Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.
Abstract
ההדגמה של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית (CML) יש בישרה עידן חדש ותרופות לסרטן. עם זאת, אוכלוסיה קטנה של תאים אינו מגיב לטיפול TKI, והתוצאה היא מחלה שיורית מינימלית (MRD); אפילו הכי חזק TKIs להיכשל כדי למגר תאים אלה. תאים אלה MRD לשמש מאגר לפתח עמידות לטיפול. למה TKI הטיפול אינו יעיל נגד MRD תאים לא ידוע. גורם הגדילה איתות הייתה שם בתמיכה ההישרדות של MRD תאים במהלך הטיפול TKI, אך הבנה מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו c מוגברות-פוס ואת הביטוי Dusp1 כתוצאה מתכנסת oncogenic פקטורי גדילה איתות בתאים MRD לתווך TKI ההתנגדות. עיכוב גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 מעבד לוקמיה מיאלואידית כרונית רגישים להפליא TKIs ומרפא CML בשני המודלים העכבר humanized גנטי. זוהו הגנים האלה היעד באמצעות מיקרו-מערכים מרובים TKI רגיש ותאים עמידים. כאן, אנו מספקים שיטות אימות היעד באמצעות העכבר במבחנה ויוו מודלים. שיטות אלה ניתן בקלות ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.
Introduction
פעילות קינאז טירוזין המכונן של BCR-ABL1 פיוז'ן אונקוגן גורמת CML, אשר מהווה הרציונל למקד את פעילות קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנה. ההצלחה של TKIs בטיפול בחולי CML מהפכה הקונספט של טיפול ממוקד1,2. לאחר מכן, טיפול אנטי-קינאז כתרופה דיוק פותחה עבור מספר ממאירויות אחרות, כולל גידולים מוצקים. עד כה, מעכבי קינאז יותר משלושים אושרו על ידי ה יונייטד המדינה-FDA לטיפול גידולים ממאירים שונים. בעוד TKI טיפול יעיל מאוד בדיכוי המחלה, זה לא מרפא. חוץ מזה, אוכלוסיה קטנה של תאים סרטניים נמשכת במהלך הטיפול:4,3,MRD5. אפילו חולים אשר הראו הפוגה מלאה נשארים עם MRD, אשר בסופו של דבר התוצאות ב- relapse אם לא באופן רציף מודחקים. לכן, מיגור של MRD תאים נדרש כדי להשיג היענות עמיד או ריפוי. לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצג פרדיגמה ערך להגדרת המושג דיוק רפואה, מנגנונים של oncogenesis, הרפוי רציונלי מכוון מטרה, התקדמות המחלה תרופתיים. עם זאת, גם היום, מנגנון נהיגה מוות תאי TKI-induced בתאי סרטן אינה מובנת במלואה, ולא למה תאים MRD (המורכב של תאי גזע לוקמיה [LSCs]) עמידים ממהותם4,TKIs6. למרות זאת, התופעה של "תלות אונקוגן" כדי oncoprotein קינאז מוטציה הוא בהפרות יעילות TKI איפה עיכוב חריפה של יישוב אונקוגן מאת TKIs גורם מכת oncogenic שמוביל מסיבי proapoptotic תגובה או תרדמה בתא באופן תלוי-ההקשר6,7,8,9. עם זאת, בהתפשטות אונקוגן התלות מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה לסבך כי גורם הגדילה איתות abrogates אונקוגן התלות, כתוצאה מכך מקנה עמידות TKI טיפול10,11,12. לכן, כדי לזכות בתובנה המנגנון של אונקוגן התלות, ביצענו הגנום כולו ביטוי פרופיל של BCR-ABL1 מכורים ותאים nonaddicted (גדל עם גורמי גדילה), אשר גילה ש- c-פוס ו Dusp1 הם מתווכים קריטי של אונקוגן התמכרות13. המחיקה גנטי של c-פוס, Dusp1 תאים קטלניים BCR-ABL1-ולהבעת סינתטי, העכברים המשמשים את הניסוי לא לפתח לוקמיה. יתר על כן, עיכוב של c-פוס, DUSP1 על ידי מעכבי מולקולה קטנה נרפא BCR-ABL1-induced CML בעכברים. התוצאות מציגות רמות הביטוי של c-פוס, Dusp1 להגדיר את סף מוות של תאים סרטניים, כזה כי רמות נמוכות יותר להתייעץ סמים רגישות בעוד רמות גבוהות יותר לגרום התנגדות טיפול13.
כדי לזהות את הגנים נהיגה התלות אונקוגן, ביצענו כמה הביטוי הגנום כולו פרופיל ניסויים בנוכחות גורם הגדילה של TKI (imatinib) באמצעות העכבר - והן תאים נגזר חולה CML (K562). נתונים אלה נותחו במקביל עם ערכות נתונים חולה CML המתקבל CD34+ hematopoietic תאי גזע לפני ואחרי הטיפול בעזרת imatinib. ניתוח זה חשף בשלושה גנים (גורם שעתוק [c-פוס], ירידה לפרטים כפול פוספטאז 1 [Dusp1], ולא של RNA-מחייב חלבון [Zfp36]) אשר הם בדרך כלל upregulated תאים עמידים TKI. כדי לאמת את המשמעות של גנים אלו משוחח עמידות לתרופות, אנחנו ביצעו ניתוח במבחנה , ויוו צעד אחר צעד. רמות ביטוי של גנים אלה שאושרו על-ידי qPCR בזמן אמת (RT-qPCR), סופג המערבי תאים עמידים לתרופות. יתר על כן, ביטוי cDNA של נוקאאוט מאת shRNA סיכות של c-פוס, Dusp1, Zfp36 גילה כי c מוגברות-פוס וביטויים Dusp1 הם מספיק והכרחי להיוועץ TKI ההתנגדות. לכן, אנו לבצע אימות ויוו באמצעות העכבר מודלים עם c-פוס Dusp1 בלבד. לשם אימות גנטי של c-פוס, Dusp1, אנו נוצר c-פוסחליל/חליל ROSACreERT-inducible עכברים (מותנה נוקאאוט)14 , חצה אותם עם Dusp1- / - (ישר נוקאאוט)15 כדי להפוך ROSACreERT2-c-פוסחליל/חליל Dusp1- / - העכברים הטרנסגניים-כפול. תאי מח עצם-derived c-Kit+ (מ- c-פוסחליל/חליל-, Dusp1- / --, ו- c-פוסחליל/חלילDusp1- / -) המבטאת BCR-ABL1 היו שנותחה במבחנה המושבה יוצרי assay יחידה (CFU), ו . ב ויוו על ידי השתלת מח עצם בעכברים אולם לקרינה, כדי לבדוק את הדרישה של c-פוס, Dusp1 לבד או יחד בפיתוח לוקמיה. באופן דומה, העכבות כימי של c-פוס DFC (difluorinated כורכומין)16 , Dusp1 על ידי BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 נבדקו במבחנה, ויוו באמצעות BCR-ABL1-המבטאת עצם תאי מח-derived c-Kit+ מן העכבר (WT) פראי-סוג. כדי לאשר את הדרישה של c-פוס, Dusp1 בתאי גזע לוקמיה, אנחנו מנוצל דגם העכבר CML איפה BCR-ABL1 היה במיוחד שנגזרות בתאי גזע שלו דוקסיציקלין (ט-transactivator מבטא תחת מאתר תאי לוקמיה (SCL) הגן 3' משפר... תקנה)18,19. השתמשנו מח עצם לין–סרוק+c-Kit+ (LSK) תאים מחלון אלו עכברים ב וזמינותו השתלת ויוו. יתר על כן, הקמנו phopsho-p38 רמות, הביטוי של IL-6 כמו דינמי-טוהר הפרמה קופ סמנים ביולוגיים עבור Dusp1 וניגוד c-פוס, בהתאמה, ויוו. לבסוף, כדי להרחיב את המחקר עבור רלוונטיות האדם, נגזר החולה CD34+ תאים (המקביל בתאי c-Kit+ של עכברים) היו כלפיהן לטווח ארוך במבחנה. מתחילה תרבות תא מבחני (LTCIC) ומודל העכבר humanized ויוו של לוקמיה מיאלואידית כרונית20,21. העכברים immunodeficient הושתלו עם לוקמיה מיאלואידית כרונית CD34 + תאי, ולאחריו הטיפול בתרופה וניתוח של הישרדות cell לוקמיה אנושי.
