII og analysere data ved hjælp af flow flowcytometri analyse software.
- Gruppere musene i fire forskellige kohorter (n = 6/gruppe) til behandling med køretøjet, imatinib (75 mg/kg), DFC + BCI (både på 10 mg/kg), eller imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (både på 10 mg/kg). Fortynd stock narkotika i 1 x PBS (køretøj) og administrere dem ved at indsprøjte dem i.p. 2 x dagligt.
- Behandle musene for seks uger og bestemme den leukemic byrde hver to uger, indtil uge otte efter transplantation som beskrevet ovenfor i 11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onkogen afhængighed har været impliceret i den terapeutiske virkning af TKIs. Men de mekanismer, der driver onkogen afhængighed er ikke forstået. Vi udførte flere uvildige gen expression analyser for at identificere den genetiske komponent involveret i iscenesætte afhængighed. Disse analyser viste opregulering af tre gener, c-Fos, Dusp1 og Zfp36, i kræftceller, der er ikke afhængige muterede signalering for overlevelse, og således er ufølsom over for TKI behandling. Downregulation af c-Fos og Dusp1 af shRNA-medieret knockdown er tilstrækkeligt til at genoprette drug følsomhed i ellers TKI-resistente celler.
Deres overekspression bekræftedes for at validere c-Fos og Dusp1 rolle som terapeutiske mål i leukæmi, først ved hjælp af BaF3 celler udtrykker BCR-ABL1 onkogen. Vækstfaktor signalering i BaF3-BA celler ophæver onkogen afhængighed; som en konsekvens, reagerer de ikke på TKI behandling. Kvantitative udtryk analyse af RT-qPCR og western blotting bekræftet, at både c-Fos og Dusp1 er induceret af BCR-ABL1 og deres udtryk er yderligere forstærket af vækstfaktor IL-3 (figur 1A - 1 C).
At studere rollen af c-Fos og Dusp1 in vivo mus mangler c-Fos (betinget musen model c-Fosfl/fl med Rosa26-CreERT2) eller Dusp1 (lige KO Dusp1- / -) og mus mangler både c-Fos og Dusp1 (Rosa26-CreERt2-Fosfl/fl/Dusp1- / - ) blev udviklet. Disse mus var genotypebestemmes ved PCR ved hjælp af genomisk DNA fra halen, og PCR fornem nemt de c-Fosfl/fl, Dusp1 KO fra WT-mus (fig. 2A). Den inducerede sletning af c-Fos af tamoxifen behandling blev bekræftet ved PCR, ved udseendet af et band i forhold til ingen band i mus ikke behandlet med tamoxifen (figur 2B).
For at teste rollen af c-Fos og Dusp1, knoglemarv-afledte c-Kit+ celler fra WT, Dusp1- / -, blev c-Fosfl/fl, og Dusp1- / -/c-Fosfl/fl isoleret og transduced med MSCV BCR ABL1 Ires YFP retrovira; en skematisk af proceduren er vist i figur 3. YFP+ udtrykker (bruges som surrogat markør for BCR-ABL1 udtryk) blev sorteret efter FACS (figur 4) for yderligere in vitro (CFU) og in vivo assays. Resultaterne viser, at sletning af c-Fos og Dusp1 alene hæmmede CFU numre (< 50%). Interessant, celler mangler både c-Fos og Dusp1 blev betydeligt kompromitteret i deres kolonidannende evne, og imatinib behandling udslettet alle CFUs, tyder på, at tabet af c-Fos og Dusp1 er syntetisk dødelige at BCR-ABL1 udtryk (figur 5 ).
