Summary
यहां, हम सी के आनुवंशिक और रासायनिक सत्यापन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन-फोस और ल्यूकेमिया में एक दवा लक्ष्य के रूप में Dusp1 इन विट्रो में और vivo में आनुवंशिक और मानव माउस मॉडल का उपयोग कर । इस विधि को आनुवंशिक सत्यापन और चिकित्सीय विकास के लिए किसी भी लक्ष्य पर लागू किया जा सकता है ।
Abstract
पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया (CML) के इलाज में tyrosine कळेनासे अवरोधकों (TKIs) का प्रदर्शन कैंसर चिकित्सकीय में एक नए युग की शुरुआत की है । हालांकि, कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी TKI उपचार का जवाब नहीं है, न्यूनतम अवशिष्ट रोग (MRD) में जिसके परिणामस्वरूप; यहां तक कि सबसे शक्तिशाली TKIs इन कोशिकाओं के उन्मूलन में विफल । इन MRD कोशिकाओं को चिकित्सा के लिए प्रतिरोध विकसित करने के लिए एक जलाशय के रूप में सेवा । क्यों TKI उपचार MRD कोशिकाओं के खिलाफ अप्रभावी है ज्ञात नहीं है । विकास कारक संकेतन TKI उपचार के दौरान MRD कोशिकाओं के अस्तित्व के समर्थन में फंसा है, लेकिन एक यंत्रवत समझ की कमी है । हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि एक उंनत सी-फोस और अभिसरण oncogenic और विकास MRD कोशिकाओं में संकेत कारक TKI प्रतिरोध मध्यस्थता का एक परिणाम के रूप में Dusp1 अभिव्यक्ति । सी के आनुवंशिक और रासायनिक निषेध-फोस और Dusp1 renders CML अति सुंदर TKIs और इलाज के लिए संवेदनशील दोनों आनुवंशिक और मानव माउस मॉडल में CML । हम इन लक्ष्य TKI-संवेदनशील और प्रतिरोधी कोशिकाओं से कई microarrays का उपयोग कर जीन की पहचान की । यहां, हम इन विट्रो और vivo माउस मॉडल में उपयोग लक्ष्य सत्यापन के लिए विधियाँ प्रदान करते हैं । इन तरीकों को आसानी से आनुवंशिक सत्यापन और चिकित्सीय विकास के लिए किसी भी लक्ष्य को लागू किया जा सकता है ।
Introduction
BCR के गठन tyrosine कळेनासे गतिविधि-ABL1 संलयन oncogene कारण CML, जो छोटे अणु अवरोधकों द्वारा कळेनासे गतिविधि को लक्षित करने के लिए एक तर्क प्रदान करता है । CML रोगियों के इलाज में TKIs की सफलता लक्षित थेरेपी1,2की अवधारणा में क्रांति । बाद में, विरोधी कळेनासे चिकित्सा परिशुद्धता दवा के रूप में ठोस ट्यूमर सहित कई अन्य द्रोही के लिए विकसित किया गया था. अब तक, तीस से अधिक कळेनासे अवरोधकों विभिंन दुष्टता के इलाज के लिए संयुक्त राज्य एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है । जबकि TKI उपचार रोग को दबाने में बहुत प्रभावी है, यह उपचारात्मक नहीं है । इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी उपचार के दौरान बनी हुई है: MRD3,4,5। यहां तक कि रोगियों को जो पूरा छूट दिखाया MRD, जो अंततः पतन में परिणाम नहीं अगर लगातार दबा के साथ छोड़ दिया जाता है । इसलिए, MRD कोशिकाओं के उंमूलन के लिए एक टिकाऊ या उपचारात्मक प्रतिक्रिया प्राप्त करने की जरूरत है । CML परिशुद्धता दवा की अवधारणा को परिभाषित करने के लिए एक मूल्यवान प्रतिमान का प्रतिनिधित्व करता है, oncogenesis के तंत्र, तर्कसंगत लक्ष्य-चिकित्सकीय निर्देशित, रोग प्रगति, और दवा प्रतिरोध । हालांकि, आज भी, TKI ड्राइविंग तंत्र कैंसर कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु प्रेरित पूरी तरह से समझ नहीं है, और न ही क्यों MRD कोशिकाओं (ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम कोशिकाओं के शामिल [LSCs]) आंतरिक रूप से4TKIs,6के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । बहरहाल, घटना "oncogene निर्भरता" के उत्परिवर्ती कळेनासे oncoprotein TKI प्रभावकारिता में फंसा जहां oncogene द्वारा लक्षित TKIs के तीव्र निषेध एक oncogenic झटका है कि एक बड़े पैमाने पर proapoptotic प्रतिक्रिया या सेल में quiescence की ओर जाता है का कारण बनता है प्रसंग-निर्भर रीति6,7,8,9। तथापि, oncogene स्वावलम्बन की यंत्रवत underpinning कमी आहे. हाल के अध्ययनों से यह है कि विकास कारक abrogates oncogene निर्भरता संकेतन और फलस्वरूप TKI चिकित्सा के लिए प्रतिरोध प्रदान फंसा है10,11,12। इसलिए, oncogene निर्भरता के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हम पूरे BCR-ABL1 आदी और नशे की लत कोशिकाओं (विकास कारकों के साथ बड़े), जो पता चला है कि सी-फोस और Dusp1 के महत्वपूर्ण मध्यस्थों है से profiling अभिव्यक्ति प्रदर्शन किया oncogene व्यसन१३. सी-फोस और Dusp1 के आनुवंशिक विलोपन BCR-ABL1-व्यक्त कोशिकाओं के लिए कृत्रिम घातक है और प्रयोग में इस्तेमाल चूहों ल्यूकेमिया विकसित नहीं किया । इसके अलावा, छोटे अणु अवरोधकों द्वारा सी-फोस और DUSP1 की बाधा चूहों में BCR-ABL1-प्रेरित CML को ठीक कर. परिणाम बताते हैं कि सी-फोस और Dusp1 की अभिव्यक्ति का स्तर कैंसर की कोशिकाओं में अपोप्तोटिक दहलीज को परिभाषित करता है, इस तरह कि निचले स्तर दवा संवेदनशीलता प्रदान करते हुए उच्च स्तर13चिकित्सा के लिए प्रतिरोध का कारण.