בפרויקט זה, אנו מפתחים שיטות זיהוי המטרה והאימותים באמצעות כלים גנטיים והן כימית, שימוש במודלים פרה שונה. שיטות אלה ניתן להחיל בהצלחה כדי לאמת את מטרות נוספות לפתח שיטות כימיות לפיתוח טיפולית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם לקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) ב חולים רפואי במרכז (CCHMC סינסינטי ילדים). דגימות אנושי (מוניטור רגיל וזה מ לוקמיה מיאלואידית כרונית (p210-BCR-ABL +) לוקמיה) התקבלו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על-ידי ועדה מוסדית (מוסדיים המנהלים: Federalwide אבטחת #00002988 לילדים בסינסינטי מרכז רפואי בית חולים), הסכמה הודיע התורם CCHMC, באוניברסיטת סינסינטי.
1. בזמן אמת qPCR ניתוח
- בודד הכולל RNA מתאי BaF3 גדל RPMI בתוספת 10% FBS ו-10% בינוני תרבות ה-וואי בילה כמקור של אינטרלוקין-3 (IL-3).
- לקצור את התאים בשלב לוגריתמי (99% בחיים) שטופלו (IL-3 ו- imatinib) אך גם מדגימות לא מטופל, centrifuge אותם ב x 435 g למשך 3 דקות. את הבריאות, את שלבי הצמיחה של התאים הם קריטיים כמו שלהם ביטוי גנים פרופילים יכולים לשנות באופן דרמטי.
- לבודד RNA וטיהור RNA סה כ22. לכמת את הרנ א הכולל; לאחר מכן, נושא זה טיפול DNase23. המרת כמויות שוות של RNA DNA חופשי (2 µg) כדי cDNA עם רוורס טרנסקריפטאז24.
- לבצע qPCRs עם תחל הגן הספציפי (טבלה 1). לבצע את מותני בתגובות µL 20 ב- 0.2 מ"ל, המבחנות דקות קיר עם אותיות אופטי, באמצעות פולימראז 1 x לערבב (ראה טבלה של חומרים), 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, µL 1 של ה-DNA, ומים. הכנס את התגובה thermocycler עם מחזור הבא: שלב 1, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; בשלב 2, 95 ° C 15 s; שלב 3 ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה; בשלב 4, חזור על שלבים 2-3 40 פעמים. לבצע כל מותני ב- triplicates, לנרמל את הנתונים בזמן אמת לביטוי β-אקטין לפני מזימות.
2. המערבי סופג
הערה: כל תא תמציות הוכנו על-ידי הוספת µL 250 1 x פירוק מאגר כפי שמתואר Kesarwani et al.13 שיושלם עם מעכב פרוטאז קוקטיילים וחדר פוספטאז מעכב 2 קוקטיילים.
- קציר חמישה מיליון תאים BaF3 בשלב לוגריתמי (99% חי) של מטופלים (IL-3 ו- imatinib), כמו גם של לא מטופל BaF3 תאים על ידי צנטריפוגה ב x 435 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. Lyse התאים במאגר של פירוק (250 µL) על ידי pipetting למעלה ולמטה x 1, ואחריו דגירה 5 דקות ב- 80 מעלות צלזיוס. Sonicate lysate לשבור את כל ה-DNA עם 5-6 פולסים של 5 s בחדר קר ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את lysate צינור 1.5 mL, centrifuge אותו ב- 16,000 x g עבור 5 דקות כדי להסיר את כל חומר לא מסיסים. ניתן לאחסן את התמצית ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. דוגמאות חום עד 80 ° C עבור 5 דקות בתוך גוש חום לפני הטעינה. לטעון µL 10 המדגם באמצעות טיפ ג'ל העמסה על ג'ל מרחביות-דף 10%.
- לפתור את החלבונים ב-150 V עד הפניה לצבוע מגיע לתחתית של הג'ל. להעביר את החלבון לממברנות ניטרוצלולוזה על ידי העברה electrophoretic-1 אמפר לשעה. לאחר המעבר, לחסום את הקרומים 1 x באגירה טריס תמיסת מלח + 0.1% Tween 20 (TBST) עם 5% חלב דל שומן 1 h, בדיקה בין לילה ב 4 ° C עם נוגדנים המתאימים לדילול 1:1,000.
- לשטוף את הקרומים 3 x ל x 5 עם TBST למשך 10 דקות כל; לאחר מכן, בדיקה עם מצומדת HRP המתאים משני נוגדן (1:5, 000 דילול) בטמפרטורת החדר מאובטח. כמות TBST נעשה שימוש תלויה בגודל מיכל. ודא ומטביעים את הקרום ב TBST לחלוטין. לשטוף את הנוגדן משני 3 x עבור חמש דקות כל אחד עם TBST.
- לפתח את האבן החשופה באמצעות המצע chemiluminescent מגיב. מערבבים נפחים שווים של המצע, המאגר של שני בקבוקים, ממש לפני השימוש. הוסף את המצע העליונה של קרום לכסות את הקרום כל עם פיפטה 1 מ"ל ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות. שהכלים צריך לדימות בתוך 1 – 10 דקות להוסיף את המצע.
- בעזרת מלקחיים בוטה, בזהירות המקום הקרום על הפלטפורמה של מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים), הימנעות הרבה של הנוזל. בחר תצוגה חיה ובחרו שהכלים ו chemiluminiscence ' מתפריט '. באמצעות רכישת ידנית, רוכשים חשיפות מרובות בנקודות זמן שונות. קבצים אלה ניתן לאבחן, לכמת באמצעות תוכנת הדמיה.
3. הדור של עכברים נוקאאוט
- לחצות c-פוסחליל/חליל עכברים עם עכברים ROSACreERT2 ליצירת ROSACreERT2c-פוס-חליל/חליל -עכברים-13. כדי ליצור העכברים (KO) כפול-נוק אאוט, גזע ROSACreERT2c-פוסחליל/חליל עכברים עם עכברים- / - Dusp1 ליצירת ROSACreERT2c-פוסחליל/חליל Dusp1- / - עכברים13. גנוטיפ העכברים מאת הזנב קליפים ואחריו PCR, כמתואר להלן.
-
Genotyping:
- כדי להכין את ה-DNA, קליפ חלק זעיר של הזנב עם מספריים והכניס אותו לתוך צינור 1.5 מ. לצרוב את הזנב עם מספריים מחוממת. להוסיף 200 µL של 50 מ מ NaOH זנב חתוך בצינור, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום עבור 1 h.
- מערבולת הצינור טוב ולנטרל, לאחר מכן, על-ידי הוספת 50 µL של טריס M HCl 1 pH 6.8 ו מערבולת שוב. Centrifuge את הצינור במהירות המרבית עבור 1 דקות.
- לבצע את מותני ב 20 תגובות µL ב 0.2 מ"ל, קיר דק את המבחנות התקן באמצעות 1 x Taq פולימראז בסיס תמהיל המכילים צבען, 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, µL 1 של ה-DNA, ומים. למקם את הצינורות thermocycler ולהפעיל את מחזורי המתאים כפי שמוצג בטבלה מס ' 2.
- להפעיל את המוצר PCR על 2% agarose ג'ל ותמונה באמצעות מערכת תיעוד ג'ל.
4. בידוד תאי c-Kit+ של מח העצם
- להקריב את העכברים בהתאם להנחיות מוסדיים.
הערה: כאן, העכברים נחשפו פחמן דו-חמצני (CO2) ב לפי AVMA מומלץ קצב הזרימה עד מותו נקבע על ידי הפסקת נשימה, פעימות הלב, ואחריו נקע בצוואר הרחם. - לקצור את הרגלעצמות מן העכבר — שתי עצמות הירך, שני tibias, שני iliacs. תנקה כל רקמות העצמות על ידי שחיקה עם אזמל. הכניסו את עצמות הרגל PBS קר 1 x על קרח – 5 מ ל צינור 15 מ"ל. שופכים את תכולת השפופרת לתוך מרגמה ולרסק אותו עם כבעלי.