In vitro-CFU assays aktiverer forskere hurtigt teste Fænotypen af KO og aktivitet for små molekyle-hæmmere. Imidlertid yderligere bekræfter in vivo analyse gyldigheden af målene. For in vivo validering udnyttede vi først en hurtig transduktion transplantation model1 hvor BCR-ABL1 forårsager dødelighed inden for to til tre uger. Halvtreds tusind YFP-positive celler, sammen med 300.000-500.000 knoglemarv-afledte mononukleære celler fra normale mus, blev sprøjtet ind lethally bestrålede mus til at fremkalde CML. Musene transporterer c-Fosfl/fl celler eller c-Fosfl/flDusp1- / - celler blev injiceret med tamoxifen efter 10 dage af transplantation slette c-Fos. Mus der modtaget enten WT eller Dusp1- / - celler udviklet leukæmi og bukkede under for døden inden for to til fire uger, mens sletning af c-Fos alene viste en signifikant forsinkelse i udvikling af sygdom og TKI behandling reddet næsten 50% af mus fra døden. Interessant, at musene transplanteret med celler mangler både c-Fos og Dusp1 overlevede længere, og TKI behandling kureret alle mus af CML (figur 6A - 6 C). Musene at overlevet gradvis mistede YFP+ cellerne, som vist i c-Fos og dobbelt KO når behandling med imatinib (figur 6D-6F), hvilket tyder på clearance af BCR-ABL1 positive celler.
Da CML er en stamcelle sygdom, og givet retrovira manglende evne til at målrette de primitive og inaktiv hæmatopoietisk celler, er det bydende nødvendigt ville for at teste, om målretning af c-Fos og Dusp1 være tilstrækkeligt til at afhjælpe de leukemic stamceller. Tetracyclin-inducerbar BCR-ABL1 Transgene mus hvor tTA er udtrykt ved en Scl enhancer, som specifikt er udtrykt i hæmatopoietisk stamceller, har tidligere udnyttet til at studere rollen af target gener i LSCs. Tetracyclin-inducerbar BCR-ABL1 Transgene mus (figur 7A-7B) blev udnyttet til at undersøge rollen af c-Fos og Dusp1 i LSCs. LSK celler fra disse mus blev sorteret ved hjælp af FACS og injiceres i de modtagende mus (figur 7C). Efter en måned efter transplantation, blev leukemic engraftment scoret, efterfulgt af narkotikabehandling. Leukemic byrde og niveauer af LSK blev fastsat hver måned i seks måneder. Mus behandlet med imatinib alene viste en undertrykkelse af leukæmi, men blev forladt med MRD. Derfor resulterede behandlingsophør, som observeres i klinikken, i sygdom tilbagefald. Derimod mus behandlet med en kombination af narkotika imatinib + DFC (c-Fos hæmmer) + BCI (Dusp1-hæmmer) udryddet helt i leukemic celler og mus blev helbredt af CML (figur 7 d og 7E).
At etablere farmakodynamiske udlæsning til c-Fos og Dusp1 hæmmere og at studere deres på målet effekt, phospho-p38 niveauer (surrogat markør for Dusp1 hæmning) blev målt og udtryk for c-Fos-regulerede gener, som IL-6, bcl2l11 og Lif, var kvantificeret. Vi og andre har etableret, at hæmning af Dusp1 resulterer i aktivering af p38 (målt ved den øgede fosforylering af p38)13. Phospo-p38 niveauer blev målt ved FACS i fuldblod celler isoleret fra stof-behandlede mus. Som forventet, at phospho-p38 øges (fig. 8A) og udtryk for c-Fos-regulerede gener (IL-6, bcl2l11 og Lif) var downregulated i stof-behandlede mus (figur 8B). Disse resultater tyder på, at hæmmere hæmmer deres mål og overlevelse af mus er på grund af hæmning af c-Fos og Dusp1.
Til menneskers relevansen, effektiviteten af c-Fos og Dusp1 hæmmere blev testet ved hjælp af patientprøver i in vitro-(LTC-IC) og in vivo assays (mus xenografts). Behandling med DFC + BCI er ikke effektiv i leukemic stamceller. Men en kombination af DFC + BCI + imatinib selektivt udryddet leukemic stamcellerne i begge assays mens besparende normale stamceller (figur 9A - 9 C). Disse resultater fastslå, at c-Fos og Dusp1 er afgørende for leukemic transformation, og en forhøjet udtryk for disse gener ophæver onkogen afhængighed resulterer i sygdom tilbagefald og resistens over for lægemidler. Derfor vil en kombinatorisk målretning af c-Fos og Dusp1 samt driver onkogen være mere effektiv, og måske en helbredende strategi for mange kræftformer. Vi forventer, at de metoder, der beskrives her generelt kan anvendes til yderligere målet identifikation og validering.