oncogene निर्भरता ड्राइविंग जीन की पहचान करने के लिए, हम विकास कारक की उपस्थिति और एक TKI (imatinib) दोनों माउस का उपयोग करते हुए और CML रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं (K562) में कई पूरे जीनोम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन प्रयोग किया । इन आंकड़ों CML रोगी डेटा CD34+ टेम स्टेम कोशिकाओं से पहले और imatinib के साथ उपचार के बाद से प्राप्त सेट के साथ समानांतर में विश्लेषण किया गया । इस विश्लेषण से तीन जीनों का पता चला (एक प्रतिलेखन कारक [c-फोस], दोहरी विशिष्टता फॉस्फेट 1 [Dusp1], और एक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन [Zfp36]) जो सामान्यतः TKI-प्रतिरोधी कोशिकाओं में विनियमित होते हैं । दवा प्रतिरोध प्रदान करने में इन जीनों के महत्व को मान्य करने के लिए, हम कदम-दर-कदम इन विट्रो में और vivo विश्लेषण में किए गए. इन जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर की पुष्टि रीयल-टाइम qPCR (RT-qPCR) और पश्चिमी सोख्ता की दवा प्रतिरोधी कोशिकाओं में की गई. इसके अलावा, सी-फोस, Dusp1, और Zfp36 के shRNA hairpins द्वारा सीडीएनए और पछाड़ना से पता चला कि ऊंचा सी-फोस और Dusp1 भाव पर्याप्त हैं और TKI प्रतिरोध प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं । इसलिए, हम vivo मांयता में सी-फोस और Dusp1 के साथ माउस मॉडल का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया । सी-फोस और Dusp1 के आनुवंशिक सत्यापन के लिए, हम ROSACreERT-inducible सी-फोसfl/fl चूहों (सशर्त नॉकआउट)14 और Dusp1 के साथ उन्हें पार कर-/ (सीधे नॉकआउट)15 बनाने के लिए ROSACreERT2-सी-फोसfl/ Dusp1-/- डबल-ट्रांसजेनिक चूहों । अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न सी किट+ कोशिकाओं (से सी-फोसfl/fl-, Dusp1-/-, और सी-फोसfl/flDusp1-/एक्सप्रेस BCR-ABL1 में इन विट्रो में विश्लेषण किया गया एक कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) परख, और में घातक विकिरणित चूहों में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण द्वारा vivo, सी-फोस और Dusp1 की आवश्यकता का परीक्षण करने के लिए अकेले या एक साथ ल्यूकेमिया विकास में. इसी तरह, सी-फोस के रासायनिक अवरोधों द्वारा डीएफसी (difluorinated curcumin)16 और Dusp1 द्वारा बीसीआई (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2, 3-dihydro-a-inden-1-एक)17 इन विट्रो में परीक्षण किया गया और vivo in BCR-ABL1-expression, अस्थियों का प्रयोग मज्जा-व्युत्पंन सी किट+ जंगली प्रकार (WT) माउस से कोशिकाओं । ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम सेल में सी-फोस और Dusp1 की आवश्यकता की पुष्टि करने के लिए, हमने एक CML माउस मॉडल का उपयोग किया जहां BCR-ABL1 को doxycycline (Tet-transactivator एक्सप्रेस के तहत murine स्टेम कोशिका ल्यूकेमिया (SCL) जीन 3 ' बढ़ाने के द्वारा विशेष रूप से अपने स्टेम कोशिकाओं में प्रेरित था विनियमन)18,19. हम एक में vivo प्रत्यारोपण परख में इन चूहों से अस्थि मज्जा लिन-Sca+सी-किट+ (LSK) कोशिकाओं का इस्तेमाल किया । इसके अलावा, हम phopsho-p38 स्तर और IL-6 की अभिव्यक्ति की स्थापना की pharmaco के रूप में Dusp1 और सी फोस अवरोध, vivo मेंक्रमशः, के लिए गतिशील । अंत में, मानव प्रासंगिकता के लिए अध्ययन का विस्तार करने के लिए, रोगी व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं (सी के समकक्ष-किट+ चूहों से कोशिकाओं) लंबे समय के अधीन थे इन विट्रो संस्कृति-सेल परख (LTCIC) की शुरुआत और vivo में एक मानव माउस मॉडल की CML20,21. immunodeficient चूहों CML CD34 + कोशिकाओं, दवा उपचार और मानव ल्यूकेमिया से प्रभावित सेल अस्तित्व के विश्लेषण के बाद के साथ प्रत्यारोपण किया गया ।
इस परियोजना में, हम दोनों आनुवंशिक और रासायनिक उपकरणों का उपयोग कर लक्ष्य पहचान और वैध, के लिए तरीकों को विकसित करने, विभिंन नैदानिक मॉडल का उपयोग । इन पद्धतियों सफलतापूर्वक चिकित्सीय विकास के लिए रासायनिक मोडलों के विकास के अंय लक्ष्यों को मांय करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
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Protocol
सिनसिनाटी चिल्ड्रन्स हॉस्पिटल मेडिकल सेंटर (CCHMC) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशानिर्देशों के अनुसार सभी पशु प्रयोग किए गए । मानव नमूनों (सामांय बीएम और CML (p210-BCR-ABL +) ल्यूकेमिया से) संस्थागत समीक्षा बोर्ड के माध्यम से प्राप्त-प्रोटोकॉल अनुमोदित (संस्थागत समीक्षा बोर्ड: Federalwide आश्वासन #00002988 सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल चिकित्सा केंद्र) और दाता-CCHMC और सिनसिनाटी विश्वविद्यालय से सहमति की जानकारी दी ।
1. वास्तविक समय qPCR विश्लेषण
- BaF3 कोशिकाओं से अलग कुल आरएनए RPMI में बढ़ रही 10% FBS और 10% के साथ पूरक WEHI संस्कृति माध्यम खर्च interleukin के एक स्रोत के रूप में-3 (IL-3).
- (IL-3 और imatinib) इलाज से लघुगणकीय चरण (९९% जीवित) पर कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से अनुपचारित नमूनों से फसल, और उन्हें 3 मिनट के लिए ४३५ x g पर केंद्रापसारक । स्वास्थ्य और कोशिकाओं के विकास चरणों के रूप में उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल नाटकीय रूप से बदल सकते है महत्वपूर्ण हैं ।
- कुल आरएनए22को शुद्ध करके आरएनए को अलग करना । कुल आरएनए को बढ़ाता है; फिर, यह DNase उपचार23के अधीन । डीएनए की बराबर मात्रा में कनवर्ट करें-मुक्त आरएनए (2 µ g) रिवर्स transcriptase24के साथ सीडीएनए करने के लिए ।
- प्रदर्शन जीन विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) के साथ qPCRs । ०.२ मिलीलीटर में 20 µ एल प्रतिक्रियाओं में पीसीआर बाहर ले, ऑप्टिकल कैप्स के साथ पतली घिरी पीसीआर ट्यूबों, एक 1x पोलीमरेज़ मिश्रण का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें), ०.५ प्रत्येक प्राइमर के µ मीटर, डीएनए के 1 µ एल, और पानी । thermocycler में निंनलिखित चक्र के साथ प्रतिक्रिया प्लेस: 10 मिनट के लिए चरण 1, ९५ ° c; 15 एस के लिए कदम 2, ९५ ° c; 1 मिनट के लिए ६० ° c पर चरण 3; चरण 4, दोहराएं चरण 2 – 3 ४० बार । triplicates में सभी पीसीआर निष्पादित करें और वास्तविक समय डेटा को प्लॉट करने से पहले β-actin व्यंजक को सामान्य करें ।
2. वेस्टर्न सोख्ता
नोट: पूरे सेल अर्क के रूप में केसरवानी एट अल.13 में वर्णित के रूप में lysis बफर के २५० µ एल जोड़कर तैयार किया गया था एक चिढ़ाने अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ पूरक है, और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल 2 ।
- हार्वेस्ट ५,०००,००० BaF3 कोशिकाओं लघुगणकीय चरण (९९% जीवित) से इलाज (IL-3 और imatinib) के रूप में अच्छी तरह से अनुपचारित BaF3 कोशिकाओं से के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ४३५ x g पर केंद्रापसारक द्वारा । लाइसे lysis बफर (२५० µ एल) में कोशिकाओं को pipetting ऊपर और नीचे 1x, ८० डिग्री सेल्सियस पर एक 5 मिनट की मशीन द्वारा पीछा किया । Sonicate lysate 5 के साथ सभी डीएनए को तोड़ने के लिए नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में ५ एस प्रत्येक के 6 दालों ।