- סינון התליה תא דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור פקקי בורג 50 מ עם פיפטה 10 מ"ל מצורפים, באמצעות פיפטה. לשטוף את עלי ומכתש מספר פעמים עם PBS קר 1 x, איסוף של הוספת תא ההשעיה הצינור 50 מ. ספין למטה מח העצם ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר supernatant באמצעות ואקום עם פיפטה מזכוכית מצורף. להשעות בגדר תא ב 5 מ של PBS x 1 עם פיפטה.
- עם פיפטה, להוסיף לאט מח עצם מושעה לחלק העליון של 5 מיליליטר בטמפרטורת החדר (הטמפרטורה היא קריטית) polysucrose, מטפל מעולה שלא להפריע את הממשק. ספין-x 400 g בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות עם הבלמים כבוי.
- לאסוף את הממשק מעונן תא מונו-גרעיני הכולל (TMNC) עם פיפטה והכניס אותו לתוך צינור 15 מ"ל. . תביא את אמצעי האחסון עד כדי 10 מ"ל עם 1 x PBS בשביל הכביסה, לוקח 20 µL עבור ספירה, ו ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך תגובת שיקוע ולשמור בגדר בקרח עבור שלב 4.6.1.
-
לבצע c-Kit+ תא בידוד.
- בצע נוהל ערכת microbead עבור c-ערכת+ תא בידוד. Resuspend בגדר תא ב- 80 µL של PBS 1 x + EDTA + BSA 107 תאים. כדי התליה תא, להוסיף µL 20 CD117 גרגרי/107 תאים הכולל. מערבבים היטב בעזרת vortexing, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. להביא את אמצעי האחסון עד 10 מ"ל על-ידי הוספת 1 x PBS + EDTA + BSA ו ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע באמצעות ואקום, להשעות בגדר התא בתאים 500 µL/108 סה כ 1 x PBS + EDTA BSA. שימוש הדוכן מגנט עם העמודה מגנטי מצורפים, להוסיף 3 מ"ל של 1 x PBS + EDTA + BSA ולאפשר לזרום דרך באמצעות כוח המשיכה לתוך צינור אוסף 15 מ"ל.
- לאחר התוספת המאגר הראשון סיימה העוברים דרך העמודה, להוסיף התליה תא העמודה, ומאפשרת לזרום דרך באמצעות הכבידה לתוך הצינור אוסף 15 מ"ל. Flowthrough הזה הוא השבר תאים לא רצויים.
- לשטוף את העמודה 3 פעמים עם PBS 1 x 3 מ"ל + EDTA BSA בכל פעם, ומאפשרת לזרום דרך באמצעות הכבידה לתוך הצינור אוסף. הסר את העמודה המגנט ומניחים על החלק העליון של צינור 15 מ"ל.
- הוסף 5 מ של 1 x PBS + EDTA + BSA, מיד לשטוף את זה עם הבוכנה סיפק את העמודה. להסיר את הבוכנה וחזור את הסומק עם אוטם 5 נוספים של 1 x PBS + EDTA + BSA. לספור את תאי האחסון הכולל שימוש בשיטות הרגילות.
- ספין למטה התאים ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב IMDM מלאה (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ליגנד [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) לתרבות. התרבות שתאים אלה לינה 2 x 106 תאים/1 מ"ל של תא IMDM מדיה מלאה על-ידי הצבתם באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.
5. התמרה חושית
-
פלסמיד retroviral תרביות תאים
- טרי הפשרת תאים HEK293 אחר הצהריים לפני באמבט מים מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס. לסובב cryotube המכילות את התאים HEK ב x 435 g בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות להסיר את supernatant באמצעות ואקום, להשהות בגדר תא ב 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין, גלוטמין.
- לספור את התאים ולהוסיף את העוצמה המתאימה צלחת 10 ס מ מטופלים (~ 4 x 10 תאים6 HEK293T). להוסיף 14 מ של התקשורת DMEM 10 למנה ולערבב אותה היטב על ידי הזזה למעלה ולמטה על חלוקה שוויונית. מקם את המנה 37 ° C, 5% CO2 מגשים בן לילה.
- למחרת בבוקר, לבדוק את המפגש של התאים תחת מיקרוסקופ אור הפוך (50% או יותר עובד טוב).
- לשלב את ה-DNA (פלסמיד retroviral הרצוי), PclEco (אריזה פלסמיד), 2 מ' CaCl2ו- H20 צינור 1.5 מ ל (= 500 µL) באמצעות micropipette הסכומים הבאים: 7.5 µg של ה-DNA (BCR-ABL1-YFP), 7.5 µg של pCLeco, µL 62 של 2 M CaCl2 , ומים כדי נפח סופי של 500 500 להוסיף µL µL. של x HBS 2 כדי עוד צינור 1.5 מ ל.
- תוך כדי ערבוב, מוסיפים ה-DNA dropwise להתערבב הצינור 1.5 mL המכיל 500 µL של x HBS 2 (280 ממ NaCl, 100 מ מ HEPES ו- 1.5 מ מ נה2HPO4). להשיג זאת על-ידי הגדרת מערבולת המהירות הנמוכה ביותר והחזק את הצינור HBS על זה עבור ערבוב מתמיד תוך הוספת המיקס תרביות תאים.
- אפשר לערבב תרביות תאים תקופת דגירה של 20 – 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, להוסיף 25 ננומטר כלורוקין התאים HEK ולמקם אותם בחזרה בחממה. לאחר הדגירה, להוסיף את תערובת תרביות תאים dropwise התאים HEK ו, ואז, בעדינות מערבולת התקשורת לערבב לערבב תרביות תאים ברחבי הבסיס.
- דגירה התאים עם המיקס עבור ~ 8 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים. שינוי בתקשורת על תאים אלה על-ידי הוספת באיטיות 14 מ"ל של מדיה DMEM 10 טריים. Pipetting לאט הקיר של המנה מסייעת למנוע כל חסינותו של התאים HEK. דגירה התאים לילה ב- C ° 37, 5% CO2 מיכלים.
- לאסוף את תגובת שיקוע נגיפי בעזרת מזרק 10 מ"ל, לצייר את תגובת שיקוע לתוך המזרק, לצרף את המסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. מזנקת על תגובת שיקוע ויראלי לתוך צינור אוסף חדש. לקחת את האוסף הראשון של נגיפי h ~ 16 supernatant מאוחר יותר.
-
ריכוז ויראלי Fibronectin, התמרה חושית
- להוסיף 2 מ של קטע fibronectin האנושי רקומביננטי 0.1 מ"ג 1 x PBS ללוחות לא מטופל תרבות 6-. טוב. להכין כמה שיותר fibronectin כנדרש, אשר תלויה במספר של תאים אחרים. אחד טוב יכול מספיק מגלי 10 מיליון תאים c-Kit+ . דגירה את הצלחת בן לילה ב 4 º C.
- למחרת, הסר את fibronectin הבארות עם פיפטה, פיפטה 2 מ ל BSA סטרילי 2% ב- PBS 1 x כדי לחסום את הצלחת ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר על BSA באמצעות ואקום לשטוף ביסודיות על ידי pipetting 2 מ"ל של 1 x PBS ולאחר מכן להסיר אותו באמצעות ואקום.
- מיד להוסיף טרי שנאספו ומסונן (ב- 0.45 מיקרומטר) ויראלי עד supernatant מ ל. צנטריפוגה-x 435 g ב- 32 ° C ח' 2 להסיר את supernatant באמצעות ואקום, חזור על שלב זה עם נוספים תגובת שיקוע ויראלית נאסף טרי, ספין שוב. להסיר את supernatant באמצעות ואקום ולשטוף את הבארות על-ידי הוספת 2 מ של 1 x PBS; לאחר מכן, להסיר אותו באמצעות ואקום.
- הוסף שהעכבר c-Kit+ תאים כי היו בתרבית תוך לילה (שלב 4.6.6) ויראלי לבארות מצופה על ידי ערבוב טוב את המתלים תא, pipetting אותם המשקולת ויראלי fibronectin מרוכז עכשיו. ספין-x 1,200 g ב- 25 ° C במשך 90 דקות מכניסים את התאים 37 ° C, 5% CO2 מיכלים.