Figur 1 : c-Fos og Dusp1 er overexpressed svar på vækstfaktor IL-3. qPCR analyse af en overekspression af (A) c-Fos og (B) Dusp1 i cytokin-behandlede BaF3-BA celler. Den relative udtryk blev fastsat efter normalisering til β-actin. Fejllinjer udgør standardafvigelsen fra tre Kontraprøverne, der udtages. (C) Western blot analyse af BaF3-BA celler behandles med IL-3 og aftestede med c-Fos alt eller P-c-Fos og Dusp1 antistof. Anti-actin antistof blev brugt som lastning kontrol. Dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Kesarwani et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Genotypebestemmelse af c-Fosfl/flDusp1 og Rosa cre-ER mus. (A) PCR analyse af hale DNA. Forventet bands er fra WT eller fra c-Fosfl/fl-transporterer CreER transgenet og Dusp1 KO mus. Bandet størrelser er angivet til venstre. (B) PCR analyse af en mindre band efter sletning af c-Fos med tamoxifen behandling. M = 1 kb + DNA Ladder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Skematisk af modellens transduktion og transplantation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : FACS viser hyppigheden af YFP+ celler af blod fra en transplanteret og en WT mus (negativ kontrol). De top paneler viser en scatter plot af cellerne og den gating. Panelerne lavere Vis histogrammer af YFP vs. side scatter. Celler med en MFI af > 103 blev betragtet som YFP +. Lignende gating blev brugt til knoglemarv celler efter transduktion til beregning af procentdel transduktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentant plader fra CFU plating. Pladerne viser kolonierne farves med iodonitrotetrazolium chlorid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : c-Fos og Dusp1 mangler kompromittere leukæmi udvikling. (A-C) Overlevelse kurver af mus transplanteret med c-Kit+ BCR-ABL1 celler fra WT, Dusp1- / -c-Fos- / -og c-Fos- / - Dusp1- / - mus. (D-E) Procentdel af YFP + celler som fastsat af FACS i de perifere blod af de transplanterede mus trukket hver uge posttransplant. Niveauet for YFP stiger og musene bukke under for døden som i WT og Dusp1 KO. De mus, der overlever gradvis mister YFP+ celler som vist i c-Fos og dobbelt KO når behandling med imatinib. Dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Kesarwani mfl. 13. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : c-Fos og Dusp1 er nødvendig for overlevelse af LSCs. (A) skematisk af transgenet bruges i Transgene mus udtrykker BCR-ABL1 i stamceller. (B) eksperimentelle design for at studere virkningerne af Dusp1 og c-Fos hæmning af DFC og BCI in vivo. (C) FACS parceller af swing gating strategien bruges til sortering LSK celler til transplantation. (D) procentdel af BCR-ABL1 (bestemmes af procentdelen af CD45.2 fra donor mus) positive celler i mus under og posttreatment med inhibitorer. (E) FACS scatter observationsområder viser CD45 kimærisme i levende celler og i LSK celle rum. Bemærk manglen på CD45.2 i alt og i LSK rum i behandlede mus. Dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Kesarwani et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: In vivo aktivitet af DFC og BCI. (A) linje graf viser niveauerne af phospho-p38 efter BCI behandling. (B) RT-qPCR viser udtryk af c-Fos target gener i perifert blod hos musene efter DFC behandling. Prikkerne repræsenterer tre replikater fra hver mus (n = 3). Tal over grafer repræsenterer p-værdi beregnet ved Student's t-test. Dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Kesarwani et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : C-Fos og DUSP1 hæmning i en menneskelig patienten prøve rolle. (A) procent af CFUs bestemmes af LTC-IC analysen fra to CML patienter, og en sund donor behandles med køretøjet eller de angivne drug kombinationer. (B) procentdel af menneskelige leukemic celler (hCD45) i knoglemarven af NSGS mus på uge 2 (venstre) og uge 4 (højre) af behandling. (C) dette panel viser repræsentative FACS parceller viser en dramatisk reduktion af hCD45 celler i stof-behandlede mus mens besparende musen celler vises som mCD45. Dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Kesarwani et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For hovedparten af kræftceller, er den terapeutiske svar TKI medieret af en blokade af tyrosin-kinase-oncoprotein signaler som tumor er afhængige af. Imidlertid er relativt lidt kendt om hvordan et mindretal af kræftceller bidrager til MRD undslippe onkogen afhængighed og terapi4. Nylige undersøgelser afslørede, at vækstfaktor signalering medierer