- एक १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए lysate हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए १६,००० x g पर यह किसी भी अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए केंद्रापसारक । निकालने पर संग्रहीत किया जा सकता-८० ° c उपयोग तक । ८० ° c के लिए हीट नमूने लोड करने से पहले एक गर्मी ब्लॉक में 5 मिनट के लिए । 10% एसडीएस-पृष्ठ जेल पर एक जेल-लोडिंग टिप का उपयोग नमूना के 10 µ एल लोड ।
- १५० वी पर प्रोटीन का समाधान जब तक संदर्भ डाई जेल के नीचे पहुंचता है । 1 एच के लिए 1 amp में एक electrophoretic हस्तांतरण द्वारा nitrocellulose झिल्ली के लिए प्रोटीन स्थानांतरण स्थानांतरण के बाद, 1x Tris में झिल्ली बफर खारा + ०.१% के बीच 20 (TBST) 5% गैर वसा दूध के साथ 1 घंटे और जांच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ एक 1:1000 कमजोर पड़ने पर ।
- 10 मिनट प्रत्येक के लिए TBST के साथ 5x करने के लिए 3x झिल्ली धो; फिर, एक एचआरपी-संयुग्मित उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच (1:5000 कमजोर पड़ने) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए । उपयोग की गई TBST की मात्रा कंटेनर के आकार पर निर्भर करती है । TBST में झिल्ली को पूरी तरह से जलमग्न करना सुनिश्चित करें । TBST के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी 3x धो लें ।
- chemiluminescent सब्सट्रेट एजेंट का उपयोग दाग का विकास. दो बोतलों से सब्सट्रेट और बफर के बराबर मात्रा में मिश्रण, सही उपयोग करने से पहले. एक 1 मिलीलीटर पिपेट और 1 मिनट के लिए मशीन के साथ पूरी झिल्ली को कवर करने के लिए झिल्ली के शीर्ष करने के लिए सब्सट्रेट जोड़ें । दाग 1 के भीतर imaged किया जाना चाहिए-सब्सट्रेट जोड़ने के 10 मिनट ।
- कुंद संदंश का प्रयोग, ध्यान से इमेजिंग प्रणाली के मंच पर झिल्ली जगह ( सामग्री की तालिकादेखें), तरल के बहुत से परहेज । लाइव दृश्य का चयन करें और मेनू से दाग और chemiluminiscence चुनें । मैनुअल अधिग्रहण का उपयोग करना, विभिंन समय बिंदुओं पर कई जोखिम प्राप्त करते हैं । इन फ़ाइलों को visualized किया जा सकता है और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर quantified ।
3. पीटा चूहों की पीढ़ी
- ROSACreERT2 चूहों के साथ पार सी फोसfl/ fl चूहों ROSACreERT2c-फोसfl/fl चूहों13. को डबल नॉकआउट (KO) चूहों, नस्ल ROSACreERT2c-फोसfl/ Dusp1 के साथ fl चूहों-/ चूहों ROSACreERT2c-फोसfl/fl Dusp1-/- चूहों13पैदा करने के लिए । जीनोटाइप द्वारा चूहों को पूंछ क्लिप के बाद पीसीआर, नीचे वर्णित के रूप में ।
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Genotyping:
- डीएनए तैयार करने के लिए, कैंची के साथ पूंछ के एक छोटे से हिस्से क्लिप और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया । गरम कैंची से पूंछ दाग़ना । 1 एच के लिए एक गर्मी ब्लॉक में ९५ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब और मशीन में काटा हुआ पूंछ के लिए ५० mM NaOH के २०० µ एल जोड़ें ।
- भंवर ट्यूब अच्छी तरह से और, फिर, 1 एम Tris एचसीएल पीएच ६.८ और भंवर के ५० µ एल जोड़कर फिर से बेअसर । 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से ट्यूब केंद्रापसारक ।
- ०.२ मिलीलीटर में 20 µ एल प्रतिक्रियाओं में पीसीआर बाहर ले, पतली दीवारों पीसीआर ट्यूब 1x Taq पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण युक्त डाई, प्रत्येक प्राइमरी के ०.५ µ मीटर, डीएनए के 1 µ एल का उपयोग कर, और पानी । thermocycler में ट्यूबों प्लेस और उपयुक्त चक्र चलाने के रूप में 2 तालिकामें दिखाया गया है ।
- 2% agarose जेल और एक जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर छवि पर पीसीआर उत्पाद चलाते हैं ।
4. सी के अलगाव किट+ अस्थि मज्जा से कोशिकाओं
- संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार चूहों को कुर्बान करें ।
नोट: यहां, चूहों एक AVMA की सिफारिश की प्रवाह की दर के अनुसार जब तक मौत श्वसन और दिल की धड़कन की समाप्ति द्वारा निर्धारित किया गया था, ग्रीवा विस्थापन के बाद कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) को उजागर किया गया । - चूहे से टाँगेंहड्डियां फसल — दो femurs, दो tibias, दो iliacs । दूर एक स्केलपेल के साथ परिमार्जन द्वारा हड्डियों से सभी ऊतकों को साफ । बर्फ पर ठंड 1x पंजाब में पैर हड्डियों रखो-एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 5 मिलीलीटर । एक मोर्टार में ट्यूब की सामग्री डालो और यह एक मूसल से कुचलने ।
- एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से एक 10 मिलीलीटर पिपेट संलग्न के साथ एक ५० मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब में सेल निलंबन फ़िल्टर, एक पिपेट का उपयोग कर । मोर्टार और खल कोल्ड 1x पंजाबियों के साथ कई बार धो, इकट्ठा करने और ५० एमएल ट्यूब के लिए सेल निलंबन जोड़ने । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० एक्स जी में अस्थि मज्जा नीचे स्पिन. एक ग्लास पिपेट संलग्न के साथ एक निर्वात के माध्यम से supernatant निकालें । एक पिपेट के साथ 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित ।
- एक पिपेट के साथ, धीरे कमरे के तापमान के 5 मिलीलीटर के शीर्ष करने के लिए निलंबित अस्थि मज्जा जोड़ने (तापमान महत्वपूर्ण है) polysucrose, इंटरफ़ेस परेशान करने के लिए बहुत ध्यान नहीं ले. ब्रेक बंद कर दिया साथ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ४०० x g पर स्पिन ।
- एक पिपेट के साथ बादल कुल मोनो परमाणु सेल (TMNC) इंटरफेस लीजिए और एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया । धो के लिए 1x पंजाबियों के साथ 10 मिलीलीटर तक की मात्रा लाओ, गिनती के लिए 20 µ एल ले, और 5 मिनट के लिए 4 ° c पर १,२०० x g पर स्पिन । supernatant त्यागें और कदम 4.6.1 के लिए बर्फ पर गोली बचाने के लिए ।
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सी-किट+ सेल अलगाव प्रदर्शन ।
- c-किट+ सेल अलगाव के लिए एक microbead किट प्रोटोकॉल का पालन करें । ८० µ एल में सेल गोली resuspend 1x पंजाबियों + EDTA + BSA 107 कोशिकाओं के लिए । सेल सस्पेंशन करने के लिए, CD117 MicroBeads/107 कुल कोशिकाओं के 20 µ एल जोड़ें । भंवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाब + EDTA + BSA और १,२०० x g पर स्पिन जोड़कर वॉल्यूम को 10 मिलीलीटर तक लाएं ।
- एक निर्वात के माध्यम से supernatant निकालें और ५०० µ में सेल गोली निलंबित l/108 1x पंजाब में कुल कोशिकाओं + EDTA + BSA । चुंबकीय कॉलम संलग्न के साथ चुंबक स्टैंड का प्रयोग, 1x पंजाबियों + EDTA + BSA के 3 मिलीलीटर जोड़ने और यह एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं ।
- एक बार पहली बफर अतिरिक्त कॉलम के माध्यम से पारित कर दिया है, कॉलम के लिए सेल निलंबन जोड़ने के लिए, यह 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति । यह flowthrough अनचाहे कोशिका अंश है.