- 48 שעות posttransduction, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, resuspend אותם במאגר FACS #1 (1 x PBS + 0.5% BSA) כדי 6 x 106/mL. לקבוע את אחוז תאים חיוביים BCR-ABL1 על ידי מדידת אחוז YFP חיובי באמצעות cytometry זרימה.
- רוכשים אירועים עם הליך רגיל. ראשית, שער של תאים חיים המבוסס על פיזור קדימה ואת הצד. לאחר מכן, שער של YFP חיובי תאים חיים למעט YFP-negativecells נקבע על ידי שליטה שלילי (איור 4).
6. המושבה יוצרי UnitAssays
- להפשיר את methylcellulose עם ציטוקינים עבור העכבר בטמפרטורת החדר במשך ה' 1 – 2 Aliquot 3 מ של methylcellulose בשפופרת FACS באמצעות מזרק 5 מ ל לי מחט. למיין התאים YFP-חיוביות על סדרן התא.
- ספין התאים למטה, להשעות את צניפה בתקשורת מלאה IMDM. לספור את התאים כדי להיות מצופה ו לדלל אותם לקבל YFP-חיובית 5,000, בתאים µL 100 של התקשורת מלאה IMDM.
- להוסיף 100 µL של התליה תא המכיל את מעכבי המתאים עד 3 מ"ל של methylcellulose והתאים YFP-חיובית 5,000 (ראה טבלה של חומרים). מערבולת גבוה כדי לערבב את הכל עבור s 10 – 30.
- אחרי רוב האוויר בועות נמלטו, להשתמש מזרק 1 מ"ל צלחת 1 מ"ל של התקשורת שלוש צלחות שכפל 3 ס מ על ידי הוצאת המדיה בצד אחד ואת באיטיות מטה את הצלחת בתנועה סיבובית להפיץ באופן שווה.
- הריכוז הסופי של כדי להשתמש הם imatinib-מיקרומטר 3, DFC ב 0.2 µM ולאחר BCI-0.5 מיקרומטר, לבד או בשילובים. בכל מקום מתאים, למחוק c-פוס על ידי ציפוי התאים עם 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) להוסיף את methylcellulose.
- לאחר ציפוי, לשים את הצלחות צלחת פטרי גדולה עם צלחת פתוחה אחת המכילה 2 מיליליטר מים סטריליים באמצע. מכסה את צלחת פטרי גדולה, דגירה בקפידה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים. להקליט את המספרים המושבה אחרי שבוע אחד של ציפוי על ידי ספירת המספר הכולל של מושבות תחת מיקרוסקופ.
- לנתח כמה מושבות של לוחות המתאים עבור c-פוס מחיקה על-ידי ה-PCR. לאסוף את המושבות על-ידי מציצת אותם עם טיפ P1000. מכך התאים µL 500 ל- PBS 1 x על ידי שטיפת הקצה ב- PBS מספר פעמים. לסובב את המתלים תא ב x 6,000 g עבור 1 דקות, לחלץ את ה-DNA בגדר התא באמצעות ערכת בידוד הדנ א הגנומי.
- לשימוש ה-DNA גנומי PCR באמצעות תחל mFos-FP3 mFos-RP5, כפי שמתואר בטבלה 2. ניתוח המוצרים PCR agarose 2% ג'ל ותמונה באמצעות מערכת תיעוד ג'ל.
- עבור מצגת גרפי של המושבות, מכתים את המושבות, באמצעות Iodonitrotetrazolium כלוריד. להמיס 10 מ"ג כלוריד Iodonitrotetrazolium ב- 10 מ"ל של מים כדי להשיג פתרון 1 מ"ג/מ"ל. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מנעול זכוכית עם מסנן 0.2 µm המצורפת מזרק 10 מ"ל בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה.
- בשכונה תרביות רקמה, להוסיף 100 µL של פתרון מוכתמים dropwise סביב הצלחת CFU; יש להיזהר שלא להחליק או להפריע מושבות. דגירה הלוחות לילה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 תא תרבות חממה. המושבות יהפוך אדמדם כהה חום. באמצעות רקע לבן בשכונה תרביות רקמה סטרילי, לצלם תמונות של צלחת CFU מוכתם.
7. השתלת ואת וזמינותו התמותה
- אולם שקסמה מקרין והעכברים בקרינה מפוצל באמצעות 137 מבוסס-Cs-גמא במינון של 7.0 Gy ואחריו 4.75 Gy (0.5 Gy/דקה), 3 h בנפרד לפני ההשתלה.
- השתלת 4 x 104 ממוינת YFP-חיוביות (מחושב בהתבסס על אחוז YFP) תאים עם 3 x 105 תאים במח העצם נורמלי כנשא לתוך כל עכבר באמצעות הזנב הווריד הזרקה.
- אחרי שבוע אחד של השתלת, לקבוע את engraftment על-ידי ניתוח התאים YFP-חיוביות ממחזור הדם ההיקפיים באמצעות FACS.
-
ביצוע של דימום וריד הזנב וניתוח FACS.
- חממו את הכלוב של עכברים תחת מנורת חימום עם זהירות לא לחמם יותר מדי או לצרוב אותם.
- לרסן את עכבר restrainer העכבר, ניק את הווריד הזנב עם להב סטרילי. בעדינות חלב הזנב מן והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה, ומאפשר טיפה דם לצבור. לאסוף את הדם עם צינור קפילרי heparinized עד מלא (לאסוף סביב 75-100 µL). מזנקת הדם מילוי קפילרי ברכבת התחתית אל צינור אוסף דם המכילה EDTA ומערבבים היטב.
- Lyse RBCs על-ידי הוספת 30-40 µL של דם 3 מ ל 1 x מאגר של פירוק RBC (150 מ מ אמוניום כלוריד, 10 מ מ אשלגן ביקרבונט ו- 0.13 מ"מ EDTA). מערבבים היטב, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10-15 דק ספין-1,200 x g ב- 4 ° C 5 דק. להסיר את supernatant באמצעות ואקום, להשעות את צניפה ב 2 מ של PBS x 1 לרחיצה.
- ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, להשעות את זה במאגר FACS #1. לבצע ניתוח FACS כמתואר לעיל בשלב 5.2.5–5.2.66. החנות לטווח קצר הדם שנותרו בצינור האוסף, אשר יכול לשמש למטרות שונות אחרות, ב 4 º C.
- עכברים המושתלים שהראו 10 – 40% תאים YFP-חיוביים בדם היקפי שימשו את הניסוי. עכברים שהיו פחות מ 2% של תאים YFP-חיוביות לא נכללו במחקר.
- להכין טמוקסיפן-20 מ"ג/מ"ל שמן תירס ב 60 מעלות צלזיוס עם vortexing לסירוגין עד התפרקה לחלוטין, ואחסן אותו ב 4 ° C בחושך משך זמן הטיפול. לאחר שבוע של השתלת, למחוק אלל c-פוסחליל/חליל באמצעות הזרקת טמוקסיפן (100 מ"ג/ק"ג בשמן תירס) intraperitoneally (i.p.) לתוך העכברים, כל יום במשך שלושה ימים רצופים. חשוב כי העכברים ששקלת כדי לקבוע כמה טמוקסיפן להזריק. לאחר הטיפול טמוקסיפן (במידת הצורך), לקבץ העכברים עבור טיפולים תרופות (n = 5/קבוצה).
- לפקח על העכברים על התקדמות לוקמיה, הישרדות ולקבוע נטל לוקמיה (תאים YFP-חיוביות על ידי FACS) שבועי עד שמונה שבועות ב הישרדות העכברים.
- לנתח את הדם למחיקה c-פוס בכל מקום מתאים, כפי שתואר לעיל בסעיף 6. לרשום את מספר עכברים ששרד בכל יום, התווה את עקומת הישרדות בסוף הניסוי באמצעות תוכנה graphing.
8. העכברים הטרנסגניים מודל של לוקמיה BCR-ABL1
-
בידוד LSK
- לשמור על העכברים הטרנסגניים Scl-tTA על דוקסילין צ'או כדי למנוע ביטוי של BCR-ABL1. ארבעה שבועות לפני ההשתלה, לקחת את העכברים דוקסיציקלין צ'או לביטוי BCR-ABL1.