resistens i både leukæmi og solid orgel tumorer. Dette tyder på, at forskellige molekylære mekanismer kan ligge til grund for iboende modstand10,11,12. For at forstå mekanismen og identificere genet mål for terapeutisk udvikling, udført vi omfattende hele-genom udtryk profiler ved hjælp af musen (BaF3) og menneskeceller (K562). Primære prøver fra leukemic mus eller CML patienter blev ikke brugt, fordi vi havde mistanke om, at som primære knoglemarv prøver er betydeligt heterogene, vil de maske identiteten af relevante gener/mål. Selv celler renset af antistof-medieret sortering (stem stamceller) udviser signifikant heterogenitet. Derfor, en renset cellelinie er formentlig bedre egnet til målet identifikation at undgå enhver uønsket kompleksitet pålagt af genetiske heterogenitet. Hele-genom udtryk analysen identificeret, at c-Fos, Dusp1 og Zfp36 er almindeligt upregulated i resistente celler. Når målene er blevet identificeret, bliver deres validering en kritisk del at anerkende deres rolle i den givne genetiske sammenhæng. Ved hjælp af cDNA overekspression og genetiske knockdown undersøgelser i BaF3 celler afsløret at hæmning af c-Fos og Dusp1 er tilstrækkeligt og nødvendigt for effektiv TKI følsomhed. Måske er et af de mest afgørende skridt i target validering at validere relevansen af identificerede gener/mål i primære prøver fra både mus og mennesker. I denne protokol, vi giver trin for trin udnyttelse af flere genetiske modeller og give bedre mekanistiske indblik for yderligere forfinelse af stof/target evaluering.
En hurtig screening på cellulært niveau udnytter CFUs eller LTCIC assay hjælper forskere til at teste flere stof kombinationer samt koncentrationer, hurtigt før de går til mere tidskrævende transplantation metoder. CML er en stamcelle sygdom, og givet retrovira manglende evne til at målrette de primitive og inaktiv hæmatopoietisk celler, er det bydende nødvendigt at teste ved hjælp af modeller, der direkte vedrører deres rolle i LSC overlevelse. For at løse dette, udnyttet vi en tetracyklin-inducerbar BCR-ABL Transgene mus hvor tTA er udtrykt ved en Scl forstærker. Ikke desto mindre er genetiske modeller mangelfuld i recapitulating sygdom hos mennesker. Det er derfor nødvendigt at teste primære patientprøver i humaniseret musemodeller. Men for at kunne lave en langsigtet undersøgelse til påvisning af MRD over tid, en stabil xenograft kræves der, afhængigt af den mus og celle typer, kan variere. Efter fire måneder efter transplantation, var de menneskelige CD34 + celler udtømte selv uden medicinsk behandling, som er en begrænsning i mest humaniseret musemodeller. Bedre humaniseret musemodeller udvikles for at teste de menneskelige celler i mus26. Vi anbefaler kraftigt, bestemmelse af målaktivitet for hæmmere som nogen off-målet effekt kan forårsage toksicitet over for normale celler, begrænse dens videre anvendelse. Men hvis downstream mål ikke er kendt, forskellige tilgange bør udnyttes. For eksempel, kan at identificere de resistente mutanter benytter tilfældig mutagenese af target proteinet direkte adressen uanset om inhibitoren mål27.
Protokollen præsenteres her giver en omfattende metode til målet identifikation og validering ved hjælp af flere in vitro- og i vivo modelsystemer. Disse metoder kan være let tilpasses til andre mål og kræft typer. Yderligere Mekanistiske undersøgelser på identificeret mål og raffinement i stof målretning kan hjælpe med at udvikle bedre terapeutisk modaliteter for effektiv og/eller helbredende behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige at G. Q. Daley for at levere BaF3 og WEHI cellerne og T. Reya for MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruktioner. Forfatterne er taknemmelige at M. Carroll for at levere patientprøver fra CML blast krise. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud til M.A. fra NCI (1RO1CA155091), leukæmi Research Foundation og V Foundation og fra NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 μM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 μm nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet (boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II (FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I (FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII (FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
- DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
- SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
- Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