- 3 मिलीलीटर 1x पंजाबियों + EDTA + BSA के साथ कॉलम 3 बार धो हर बार, यह संग्रह ट्यूब में गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देता है । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर चुंबक और जगह से कॉलम निकालें ।
- 1x पंजाबियों + EDTA + BSA के 5 मिलीलीटर जोड़ें और तुरंत कॉलम के साथ प्रदान की गोताख़ोर के साथ फ्लश । गोताख़ोर निकालें और दोहराएँ 1x पंजाबियों + EDTA + BSA के एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर के साथ फ्लश । मानक विधियों का उपयोग कर कुल वॉल्यूम में कक्षों की गणना ।
- 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन । supernatant निकालें और पूरा IMDM में गोली resuspend (IMDM + 10% FBS + il-6 [10 एनजी/एमएल] + mSCF [५० एनजी/एमएल] + FLT3 ligand [20 एनजी/एमएल] + il-3 [10 एनजी/एमएल]) संस्कृति के लिए । संस्कृति इन कोशिकाओं को 2 x 106 कोशिकाओं में रातोंरात सेल IMDM पूरा मीडिया के ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2में उंहें एक मशीन में रखकर से मिलीलीटर ।
5. Transduction
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Retroviral प्लाज्मिड अभिकर्मक
- हौसले से गल HEK293 कोशिकाओं को दोपहर में पहले एक पानी ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट स्नान । 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ४३५ x g पर HEK कोशिकाओं से युक्त cryotube स्पिन । एक निर्वात के माध्यम से supernatant निकालें और 10% FBS, पेनिसिलिन, streptomycin, और glutamine के साथ पूरक DMEM के 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित.
- कोशिकाओं गिनती और एक 10 सेमी इलाज पकवान (~ 4 x 106 HEK293T कोशिकाओं) के लिए उपयुक्त मात्रा में जोड़ें । डिश के लिए DMEM 10 मीडिया के 14 मिलीलीटर जोड़ें और एक बराबर वितरण के लिए ऊपर फिसलने और नीचे से अच्छी तरह से मिश्रण । एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 मशीन रात भर में पकवान प्लेस ।
- अगली सुबह, एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप (५०% या अधिक अच्छी तरह से काम करता है) के तहत कोशिकाओं के संगम की जाँच करें ।
- डीएनए (वांछित retroviral प्लाज्मिड), PclEco (पैकेजिंग प्लाज्मिड) का मिश्रण, 2 m CaCl2, और H20 में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब (= ५०० µ l) निम्न मात्रा में एक micropipette का उपयोग कर: ७.५ डीएनए के µ g (BCR-ABL1-YFP), ७.५ µ g के PclEco, ६२ µ l के 2 M CaCl2 , और ५०० µ एल के एक अंतिम मात्रा के लिए पानी एक और १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए 2x एचबीएस के ५०० µ एल जोड़ें ।
- मिश्रण करते समय डीएनए मिक्स dropwise को १.५ एमएल ट्यूब के ५०० µ एल के 2x एचबीएस (२८० mm NaCl, १०० mm HEPES, और १.५ mm Na2HPO4) से जोड़ें । सबसे कम गति के लिए एक भंवर की स्थापना और अभिकर्मक मिश्रण जोड़ने जबकि लगातार मिश्रण के लिए उस पर एचबीएस ट्यूब पकड़ द्वारा इस हासिल.
- अभिकर्मक मिश्रण 20-कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गर्मी की अनुमति दें । मशीन के दौरान, HEK कोशिकाओं को 25 एनएम क्लोरोक्वीन जोड़ें और उंहें वापस मशीन में जगह है । इस मशीन के बाद, अभिकर्मक मिश्रण dropwise HEK कोशिकाओं को जोड़ने के लिए और, फिर, धीरे मीडिया घूमता थाली भर में अभिकर्मक मिश्रण मिश्रण करने के लिए ।
- एक ३७ ° c, 5% CO2 मशीन में ~ 8 h के लिए मिश्रण के साथ कोशिकाओं को मशीन । ताजा DMEM 10 मीडिया के 14 मिलीलीटर जोड़ने बहुत धीरे से इन कोशिकाओं पर मीडिया बदल जाते हैं । पकवान की दीवार के खिलाफ धीरे Pipetting HEK कोशिकाओं के किसी भी अलग करना रोकने में मदद करता है । ३७ ° c, 5% CO2 मशीन में रात भर कोशिकाओं को गर्मी ।
- एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ वायरल supernatant लीजिए, सिरिंज में supernatant आकर्षित, और ०.४५ µm सिरिंज फिल्टर संलग्न. एक नया संग्रह ट्यूब में वायरल supernatant डुबकी । वायरल supernatant का पहला संग्रह ले ~ 16 ज बाद में ।
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Fibronectin वायरल एकाग्रता आणि transduction
- 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट अनुपचारित करने के लिए 1x पंजाब में एक ०.१ मिलीग्राम रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा के 2 मिलीलीटर जोड़ें । आवश्यकतानुसार अधिक fibronectin तैयार करें, जो कोशिकाओं और पादी की संख्या पर निर्भर करता है. एक अच्छी तरह से पर्याप्त transduce १०,०००,००० सी किट+ कोशिकाओं कर सकते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली मशीन ।
- अगले दिन, एक पिपेट, पिपेट के साथ कुओं से fibronectin निकालें 1x पंजाब में 2% बाँझ BSA के 2 मिलीलीटर थाली ब्लॉक करने के लिए, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन । एक निर्वात के माध्यम से BSA निकालें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से धो 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर तो यह एक वैक्यूम के माध्यम से हटा दें ।
- तुरंत एकत्र और (०.४५ µm पर) वायरल supernatant 5 मिलीलीटर तक फ़िल्टर जोड़ें । 2 घंटे के लिए ३२ डिग्री सेल्सियस पर ४३५ x g पर केंद्रापसारक एक निर्वात के माध्यम से supernatant निकालें और अतिरिक्त हौसले से एकत्र वायरल supernatant के साथ इस कदम को दोहराने और फिर स्पिन । एक वैक्यूम के माध्यम से supernatant निकालें और 1x पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़कर कुओं धो; फिर, यह एक निर्वात के माध्यम से हटा दें ।
- सी-किट+ माउस कोशिकाओं है कि रात भर संस्कृति (कदम 4.6.6) सेल सस्पेंशन अच्छी तरह से मिश्रण और उंहें अब वायरल केंद्रित fibronectin प्लेट में pipetting द्वारा वायरल लेपित कुओं के लिए किया गया जोड़ें । ९० मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर स्पिन । एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 मशीन में कोशिकाओं रखो ।
- ४८ एच posttransduction, 5 मिनट के लिए 4 ° c पर १,२०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली और FACS बफर #1 (1x पंजाब + ०.५% BSA) को 6 x 106/mL. में उंहें resuspend YFP सकारात्मक का प्रतिशत को मापने के द्वारा BCR-ABL1 सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण प्रवाह cytometry का उपयोग कर ।
- मानक प्रक्रिया के साथ ईवेंट प्राप्त करना । पहला, गेट फॉरवर्ड और साइड स्कैटर के आधार पर लाइव सेल । फिर, YFP सकारात्मक रहते कोशिकाओं YFP-negativecells नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 4) द्वारा निर्धारित को छोड़कर गेट ।
6. कॉलोनी बनाने UnitAssays
- एक सुई के बिना एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक FACS ट्यूब में methylcellulose के 1 – 2 h. Aliquot 3 एमएल के लिए साइटोकिंस के लिए कमरे के तापमान पर माउस के साथ methylcellulose गल. किसी कक्ष सॉर्टर पर YFP-धनात्मक कक्षों को सॉर्ट करें.
- कोशिकाओं को नीचे स्पिन और IMDM पूरा मीडिया में गोली निलंबित । कोशिकाओं को चढ़ाया जा करने के लिए गणना और उंहें पतला IMDM पूरा मीडिया के १०० µ एल में ५,००० YFP-सकारात्मक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ।
- सेल निलंबन ५,००० YFP-सकारात्मक कोशिकाओं और methylcellulose के 3 मिलीलीटर ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए उपयुक्त अवरोधकों युक्त के १०० µ एल जोड़ें । उच्च पर भंवर यह मिश्रण करने के लिए 10 – 30 एस.