- לבודד TMNCs מן העכברים הטרנסגניים Scl-tTA כמתואר לעיל בסעיף 4. להשעות את TMNCs במאגר FACS #2 (1 x PBS + 0.5% BSA + 2 מ מ EDTA) כדי לקבל 106 תאים למ"ל.
- לרוקן את TMNCs עבור תאים שושלת היוחסין-חיוביות על-ידי הוספת 10 µL של שושלת היוחסין תא זיהוי קוקטייל ביוטין (ביוטין-מצומדת נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD5 [עכברוש IgG2a], CD11b [עכברוש IgG2a], CD45R [B220] [עכברוש IgG2a], אנטי-7-4 [חולדה IgG2a], אנטי-Gr-1 [Ly-6G/C, עכברוש IgG2a], ו- Anti-טר-119 [חולדה IgG2b]) לכל עונה 1 פרק 106 תאים. דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בחושך, ולאחריה שטיפה עם 5 מ של מאגר FACS #2, ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע לחלוטין ו להשעות את התאים µL 400 FACS מאגר #2.
- להוסיף 5 µL של המספר המשלים נוגדן אנטי ביוטין-FITC, µL 1.2 של Ly-6A/E (Sca1) PECy7 ו- µL 2.4 CD117 (c-Kit) APC נוגדנים עבור עד 108 מיליון תאים. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לשטוף על ידי הבאת אמצעי האחסון עד 5 מ"ל עם FACS מאגר #2; לאחר מכן, צנטריפוגה ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, להשעות את צניפה תא ב- 500 µL FACS מאגר #2.
- לסנן את המתלים תא לתוך צינור FACS מסנן-כובע כחול.
- שער תאים חיים באמצעות פיזור קדימה ואת הצד. לאחר מכן, בחר את התאים לין– הראה MFI (כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית פחות מ 102) כדי לקבל LSK תאים c-Kit+ , Sca1+ על biexponential מגרש מהאב לין– , ולמיין אותם (איור 7 C).
- איסוף תאים ממוינים, centrifuge אותם ב 1,200 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
-
השתלת
- אולם שקסמה מקרין עכברים BoyJ עם מינון הקרינה פיצול של 7.0 Gy ואחריו 4.75 Gy לאחר 3 שעות, לפני ההשתלה.
- להזריק 3 x 103 5 x 10 תאים3 BCR-ABL1-LSK עם 0.3 x 10 תאים במח העצם של המסייע6 מ- WT BoyJ עכברים דרך וריד הזנב (עירוי) לתוך העכברים BoyJ לקרינה.
- Posttransplantation ארבעה שבועות, לנתח את העכברים הנמען עבור CD45.1 ו- CD45.2. להשיג את TMNC של הדם ההיקפיים הזנב וריד מדממים כפי שמתואר בשלב 7.4. Resuspend תאי µL 100 FACS המאגר. דגירה התאים עם 1 µL כל של הנוגדן CD45.1-FITC ו- CD45.2-PE בטמפרטורת החדר מאובטח.
- לשטוף את התאים על ידי הבאת את הווליום עד 3 מ"ל עם מאגר FACS, ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע resuspend אותו ב- µL 200 ל- 1 x PBS.
- לנתח את האחוזים על CD45.1 ועל CD45.2 ידי הראשון gating של תאים חיים המבוסס על פיזור קדימה ואת הצד, ואחריו gating תאים FITC ו- PE-חיובי בהתבסס על המדגם וללא רבב.
- קבוצת העכברים לתוך ארבע קבוצות (n = 6 לכל קבוצה). נתחיל את הטיפול עם imatinib (75 מ"ג/ק"ג 2 x יומי) לבד, בשילוב עם DFC + BCI (שתי תרופות ניתנו במינון של 10 מ"ג/ק"ג 2 x מדי יום).
- באופן דומה, מתייחסים לקבוצות אחרות עם שילובים של imatinib (75 מ"ג/ק"ג) + כורכומין (150 מ"ג/ק"ג) + BCI (10 מ"ג/ק"ג) ו- imatinib (75 מ"ג/ק"ג) + NDGA (100 מ ג/ק ג) + BCI (10 מ"ג/ק"ג) למשך שלושה חודשים, 2 x יום, מאת מוזרק i.p.
- לנתח את העכברים 1 x חודש במשך שישה חודשים על לוקמיה chimerism על-ידי קביעת האחוז של CD45.2 חיובי בתאי הדם ההיקפיים עם הזנב הווריד דימום כפי שמתואר בשלב 7.4.
9. בהערכת Vivo BCI ופעילות DFC
-
ניתוח פוספו-p38
- קח שלוש לוקמיה עכברים (בת 8-12 שבועות) היו מושתלים עם BCR-ABL1-הבעת ' תאי c-Kit+ , כמתואר בסעיף 7. מזריקים העכברים BCI (10 מ"ג/ק"ג) על ידי הזרקת i.p. ארבעה שבועות posttransplant.
- למדוד את רמות הדם ההיקפיים פוספו-p38 TMNC באמצעות ערכת cytometry זרימה זרחון בהתאם להוראות של הספק. לאסוף את הדם מכל עכבר כל לפני 6 שעות לאחר הזרקת סמים. לבודד את TMNCs על ידי דלדול RBC ותקן אותן כדלקמן.
- להוסיף 4 מ"ל של RBC פירוק פתרון לכל 100 µL של דם היקפיים. לערבב, דגירה על קרח למשך 5 דקות lyse ספין RBCs. למטה התאים ב x 1,200 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על פירוק 1 x יותר.
- לאחר השלב השני פירוק, לשטוף את כדורי תא עם 1 מ"ל של BSA 2% ב- PBS. לתקן את התאים על-ידי הוספת µL 100 של קיבוע permeabilization פתרונות, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך. גלולה התא על ידי צנטריפוגה ב x 1,200 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- לשטוף את כדורי עם 1 מ"ל של 1 x permeabilization לשטוף. לחסום את התאים על-ידי הוספת µL 300 של 2% BSA במאגר לשטוף permeabilization בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות לחלק את התאים שלוש שווה aliquots של 100 µL (~ 1 x106).
- כל aliquot של תאים קבוע להוסיף 1 µL של נוגדן p-38 מוחלט, µL 1 של נוגדן פוספו-p38 או µL 1 של isotype IgG שליטה, בהתאמה, דגירה בין לילה ב 4 º C.
- לשטוף את התאים 1 x 5 מ של BSA 2% ב- PBS דגירה עם נוגדנים משניים (1 µL של אלקסה עבור חיל הים-488 מצומדת) לשעה בטמפרטורת החדר. רוחצים את התאים 1 x שוב את להשעות אותם ב- µL 200 ל- PBS 1 x.
- לרכוש את הנתונים לפי FACS ולנתח אותם על-ידי תוכנת ניתוח cytometry זרימה.
- לנכות את MFI של פקד ה-IgG מ MFI של הדגימות ניסיוני. ערכי MFI פוספו-p38 הם מנורמל אז לזה של p-38 מוחלט כדי לקבוע את רמות פוספו-p38 אחרי הזריקה BCI.
-
ניתוח ביטוי כמותי גנטי של c-פוס היעד גנים
- קח שלוש לוקמיה עכברים (8-12 שבועות), היו מושתלים עם תאי c-Kit+ BCR-ABL1-הבעת ' כמתואר בסעיף 7. לאסוף את הדם ההיקפיים כל העכבר, ולאחר מכן הוסף את העכברים עם 10 מ"ג/ק"ג כל DFC + BCI.
- לאסוף את הדם ההיקפיים 6 שעות לאחר הזרקת סמים. לבודד TMNCs על ידי דלדול RBC, כמתואר לעיל. גלולה של TMNCs ו להשעות אותם במאגר פירוק מבוסס-פנול (ראה טבלה של חומרים).
- לבצע ניתוח RT-qPCR (כמתואר בסעיף 1) Bcl2l11, Lif של IL-6 באמצעות תחל גנים ספציפיים (ראה טבלה1).
10. לטווח ארוך. מתחילה תרבות Assay תא
הערה: וזמינותו LTCIC בוצעה כפי שתואר לעיל25.