- हवाई बुलबुले के अधिकांश के बाद बच गए हैं, एक 1 एमएल सिरिंज तीन में मीडिया की 1 मिलीलीटर की नकल एक तरफ मीडिया को बाहर निकालकर 3 सेमी प्लेटों को दोहराने का उपयोग करें और एक परिपत्र गति में प्लेट झुकने धीरे समान रूप से फैल ।
- अवरोधकों के अंतिम एकाग्रता का उपयोग करने के लिए 3 µ एम पर imatinib हैं, डीएफसी पर ०.२ µ मीटर, और बीसीआई में ०.५ µ मीटर, अकेले या संयोजनों में । जहां भी उचित हो, 4-hydroxytamoxifen के साथ कोशिकाओं को चढ़ाना द्वारा सी-फोस को हटाना (1 µ g/mL) methylcellulose में जोड़ा गया ।
- चढ़ाना के बाद, बीच में बाँझ पानी की 2 मिलीलीटर युक्त एक खुली डिश के साथ एक बड़ी पेट्री डिश में प्लेटें रखो । कवर बड़े पेट्री पकवान और ध्यान से ३७ ° c, 5% CO2 मशीन पर मशीन । एक खुर्दबीन के नीचे कालोनियों की कुल संख्या की गिनती करके चढ़ाना के एक सप्ताह के बाद कॉलोनी संख्या रिकॉर्ड ।
- पीसीआर द्वारा सी-फोस विलोपन के लिए उपयुक्त प्लेटों से कुछ कालोनियों का विश्लेषण करें । एक P1000 टिप के साथ उन्हें चूसने से कालोनियों लीजिए । पंजाब में कई बार टिप धुलाई द्वारा 1x पंजाबियों के ५०० µ l में कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना । 1 मिनट के लिए ६,००० x जी में सेल निलंबन स्पिन और एक जीनोमिक डीएनए अलगाव किट का उपयोग कर सेल गोली से डीएनए निकालने ।
- mFos-FP3 और mFos-RP5, के रूप में तालिका 2में वर्णित प्राइमरों का उपयोग पीसीआर के लिए जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें । एक जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर 2% agarose जेल और छवि पर पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण ।
- कालोनियों की एक ग्राफिक प्रस्तुति के लिए, Iodonitrotetrazolium क्लोराइड का उपयोग कर, कालोनियों दाग । भंग 10 पानी की 10 मिलीलीटर में Iodonitrotetrazolium क्लोराइड के मिलीग्राम एक 1 मिलीग्राम/एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए । फ़िल्टर एक ०.२ µm एक ऊतक संस्कृति हूड में बाँझ शर्तों के तहत एक 10 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़े फिल्टर के साथ एक Luer ताला का उपयोग कर समाधान निष्फल ।
- ऊतक संस्कृति हुड में, CFU प्लेट के आसपास दाग समाधान dropwise के १०० µ एल जोड़ें; स्लाइड या कालोनियों परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना । एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 सेल संस्कृति मशीन में रात भर प्लेटें । कालोनियों डार्क लाल भूरे रंग की बारी होगी । बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में एक सफेद पृष्ठभूमि का उपयोग करना, सना हुआ CFU प्लेट की तस्वीरें ले.
7. प्रत्यारोपण और मृत्यु की परख
- घातक विकीर्ण भाजित विकिरण के साथ चूहों का उपयोग कर एक १३७ सीएस आधारित गामा-रे ७.० Gy की एक खुराक के बाद ४.७५ Gy (०.५ Gy/मिनट), 3 एच के अलावा प्रत्यारोपण से पहले ।
- प्रत्यारोपण 4 x 104 unsort-सकारात्मक (YFP के प्रतिशत के आधार पर गणना) 3 x 105 सामांय अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के साथ एक वाहक के रूप में पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्येक माउस ।
- प्रत्यारोपण के एक सप्ताह के बाद, FACS का उपयोग कर परिधीय रक्त से YFP-सकारात्मक कोशिकाओं का विश्लेषण करके engraftment निर्धारित करते हैं ।
-
एक पूंछ नस भरो और FACS विश्लेषण करते हैं ।
- सावधानी से गरम करना या उंहें जला नहीं के साथ एक गर्मी लैंप के तहत चूहों के पिंजरे गर्म ।
- एक माउस निरोधक में एक माउस को नियंत्रित और एक बाँझ ब्लेड के साथ पूंछ नस निक । धीरे पूर्वकाल से पीछे करने के लिए पूंछ दूध, एक रक्त छोड़ जमा करने की अनुमति । एक heparinized केशिका ट्यूब के साथ रक्त इकट्ठा जब तक यह भर जाता है (७५-१०० µ एल के आसपास इकट्ठा) । EDTA युक्त एक रक्त संग्रह ट्यूब में भरा केशिका ट्यूब से रक्त डुबकी और अच्छी तरह से मिश्रण ।
- लाइसे (१५० मिमी अमोनियम क्लोराइड, 10 मिमी पोटेशियम बिकारबोनिट, और ०.१३ मिमी EDTA) 3 मिलीलीटर के लिए रक्त की 30-40 µ एल जोड़कर RBCs को प्रभावित करते हैं । मिश्रण अच्छी तरह से, ट्यूब कई बार पलटना । 10 के लिए कमरे के तापमान पर मशीन-15 मिनट के लिए 4 ° c पर १,२०० x जी में स्पिन 5 मिनट के लिए । एक निर्वात के माध्यम से supernatant निकालें और एक धोने के लिए 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर में गोली निलंबित ।
- 5 मिनट के लिए 4 ° c पर १,२०० x g पर स्पिन । supernatant निकालें और इसे FACS बफ़र #1 में निलंबित । कदम 5.2.5-5.2.66 में ऊपर वर्णित के रूप में FACS विश्लेषण बाहर ले । अल्पकालिक स्टोर संग्रह ट्यूब में शेष रक्त, जो विभिन्न अन्य प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, 4 डिग्री सेल्सियस पर.
- प्रत्यारोपण चूहों कि पता चला 10 – 40% YFP-परिधीय रक्त में सकारात्मक कोशिकाओं प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया. चूहों कि YFP-सकारात्मक कोशिकाओं के 2% से कम था अध्ययन से बाहर रखा गया ।
- ६० डिग्री सेल्सियस पर मकई के तेल में 20 मिलीग्राम/मिलीलीटर में पूरी तरह से भंग जब तक आंतरायिक भंवर के साथ tamoxifen तैयार है, और यह इलाज की अवधि के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । प्रत्यारोपण के एक सप्ताह के बाद, tamoxifen इंजेक्शन द्वारा सी-फोसfl/fl एलील (मकई तेल में १०० मिलीग्राम/किग्रा) intraperitoneally (आईएफसआई) चूहों में, हर दिन लगातार तीन दिनों के लिए । यह महत्वपूर्ण है कि चूहों को कितना tamoxifen इंजेक्षन करने के लिए निर्धारित करने के लिए तौला जाता है. tamoxifen उपचार (जहां उपयुक्त हो) के बाद, दवा उपचार के लिए चूहों समूह (n = 5/
- लेकिमिया प्रगति और अस्तित्व के लिए चूहों पर नजर रखने और ल्यूकेमिया से प्रभावित बोझ (YFP-FACS द्वारा सकारात्मक कोशिकाओं) साप्ताहिक जीवित चूहों में आठ सप्ताह तक का निर्धारण ।
- धारा 6 में ऊपर बताए गए अनुसार जहां भी उचित हो, सी-फोस विलोपन के लिए रक्त का विश्लेषण करें । हर दिन जीवित चूहों की संख्या रिकॉर्ड और एक रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रयोग के अंत में अस्तित्व की अवस्था साजिश ।
8. ट्रांसजेनिक चूहों BCR-ABL1 ल्यूकेमिया के मॉडल
-
LSK अलगाव
- BCR-ABL1 की अभिव्यक्ति को रोकने के लिए doxycycline चाउ पर Scl-tTA ट्रांसजेनिक चूहों को बनाए रखें । प्रत्यारोपण से पहले चार सप्ताह, चूहों BCR-ABL1 अभिव्यक्ति के लिए doxycycline चाउ से दूर ले ।
- अनुभाग 4 में ऊपर बताए गए अनुसार Scl-tTA ट्रांसजेनिक चूहों से TMNCs को अलग करना । FACS बफर #2 में TMNCs निलंबित (1x पंजाब + ०.५% BSA + 2 mM EDTA) 106 कोशिकाओं/एमएल प्राप्त करने के लिए ।
- वंश के लिए TMNCs को चूस-धनात्मक कोशिकाओं को जोड़ने के 10 µ एल वंश सेल का पता लगाने कॉकटेल बायोटिन (बायोटिन-संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ CD5 [चूहा IgG2a], CD11b [चूहा IgG2a], CD45R [B220] [चूहा IgG2a], विरोधी 7-4 [चूहा IgG2a], विरोधी जीआर-1 [-6G/ IgG2a], और विरोधी-तेर-११९ [चूहा IgG2b]) प्रति 1 x 106 कोशिकाओं । अंधेरे में 10 मिनट के लिए 4 ° c पर कोशिकाओं की मशीन, FACS बफर #2 के 5 मिलीलीटर के साथ एक धोने के बाद, और 4 ° c पर १,२०० x g पर स्पिन के लिए 5 min. महाप्राण supernatant पूरी तरह से और FACS बफर #2 के ४०० µ एल में कोशिकाओं को निलंबित ।
- विरोधी के 5 µ एल-बायोटिन एंटीबॉडी-FITC संयुग्मी, १.२ µ एल के 6A/ई (Sca1) PECy7, और µ के २.४ CD117 एल जोड़ें (सी किट) 108 लाख कोशिकाओं के लिए APC एंटीबॉडी । 10 min. FACS बफर #2 के साथ 5 मिलीलीटर तक मात्रा लाकर धोने के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में मशीन; फिर, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और FACS बफर #2 के ५०० µ एल में सेल गोली निलंबित ।
- सेल सस्पेंशन को ब्लू फिल्टर-कैप FACS ट्यूब में फिल्टर करें ।
- गेट लाइव आगे और साइड बिखराव का उपयोग कर कोशिकाओं. फिर, लिन- कोशिकाओं है कि MFI दिखाया का चयन करें (से कम 102का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता) LSK कोशिकाओं सी किट+ और Sca1+ लिन- जनक से एक biexponential भूखंड पर पाने के लिए, और उंहें तरह (चित्रा 7 ग).
- क्रमबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर केंद्रापसारक ।
-
ट्रांसप्लांटेशन
- घातक विकीर्ण ७.० Gy के विभाजन विकिरण खुराक के साथ BoyJ चूहों के बाद ४.७५ Gy के बाद 3 ज, प्रत्यारोपण से पहले.
- सुई 3 एक्स 103 से 5 एक्स 103 BCR-ABL1-LSK कोशिकाओं के साथ ०.३ x 106 सहायक अस्थि मज्जा कोशिकाओं से पूंछ नस (BoyJ) के माध्यम से WT i.v. चूहों विकिरणित BoyJ चूहों में.
- चार सप्ताह posttransplantation, cd 45.1 और cd 45.2 के लिए प्राप्तकर्ता चूहों का विश्लेषण करें । चरण ७.४ में वर्णित के रूप में पूंछ नस रक्तस्राव के द्वारा परिधीय रक्त से TMNC प्राप्त करें । FACS बफ़र के १०० µ l में कक्षों को पुनर्स्थगित । 1 µ के साथ कोशिकाओं को मशीन करें l प्रत्येक cd 45.1-FITC और cd 45.2-PE एंटीबॉडी के लिए कमरे के तापमान पर 1 ज.
- FACS बफर के साथ 3 मिलीलीटर की मात्रा को लाकर कोशिकाओं को धो लें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर स्पिन करें । supernatant निकालें और यह 1x पंजाबियों के २०० µ एल में resuspend ।
- पहले गेटिंग और साइड स्कैटर के आधार पर लाइव कोशिकाओं को गेटिंग FITC-और पीई पॉजिटिव कोशिकाओं के आधार पर दाग नमूने पर आधारित द्वारा सीडी 45.1 और सीडी 45.2 पर प्रतिशत का विश्लेषण करें ।
- चार समूहों (n = 6 प्रति समूह) में चूहों समूह । imatinib के साथ उपचार शुरू (७५ mg/किलो 2x दैनिक) अकेले और संयोजन में डीएफसी + बीसीआई (दोनों दवाओं के एक खुराक पर दिया गया था 10 मिलीग्राम/
- इसी तरह, imatinib के संयोजन के साथ अन्य समूहों का इलाज (७५ मिलीग्राम/+ curcumin (१५० मिलीग्राम/+ बीसीआई (10 मिलीग्राम/) और imatinib (७५ मिलीग्राम/+ NDGA (१०० मिलीग्राम/+ बीसीआई (10 मिलीग्राम/तीन महीने के लिए), 2x एक दिन, इंजेक्शन आईएफसआई द्वारा
- ७.४ चरण में वर्णित के रूप में पूंछ नस रक्तस्राव द्वारा परिधीय रक्त में सीडी 45.2 सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करके ल्यूकेमिया से प्रभावित chimerism के लिए छह महीने के लिए चूहों 1x एक महीने का विश्लेषण ।
9. वीवो और डीएफसी गतिविधि के Vivo मूल्यांकन में
-
Phospho-p38 विश्लेषण
- BCR-ABL1-एक्सप्रेस सी-किट+ कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपण किया गया है कि तीन ल्यूकेमिया से प्रभावित चूहों (8-12 सप्ताह पुरानी) लो, जैसा कि खंड 7 में वर्णित है । बीसीआई के साथ चूहों का इंजेक्शन (10 मिलीग्राम/आईएफसआई इंजेक्शन लगाकर चार सप्ताह posttransplant.
- आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार फास्फारिलीकरण फ्लो cytometry किट का उपयोग करके phospho-p38 परिधीय रक्त TMNC के स्तरों को मापने । इससे पहले प्रत्येक चूहे से खून और 6 एच के बाद दवा इंजेक्शन लीजिए. आरबीसी कमी से TMNCs को अलग और उंहें इस प्रकार के रूप में ठीक ।
- परिधीय रक्त के १०० µ एल प्रति आरबीसी lysis समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें । मिश्रण और 5 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी लाइसे RBCs । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और supernatant हटा दें । lysis 1x अधिक दोहराएं ।
- दूसरा lysis कदम के बाद, पंजाब में 2% BSA के 1 मिलीलीटर के साथ सेल छर्रों धो लो । निर्धारण और permeabilization समाधान के १०० µ एल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेल गोली ।
- 1x permeabilization वॉश के 1 एमएल के साथ छर्रों धो लें । permeabilization वॉश बफर में 2% BSA के ३०० µ एल जोड़कर कोशिकाओं को ब्लॉक 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर. १०० µ एल प्रत्येक (~ 1 x106) के तीन बराबर aliquots में कोशिकाओं को विभाजित ।
- निश्चित कोशिकाओं के प्रत्येक aliquot के लिए कुल पी के 1 µ एल जोड़ें-३८ एंटीबॉडी, phospho के 1 µ एल-p38 एंटीबॉडी, या µ isotype नियंत्रण के 1 आईजीजी एल, क्रमशः, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन ।
- पंजाब में 2% BSA के 5 मिलीलीटर और माध्यमिक एंटीबॉडी (Alexa Fluor के 1 µ l-४८८ संयुग्मित) के साथ गर्मी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं 1x धो लो । कोशिकाओं 1x फिर से धो और उंहें २०० µ में निलंबित 1x पंजाब के एल ।
- FACS द्वारा डेटा प्राप्त करने और प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर के द्वारा उन्हें विश्लेषण.