- לגדול העכבר פיברובלסט קו תא MS-5 ב- MEMα confluency בבקבוקון תרביות רקמה T175. Trypsinize התאים כפי שתואר לעיל עבור HEK293T. להשעות את התאים ב- MEMα-2 x 106 תאים למ"ל. קח6 תאים 10x10 צינור חרוטי 50 מ ל, להאיר ב 80 Gy. לדלל את התאים כדי 0.5 x 106 תאים/מ ל MEMα בתוספת 10% FBS (M10) מדיה. לוחית רישוי 2 מ"ל לכל טוב בצלחת 12-ובכן, דגירה היא c ° 37, 5% CO2 מגשים בן לילה.
- ביום הבא, להכין את hemisuccinate נתרן הידרוקורטיזון על ידי המסת 2.5 מ ג, 5 מ של MEMα (1 מ' פתרון). מסנן-לעקר הפתרון הידרוקורטיזון באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm בשכונה אבטחה. לדלל את הידרוקורטיזון על ידי דילול טורי ב MEM להשגת פתרון 100 מיקרומטר. להוסיף µL 250 זה 25 מ של אדם בינוני תרבות לטווח ארוך (HLTM) (ראה טבלה של חומרים) רק לפני לשימוש, כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
- לסובב את לוקמיה מיאלואידית כרונית-CD34+ ואת UCP3 TMNCs להשעות אותם ב HLTM על ידי vortexing קצר ו לקבוע את ספירת על ידי hemocytometer.
- לשאוב את התקשורת M10 מהצלחת 12-היטב עם תאי משתית ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של התא החולה (CML-CD34+ [10,000], UCP3 TMNCs [עונה 1 פרק 106]) השעיה ב- HLTM. השתמש משלוש בארות לכל שילוב סמים לכל סוג התא.
- לדלל את מניות סמים 2 x הריכוז הנדרש ב- HLTM. להוסיף 1 מ"ל של התקשורת עם סמים התאים הנ ל ריכוז התרופה 1 x. להחליף חצי אחד של אמצעי התקשורת HLTM טריות כל שבוע למשך חמישה שבועות.
- בסוף התקופה וזמינותו של LTC-IC שישה שבועות, לאסוף תאים nonadherent לתוך צינור התרבויות. Trypsinize תאים חסיד ולשלב אותן עם תאי nonadherent המתאימים.
- לשטוף את התאים ואת וזמינותו עבור CFUs methylcellulose בינוני המכיל 30% עגל עוברית בסרום, אריתרופויאטין (3 יחידות/mL), SF (50 ng/mL), ו- IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), גורם מגרה המושבה גרנולוציט/מקרופאג (GM-CSF) (20 ng / mL)-לקבוע את ספירת על ידי hemocytometer.
- צלחת 5 x 10 תאים4 משכפל שלוש. להקפיא את התאים הנותרים דימתיל סולפוקסיד FBS ו-10%-20%. לסדר את הלוחות בצלחת פטרי גדולה עם צלחת אחת פתוח המכיל מים באמצע. מכסה גדול הפטרי בקפידה, דגירה זה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 החממה במשך שבועיים.
- ציון המושבות, שבועיים לאחר מכן. במקרים מסוימים, רק חלק הקציר הוא לבדיקה עבור CFUs). לחשב שהמספר הכולל של LTCIC נוכח התליה תא הראשונית על ידי חיוץ בהתבסס על CFUs המתקבל חלק הקציר התא. התפוקה CFU הממוצעת לכל LTC-IC הוא 8.
הערה: לדוגמה, אם בתחילה עונה 1 פרק 106 תאים מצופים בבאר, לאחר חמישה שבועות, 0.5 x 106 תאים נקטפו, עבור CFU, 5 x 104 תאים מצופים ו 50 CFUs התקבלו. זה שווה 500 CFUs/1 מיליון תאים מצופים. מספר זה מתחלק 8 כדי לקבל את LTCIC, ובגלל זה 62.5.
11. humanized דגם העכבר באמצעות CML CD34 תאים+
- Sublethally שקסמה מקרין 8 בת שבוע הנהון scid גמא העכברים, המבטאת IL3 אנושי, GM-CSF ו- SCF (NSGS), עם מנה אחת של Gy 7.0 (700 ראד) עם 50 rads/min.
- להזריק 3 x 106 CD34+ שנבחרו תאים מחולים שלב כרונית CML BCR-ABL1-חיובית אל העכברים לקרינה בזריקה תוך ורידי.
- אחרי שבועיים של השתלת, לקבוע engraftment לוקמיה במח העצם על ידי FACS באמצעות נוגדנים ספציפיים העכבר או האדם נגד CD45.
-
ביצוע ניתוח FACS.
- קח את מח עצם וביופסיה של עצמות הירך של העכברים המושתלים. Lyse RBCs באמצעות מאגר פירוק RBC כמתואר לעיל, לאסוף את TMNCs על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולה 1 x עם PBS קר 1 x.
- לחסום את התאים עם בלוק ה-FcR האנושי של עכבר ה-FcR רחוב ואחריו מכתים עם האנטי-האדם CD45 FITC, אנטי-עכבר CD45 APCCy7 בין לילה ב 4 º C. לבצע את הניתוח FACS LSRII ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנות ניתוח cytometry זרימה.
- קבוצת העכברים לתוך ארבעה גדודים שונים (n = 6/קבוצה) על הטיפול עם הרכב, imatinib (75 מ"ג/ק"ג), DFC + BCI (שניהם ב 10 מ"ג/ק"ג), או imatinib (75 מ"ג/ק"ג) + דלק + BCI (שניהם ב 10 מ"ג/ק"ג). לדלל את הסמים מניות ב- PBS 1 x (הרכב), לנהל אותן באמצעות הזרקת אותם i.p. 2 x מדי יום.
- מתייחסים העכברים במשך שישה שבועות, לקבוע את הנטל לוקמיה כל שבועיים, עד שבוע 8 לאחר ההשתלה כפי שתואר לעיל ב- 11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התמכרות אונקוגן היה מעורב יעילות טיפולית של TKIs. עם זאת, מנגנוני נהיגה התלות אונקוגן אינם מובנים. אנו לבצע ניתוחים ביטוי ג'ין לא משוחד מרובים כדי לזהות את הרכיב הגנטי מעורב מנצח ההתמכרות. ניתוחים אלה חשף קולטנים את upregulation של שלושה גנים ג-פוס, Dusp1, Zfp36, בתאי סרטן אשר אינם תלויים איתות oncogenic להישרדות ומהוות, לפיכך, רגישות לטיפול TKI. Downregulation של c-פוס, Dusp1 על ידי נוקאאוט בתיווך shRNA מספיקה לשחזר את הסמים רגישות בשן אחרת TKI עמידים תאים.
כדי לאמת את התפקיד של c-פוס Dusp1 כמו המטרה הטיפולית של לוקמיה, ביטוי שלהם אושר לראשונה באמצעות תאים BaF3 לבטא את אונקוגן BCR-ABL1. גורם הגדילה איתות בתאים BaF3-BA abrogates אונקוגן תלות; כתוצאה מכך, הם אינם מגיבים לטיפול TKI. ניתוח ביטוי כמותי לפי RT-qPCR החיוורים ומכתים המערבי אישר כי c-פוס וגם Dusp1 הם המושרה על ידי BCR-ABL1, הביטוי שלהם הוא והנראות על ידי הגורם צמיחה IL-3 (איור 1 א' - ג' 1).
ללמוד את התפקיד של c-פוס Dusp1 ויוו, עכברים שחסרו c-פוס (מותנה העכבר דגם c-פוסחליל/חליל עם Rosa26-CreERT2) או Dusp1 (ישר קו Dusp1- / -), עכברים שחסרו c-פוס והן Dusp1 (Rosa26-CreERt2-פוסחליל/חליל/Dusp1- / - ) פותחו. עכברים אלה היו genotyped על ידי ה-PCR באמצעות ה-DNA גנומי של הזנב, ה-PCR להבחין בקלות את c-פוסחליל/חליל, Dusp1 קו של העכברים WT (איור 2א). המחיקה המושרה של c-פוס על ידי טיפול טמוקסיפן אושר ע י PCR, על ידי הופעתו של להקת בהשוואה שום להקה בעכברים אינו מטופל באמצעות טמוקסיפן (איור 2B).