- आईजीजी नियंत्रण के mfi प्रयोगात्मक नमूनों की mfi से काटेंगे । phospho के MFI मूल्यों-p38 तो कुल पी ३८ की है कि बीसीआई इंजेक्शन के बाद phospho-p38 स्तर निर्धारित करने के लिए सामान्यीकृत हैं ।
-
सी-फोस लक्ष्य जीन की मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण
- तीन ल्यूकेमिया से प्रभावित चूहों (8-12 सप्ताह पुरानी) ले लो, कि BCR-ABL1-व्यक्त सी किट+ कोशिकाओं के रूप में खंड 7 में वर्णित के साथ प्रत्यारोपण किया गया । प्रत्येक माउस से परिधीय रक्त लीजिए और फिर डीएफसी + बीसीआई के प्रत्येक 10 मिलीग्राम/किलो के साथ चूहों इंजेक्षन ।
- दवा इंजेक्शन के बाद परिधीय रक्त 6 एच लीजिए । ऊपर वर्णित के रूप में आरबीसी कमी, द्वारा TMNCs को अलग । TMNCs गोली और उंहें एक phenol-आधारित lysis बफर में निलंबित ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- आर टी-qPCR विश्लेषण बाहर ले (के रूप में खंड 1 में वर्णित) Bcl2l11, लिफ, और IL-6 जीन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करने के लिए ( 1 तालिकामें दिखाया गया है) ।
10. दीर्घकालिक संस्कृति-प्रकोष्ठ की शुरुआत परख
नोट: एक LTCIC परख के रूप में पहले25वर्णित प्रदर्शन किया गया ।
- MEMα में एक T175 टिशू कल्चर कुप्पी में प्रवाहित करने के लिए एक माउस fibroblast सेल लाइन MS-5 बढ़ाएँ । HEK293T के लिए ऊपर बताए गए अनुसार कक्षों को Trypsinize । 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल पर MEMα में कोशिकाओं को निलंबित । 10 x 106 कोशिकाओं में एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब और विकीर्ण ८० Gy पर ले लो । MEMα में 10% FBS (M10) मीडिया के साथ पूरक ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए कोशिकाओं को पतला । एक 12-अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से प्रति प्लेट 2 मिलीलीटर और यह एक ३७ ° c, 5% CO2 मशीन रातोंरात में मशीन ।
- अगले दिन, MEMα (1 मी समाधान) के 5 मिलीलीटर में २.५ मिलीग्राम भंग करके hydrocortisone सोडियम hemisuccinate तैयार करें । फिल्टर-hydrocortisone एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर के साथ-साथ सुरक्षा हूड का उपयोग कर समाधान निष्फल । मेम में सीरियल कमजोर पड़ने से hydrocortisone पतला एक १०० µ एम समाधान प्राप्त करने के लिए । मानव दीर्घकालिक संस्कृति मध्यम (HLTM) ( सामग्री की तालिकादेखें) बस का उपयोग करने से पहले, 1 µ एम के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए इस के 25 मिलीलीटर के २५० µ एल जोड़ें ।
- नीचे CML-CD34+ और UCP3 TMNCs स्पिन और उंहें HLTM में संक्षिप्त भंवर से निलंबित है, और एक hemocytometer द्वारा गिनती निर्धारित करते हैं ।
- M10 मीडिया से 12-अच्छी तरह प्लेट स्ट्रोमा कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त है और यह रोगी कोशिका के 1 मिलीलीटर (CML-CD34+ [१०,०००] और UCP3 TMNCs [1 x 106]) के साथ प्रतिस्थापित करने के लिए बंद निर्वात HLTM में । प्रति दवा संयोजन प्रति कोशिका प्रकार तीन कुओं का उपयोग करें ।
- HLTM में आवश्यक एकाग्रता के 2x के लिए दवाओं के शेयरों को पतला । एक 1x दवा एकाग्रता प्राप्त करने के लिए उपर्युक्त कोशिकाओं के लिए दवाओं के साथ मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें । पांच हफ्तों के लिए हर हफ्ते नए सिरे से तैयार HLTM के साथ एक-डेढ़ मीडिया को बदलें ।
- छह सप्ताह के एलटीसी-आईसी परख अवधि के अंत में, संस्कृतियों से एक ट्यूब में nonadherent कोशिकाओं को इकट्ठा । Trypsinize अनुयाई कोशिकाओं और उंहें इसी nonadherent कोशिकाओं के साथ गठबंधन ।
- methylcellulose मध्यम में CFUs के लिए कोशिकाओं और परख धो 30% भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त, erythropoietin (3 इकाइयों/एस एफ (५० एनजी/एमएल), और आईएल-3 (20 एनजी/एमएल), आईएल-6 (20 एनजी/एमएल), जी सीएसएफ (20 एनजी/एमएल), और granulocyte/मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) (20 एनजी/ mL). एक hemocytometer द्वारा गिना निर्धारित करते हैं ।
- प्लेट 5 x 104 कोशिकाओं में तीन प्रतिकृति । शेष कक्षों को 20% FBS और 10% DMSO में फ़्रीज़ करें । एक बड़े पेट्री डिश में प्लेटों को बीच में पानी युक्त एक खुली डिश के साथ व्यवस्थित करें । कवर बड़े पेट्री पकवान ध्यान से और यह एक ३७ ° c, 5% सह दो सप्ताह के लिए2 मशीन में मशीन ।
- दो सप्ताह बाद कालोनियों का स्कोर । कुछ मामलों में, फसल का केवल एक हिस्सा CFUs के लिए परख की जाती है) । सेल हार्वेस्ट के भाग से प्राप्त CFUs के आधार पर extrapolating द्वारा आरंभिक कक्ष निलंबन में उपस्थित LTCIC की कुल संख्या की गणना करें । एलटीसी-आईसी प्रति औसत CFU आउटपुट 8 है ।
नोट: उदाहरण के लिए, यदि शुरू में 1 x 106 कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से चढ़ाया गया, पांच हफ्तों के बाद, ०.५ x 106 कोशिकाओं काटा गया था, और CFU के लिए, 5 x 104 कोशिकाओं चढ़ाया और ५० CFUs प्राप्त किए गए थे । यह ५०० CFUs/1 लाख मढ़वाया कोशिकाओं के बराबर होती है । LTCIC, जो ६२.५ है पाने के लिए 8 से इस संख्या में विभाजित करें ।
11. मानवीय CML CD34+ कोशिकाओं का उपयोग माउस मॉडल
- घातक विकीर्ण 8 सप्ताह पुरानी मंजूरी scid गामा चूहों, मानव IL3 व्यक्त, जीएम सीएसएफ और एससीएफ (NSGS), ७.० Gy की एक खुराक के साथ (७०० राड) ५० राड के साथ/
- नसों में इंजेक्शन द्वारा विकिरणित चूहों में BCR-ABL1-सकारात्मक CML जीर्ण चरण के रोगियों से 3 एक्स 106 CD34+ चयनित कोशिकाओं इंजेक्षन ।
- प्रत्यारोपण के दो सप्ताह के बाद, FACS द्वारा अस्थि मज्जा में ल्यूकेमिया से प्रभावित engraftment निर्धारित माउस का उपयोग कर-और मानव-CD45 के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी ।
-
एक FACS विश्लेषण करते हैं ।
- प्रत्यारोपित चूहों के femurs से अस्थि मज्जा महाप्राण ले. लाइसे RBCs आरबीसी lysis बफर का उपयोग कर के रूप में ऊपर वर्णित है और केंद्रापसारक द्वारा TMNCs इकट्ठा । कोल्ड 1x पंजाबियों के साथ गोली 1x धो लो ।
- मानव FcR ब्लॉक और माउस FcR ब्लॉक के साथ विरोधी मानव CD45 FITC और विरोधी माउस CD45 के साथ धुंधला द्वारा पीछा ब्लाकों के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात Cy7 । LSRII पर FACS विश्लेषण निष्पादित करें और प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण ।
- वाहन के साथ उपचार के लिए चूहों को चार विभिन्न साथियों (एन = 6/समूह) में समूहीकृत करें, imatinib (७५ मिलीग्राम/किलो), डीएफसी + बीसीआई (दोनों में 10 मिलीग्राम/किग्रा), या imatinib (७५ मिलीग्राम/+ डीएफसी + बीसीआई (दोनों में 10 मिलीग्राम/ 1x पंजाब में शेयर दवाओं (वाहन) पतला और उंहें आईएफसआई 2x दैनिक इंजेक्शन द्वारा उंहें प्रशासन ।
- छह सप्ताह के लिए चूहों का इलाज और ल्यूकेमिया से प्रभावित बोझ हर दो सप्ताह का निर्धारण, ११.४ में ऊपर वर्णित के रूप में प्रत्यारोपण के बाद सप्ताह आठ तक.