כדי לבחון את התפקיד של c-פוס, Dusp1, תאים במח העצם, נגזר c-Kit+ WT, Dusp1- / -, c-פוסחליל/חליל, , Dusp1- / -/c-Fosחליל/חליל היו מבודדים, transduced עם MSCV-BCR-ABL1-Ires-YFP רטרווירוסים; תיאור סכמטי של התהליך מוצג באיור3. YFP+ לבטא (משמש כסמן הפונדקאית לביטוי BCR-ABL1) היו למיין לפי FACS (איור 4) עוד יותר במבחנה (CFU), מבחני ויוו. התוצאות מציגות המחיקה של c-פוס, Dusp1 לבד עכבות CFU מספרים (< 50%). מעניין, תאים חסר c-פוס וגם Dusp1 היו בסכנה משמעותית ביכולתם המושבה יוצרי, ו טיפול imatinib מחקו את כל CFUs, המציעה כי האובדן של c-פוס, Dusp1 הוא קטלני לאכסון לביטוי BCR-ABL1 (איור 5 ).
מבחני CFU במבחנה לאפשר לחוקרים לבדוק במהירות של פנוטיפ של קו ואת הפעילות של מעכבי מולקולה קטנה. עם זאת, בהמשך ניתוח ויוו יאשר את תוקפו של המטרות. עבור אימות ויוו, אנחנו קודם מנוצל התמרה חושית מהירה השתלת דגם1 איפה BCR-ABL1 גורם התמותה בתוך שבועיים עד שלושה שבועות. חמישים אלף תאים YFP-חיובית, יחד עם 300,000 – 500,000 הנגזרות מח עצם תאי תאים מן העכבר הנורמלי, היו מוזרק עכברים לקרינה אולם לזירוז CML. העכברים נושאת את התאים c-פוסחליל/חליל או c-פוסחליל/חלילDusp1- / - התאים הוזרקו טמוקסיפן לאחר 10 ימים של השתלת כדי למחוק את c-פוס. עכברים שקיבלו התאים- / - WT או Dusp1 פיתח לוקמיה, נכנע למוות בתוך שבועיים עד ארבעה שבועות, תוך המחיקה של c-פוס לבד הראו עיכוב משמעותי התפתחות המחלה, וטיפול TKI הציל כמעט 50% מהעכברים ממוות. מעניין, העכברים מושתלים עם תאים חסר c-פוס והן Dusp1 שרד זמן רב יותר, הטיפול TKI לרפא את כל העכברים של לוקמיה מיאלואידית כרונית (איור 6A - 6 C). העכברים ששרדו בהדרגה איבדו התאים YFP+ , כפי שמוצג c-פוס KO כפול כאשר שטופלו imatinib (איור 6D-6F), מציע את הסיווג של תאים חיוביים BCR-ABL1.
נתון כי לוקמיה מיאלואידית כרונית היא מחלה של תאי גזע, לאור חוסר היכולת של רטרווירוסים למקד את התאים hematopoietic פרימיטיבית, השבתה הדרגתית, זה חיוני כדי לבדוק אם מיקוד c-פוס, Dusp1 יהיה מספיק לחסל תאי גזע לוקמיה. טטרציקלין-inducible BCR-ABL1 העכברים הטרנסגניים איפה tTA מתבטא בכך משפר Scl, אשר מתבטאת במיוחד בתאי גזע hematopoietic, כבר נעזרו בעבר ללמוד את התפקיד של היעד גנים LSCs. טטרציקלין-inducible BCR-ABL1 העכברים הטרנסגניים (איור 7 א-7 ב) נוצלו לחקור את התפקיד של c-פוס Dusp1 ב LSCs. תאים LSK מן העכברים האלה היו מיון באמצעות FACS, מוזרק העכברים הנמען (איור 7C). אחרי חודש של השתלת, לוקמיה engraftment היה הבקיע, ולאחריו הטיפול בתרופה. הנטל לוקמיה ואת רמות של LSK היו נחושים בכל חודש במשך שישה חודשים. עכברים שטופלו imatinib לבד הראה על דיכוי של לוקמיה, אבל נשארנו עם MRD. לכן, הטיפול הפסקה, כפי שנצפו במרפאה, הביא התדרדרות המחלה. לעומת זאת, עכברים שטופלו עם שילוב של תרופות imatinib + DFC (c-פוס מעכב) + BCI (Dusp1 מעכב) מחוסלים לחלוטין תאי לוקמיה, והעכברים התרפאו של לוקמיה מיאלואידית כרונית (איור 7D ו 7-אי).
להקים את read-out דינמי-טוהר הפרמה קופ ג-פוס מעכבי Dusp1 וכן מחקר השפעתם על המטרה, פוספו-p38 רמות (סמן הפונדקאית עבור עיכוב Dusp1) נמדדו, הביטוי של גנים ג-פוס-מוסדר, כגון IL-6, bcl2l11 ו- Lif, היה לכמת. אנחנו ואחרים הקימו כי עיכוב של Dusp1 תוצאות הפעלת p38 (נמדד על ידי זירחון מוגברת של p38)13. Phospo-p38 רמות נמדדו על ידי FACS בתאי דם מבודד עכברים שטופלו בסמים. כצפוי, רמות פוספו-p38 מוגברת (איור 8א), הביטוי של גנים ג-פוס-מוסדר (IL-6, bcl2l11 ו- Lif) היו downregulated בעכברים שטופלו בסמים (איור 8ב'). תוצאות אלו מראים כי מעכבי לעכב את היעד שלהם, ההישרדות של עכברים הוא עקב עיכוב של c-פוס, Dusp1.
עבור האדם רלוונטיות, היעילות של c-פוס, מעכבי Dusp1 נבדקו באמצעות דגימות החולה במבחנה (סגן-IC), מבחני ויוו (העכבר xenografts). הטיפול עם DFC + BCI אינו יעיל בתאי גזע לוקמיה. עם זאת, שילוב של דלק + BCI imatinib באופן סלקטיבי משמידה את תאי גזע לוקמיה בשני מבחני בעוד חוסך תאי גזע נורמלי (איור 9 א - ג 9). תוצאות אלו לקבוע כי c-פוס, Dusp1 הם חיוניים עבור שינוי לוקמיה, ביטוי מוגבר של גנים אלו abrogates תלות אונקוגן וכתוצאה מכך התדרדרות המחלה-תרופתיים. לכן, קומבינטורית פילוח של c-פוס, Dusp1 יחד עם הנהג אונקוגן יהיה יעיל יותר, אולי, אסטרטגיה ריפוי סרטן רבים. אנו צופים כי בשיטות המתוארות כאן בדרך כלל ניתן להחיל עבור יעד נוסף זיהוי ואימות.
איור 1 : c-פוס, Dusp1 overexpressed בתגובה פקטורי גדילה IL-3- ניתוח qPCR ביטוי של c (A)-פוס, Dusp1 (B) בתאים BaF3-BA שטופלו ציטוקין. הביטוי היחסי נקבע לאחר נורמליזציה כדי β-אקטין. קווי השגיאה לייצג סטיית מדגימות שכפל שלוש. (ג) אנליזה תספיג של תאים BaF3-BA מטופלים עם איל-3, ובחן עם c-פוס הסיכום או נוגדן P-c-פוס, Dusp1. נוגדן אנטי-אקטין שימש טעינת פקד. איור זה הותאמה באישור Kesarwani et al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Genotyping של c-פוסחליל/חלילDusp1 ורוזה cre-ER עכברים. (א) PCR ניתוח של זנב דנ א. צפוי להקות הן WT או c-פוסחליל/חליל-נושא CreER transgene ועכברים Dusp1 קו. גודל הלהקה נקובים בצד השמאל. ניתוח (B) PCR של להקה קטנה לאחר המחיקה של c-פוס עם טיפול טמוקסיפן. M = 1 kb + סולם הדנ א. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : סכימטי של המודל התמרה חושית והשתלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : FACS מציג את התדירות של YFP+ תאים מדם של המושתלים, עכבר WT (שליטה שלילי). הלוחות המובילים להראות מגרש פיזור של התאים, את דרך השער. הלוחות התחתון הצג היסטוגרמות של YFP לעומת פיזור בצד. תאים עם MFI של > 103 נחשבו YFP +. Gating דומה שימשה עבור תאי מח עצם לאחר התמרה חושית לחישוב התמרה חושית של אחוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : צלחות נציג CFU יופיצ. הלוחות להראות את המושבות מוכתם iodonitrotetrazolium כלוריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : c-פוס ואת הליקויים Dusp1 לסכן התפתחות לוקמיה. (א-ג) הישרדות עקומות של עכברים מושתלים עם c-Kit+ תאים BCR-ABL1 WT, Dusp1- / -c-פוס- / -, c-פוס- / - Dusp1- / - בעכברים. (D-E) אחוז YFP + תאים כפי שנקבע על ידי FACS בדם ההיקפי של העכברים המושתלים נמשך posttransplant כל שבוע. להגדיל רמות YFP, העכברים להיכנע למוות WT, קו Dusp1. העכברים לשרוד בהדרגה לאבד את התאים YFP+ כפי שמוצג קו c-פוס, כפול כאשר שטופלו imatinib. איור זה הותאם באישור Kesarwani ואח. 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : c-פוס, Dusp1 נדרשים להישרדותה של LSCs. תיאור סכמטי של transgene בשימוש העכברים הטרנסגניים ביטוי BCR-ABL1 תאי גזע (A). (B) עיצוב ניסיוני ללמוד את השפעות Dusp1 וניגוד c-פוס מאת DFC ו BCI in vivo. (ג) FACS חלקות של האסטרטגיה המגביל הנדנדה משמש לצורך מיון LSK תאים עבור השתלת. (ד) אחוז התאים חיובי BCR-ABL1 (שנקבע על ידי האחוז של CD45.2 של התורם עכברים) במהלך ועכברים posttreatment עם מעכבי. (E) FACS פיזור חלקות מציג את chimerism CD45 תאים חיים, כמו גם בתוך התא תא LSK. אנא שימו לב כי העדר CD45.2 סך הכל, בתוך התא LSK עכברים שטופלו. איור זה הותאם באישור Kesarwani et al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: In vivo פעילות של דלק, BCI- (א) קו הגרף מציג את רמות פוספו-p38 לאחר הטיפול BCI. (B) RT-qPCR מציג את הביטוי של גנים ג-פוס היעד בדם ההיקפי של העכברים לאחר הטיפול DFC. הנקודות מייצגות משכפל שלושה מכל עכבר כל (n = 3). המספר מעל הגרפים מייצגים את p-הערך המחושב על-ידי הסטודנט t-מבחן. איור זה הותאם באישור Kesarwani et al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9 : תפקיד של c-פוס וניגוד DUSP1 במדגם חולה אנוש. CFUs של אחוז (א) נקבע על ידי סגן-IC וזמינותו של שני חולי CML, תורם בריא מטופלים עם הרכב או על שילובים תרופתיים המצוין. (B) אחוז תאי לוקמיה אדם (hCD45) במח העצם של עכברים NSGS-בשבוע 2 (משמאל) ובשבוע 4 (מימין) של הטיפול. (ג) לוח זה מציג נציג חלקות FACS להראות הפחתה דרמטית של תאים hCD45 העכברים שטופלו בסמים בעוד חוסך העכבר תאים המוצג כ mCD45. איור זה הותאם באישור Kesarwani et al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור חלק הארי של תאים סרטניים, התגובה הטיפולית TKI מתווך על ידי מצור של אותות טירוזין-קינאז-oncoprotein אשר הגידול הוא מכור. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על איך מיעוט של תאים סרטניים לתרום MRD לברוח אונקוגן התלות וטיפול4. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי גורם הגדילה איתות שמתווכת תרופתיים לוקמיה והן גידולים מוצק איברים. הדבר מצביע על מנגנונים מולקולריים שונים עשויה ביסוד מהותי להתנגדות10,11,12. כדי להבין את המנגנון לזיהוי מטרות הגן לפיתוח טיפולית, ביצענו פרופילי ביטוי הגנום כולו מקיף באמצעות העכבר (BaF3) ו- (K562) תאים אנושיים. ראשי דגימות עכברים לוקמיה או חולי CML לא שימשו מכיוון שחשדנו, כמו דגימות מח עצם הראשי הם באופן משמעותי הטרוגנית, הם יהיה מסכה זהותו של גנים/המטרות. אפילו את התאים לטהר על-ידי בתיווך נוגדנים מיון (תאי גזע קדמון) התערוכה הטרוגניות משמעותית. לכן, קו תא מטוהרים הוא כנראה יותר מתאים לזיהוי היעד למנוע כל המורכבות רצויה המוטלים על-ידי הטרוגניות גנטית. ניתוח הגנום כולו ביטוי זיהו כי c-פוס, Dusp1 ו- Zfp36 הם בדרך כלל upregulated תאים עמידים לתרופות. לאחר המטרות מזוהים, אימות שלהם הופך חלק הכרחי כדי לזהות את תפקידם בהקשר נתון גנטי. באמצעות ביטוי cDNA תמונות ציפורים מחקרים גנטיים בתאים BaF3 גילה כי עיכוב של c-פוס, Dusp1 הוא מספיק והכרחי רגישות TKI יעיל. אולי אחד השלבים הקריטיים ביותר באימות היעד הוא כדי לאמת את הרלוונטיות של הגנים שזוהה/מטרות בדגימות העיקרי של העכבר והן האדם. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים צעד אחר צעד ניצול של מספר דגמים גנטיים, לספק תובנות מכניסטית יותר עידון נוספת של סמים/יעד הערכה.
הקרנה מהירה ברמה התאית ניצול CFUs או וזמינותו LTCIC מסייעת לחוקרים לבחון מספר שילובים תרופתיים, כמו גם ריכוזים, מהר לפני שיטות השתלה זמן רב יותר. בהתחשב בכך לוקמיה מיאלואידית כרונית היא מחלה של תאי גזע, לאור חוסר היכולת של רטרווירוסים למקד את התאים hematopoietic פרימיטיבית, השבתה הדרגתית, זה הכרחי כדי לבחון שימוש בדגמי ישירות לטפל תפקידם בהישרדות ה-LSC. כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו מנוצל טטרציקלין-inducible BCR-ABL עכבר איפה tTA מתבטא בכך משפר Scl. למרות זאת, דגמים גנטיים הם בחוסר recapitulating המחלה האנושית. לכן, יש צורך לבחון דגימות החולה העיקרית במודלים של העכבר humanized. עם זאת, כדי שתוכל לעשות מחקר ארוכת טווח, על הגילוי של MRD לאורך זמן, xenograft יציב נדרש, בהתאם עכברים תא סוגים, עשויים להשתנות. לאחר ארבעה חודשים של השתלת תאי CD34 + האדם היו דלה גם ללא הטיפול בסמים, אשר הוא מגבלה במודלים humanized ביותר של העכבר. מודלים העכבר humanized יותר מפותחים עבור בדיקות של תאים אנושיים עכברים26. אנו ממליצים לקבוע את הפעילות ביעד של מעכבי כמו כל השפעה-יעד עלול לגרום למוות של תאים נורמליים, הגבלת היישום נוספות שלה. עם זאת, אם המטרה במורד הזרם אינו ידוע, גישות שונות צריך להיות מנוצל. לדוגמה, זיהוי המוטציות עמידים לתרופות שימוש אקראי מוטגנזה מכוונת של החלבון היעד יכול ישירות כתובת אם החומר המדכא הוא היעד27.
פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה מקיפה עבור היעד זיהוי ואימות משתמשים מרובים במבחנה ויוו דגם מערכות. שיטות אלה ניתן להתאים בקלות מטרות וסוגי סרטן אחרים. עוד מחקרים מכניסטית זיהינו מטרות, עידון סמים המיקוד עשוי לסייע בפיתוח יותר טיפולית שיטות לטיפול יעיל ו/או ריפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים ל ג ש דיילי למתן התאים BaF3 ועל ה-וואי ובונה רייה ט עבור MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. המחברים מודים ל מ קרול למתן דגימות החולה מן המשבר הפיצוץ לוקמיה מיאלואידית כרונית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים כדי M.A. מ- NCI (1RO1CA155091), לוקמיה Research Foundation, קרן V ומ NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 μM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 μm nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet (boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II (FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I (FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII (FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
- DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
- SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
- Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