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Representative Results
Oncogene की लत को TKIs की चिकित्सीय प्रभावकारिता में फंसाया गया है. हालांकि, oncogene निर्भरता ड्राइविंग तंत्र समझ में नहीं आ रहे हैं । हम कई निष्पक्ष जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन की लत उद्घोष में शामिल आनुवंशिक घटक की पहचान । इन विश्लेषण तीन जीन, सी-फोस, Dusp1, और Zfp36, कैंसर की कोशिकाओं है कि अस्तित्व के लिए संकेतन oncogenic पर निर्भर नहीं कर रहे है और इस प्रकार, TKI उपचार के लिए असंवेदनशील है के ऊपर के विनियमन से पता चला । shRNA-मध्यस्थता पछाड़ना द्वारा सी-फोस और Dusp1 की downregulation अन्यथा TKI प्रतिरोधी कोशिकाओं में औषध संवेदनशीलता को बहाल करने के लिए पर्याप्त है.
ल्यूकेमिया में चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में सी-फोस और Dusp1 की भूमिका को मान्य करने के लिए, उनके व्यक्त पहले BCR-ABL1 oncogene व्यक्त BaF3 कोशिकाओं का उपयोग कर की पुष्टि की थी. विकास फैक्टर BaF3-BA कोशिकाओं में संकेतन abrogates oncogene निर्भरता; एक परिणाम के रूप में, वे TKI उपचार का जवाब नहीं है । आर सी-qPCR और पश्चिमी सोख्ता द्वारा मात्रात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण की पुष्टि की है कि दोनों सी-फोस और Dusp1 BCR-ABL1 द्वारा प्रेरित कर रहे है और उनकी अभिव्यक्ति आगे वृद्धि कारक IL-3 (आंकड़ा 1a - 1C) द्वारा संवर्धित है ।
विवो में सी-फोस और Dusp1 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, चूहों कमी सी-फोस (सशर्त माउस मॉडल सी-फोसfl/fl के साथ Rosa26-CreERT2) या Dusp1 (सीधे KO Dusp1-/-) और चूहों दोनों की कमी सी-फोस और Dusp1 (Rosa26-CreERT2-फोसfl/fl/Dusp1-/ ) विकसित किए गए । ये चूहे पूंछ से जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर पीसीआर द्वारा genotyped थे, और पीसीआर आसानी से WT चूहों (चित्रा 2ए) से सी-फोसflfl, Dusp1 KO प्रतिष्ठित । tamoxifen उपचार द्वारा सी-फोस के प्रेरित विलोपन tamoxifen (चित्रा 2बी) के साथ इलाज नहीं चूहों में कोई बैंड की तुलना में एक बैंड की उपस्थिति के द्वारा, पीसीआर द्वारा पुष्टि की गई थी ।
सी-फोस और Dusp1 की भूमिका का परीक्षण करने के लिए, अस्थि मज्जा-प्राप्त सी-किट+ कोशिकाओं से WT, Dusp1-/-, सी-फोसfl/fl, and Dusp1-//c-Fosfl/fl अलग थलग पड़ गए थे और transduced के साथ MSCV-BCR-ABL1-आयरेस-YFP retroviruses; प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्र 3में दिखाया गया है । YFP+ व्यक्त (BCR-ABL1 अभिव्यक्ति के लिए एक किराए मार्कर के रूप में प्रयुक्त) FACS द्वारा क्रमबद्ध (चित्रा 4) इन विट्रो में आगे के लिए (CFU) और vivo परख में थे । परिणाम बताते है कि सी के विलोपन-फोस और Dusp1 अकेले CFU संख्या बाधित (< 50%) । दिलचस्प है, दोनों सी की कमी कोशिकाओं फोस और Dusp1 काफी उनकी कॉलोनी बनाने की क्षमता में समझौता किया गया, और imatinib उपचार सभी CFUs पोंछा, सुझाव है कि सी के नुकसान-फोस और Dusp1 कृत्रिम रूप से BCR के लिए घातक है-ABL1 अभिव्यक्ति (चित्रा 5 ).
इन विट्रो CFU परख शोधकर्ताओं को जल्दी से KO और छोटे अणु अवरोधकों की गतिविधि के phenotype परीक्षण करने के लिए सक्षम करें । हालांकि, vivo विश्लेषण में आगे लक्ष्यों की वैधता की पुष्टि करेगा । vivo मांयता में के लिए, हम पहली बार एक त्वरित transduction ट्रांसप्लांटेशन मॉडल1 का उपयोग जहां BCR-ABL1 दो से तीन सप्ताह के भीतर मृत्यु का कारण बनता है । ५०००० YFP-सकारात्मक कोशिकाओं, 300000 के साथ-500000 अस्थि मज्जा-व्युत्पंन mononuclear कोशिकाओं सामान्य माउस से, विकिरणित प्रेरित करने के लिए घातक रूप से CML चूहों में इंजेक्ट किया गया. सी-फोसfl/ fl कोशिकाओं या सी-फोसfl/flDusp1-/- कोशिकाओं को ले जाने वाले चूहों सी फोस को नष्ट करने के लिए प्रत्यारोपण के 10 दिनों के बाद tamoxifen के साथ इंजेक्शन थे. चूहों कि या तो WT या Dusp1 प्राप्त-/- कोशिकाओं लेकिमिया विकसित की है और दो से चार सप्ताह के भीतर मौत का शिकार है, जबकि सी के विलोपन-फोस अकेले रोग के विकास में एक महत्वपूर्ण देरी दिखाया, और TKI उपचार चूहों की मौत से लगभग ५०% बचाया । दिलचस्प है, दोनों सी-फोस और Dusp1 की कमी कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित चूहों अब बच गया, और TKI उपचार CML के सभी चूहों (चित्रा 6A - 6C) ठीक हो गया. चूहों कि उत्तरोत्तर बच YFP+ कोशिकाओं को खो दिया है, के रूप में सी में दिखाया फोस और डबल KO जब imatinib के साथ इलाज (चित्रा 6D-6F), BCR-ABL1 सकारात्मक कोशिकाओं की मंजूरी का सुझाव.
यह देखते हुए कि CML एक स्टेम कोशिका रोग है, और retroviruses के आदिम और quiescent टेम कोशिकाओं को लक्षित करने की अक्षमता को देखते हुए, यह परीक्षण करने के लिए आवश्यक है कि क्या लक्ष्यीकरण सी-फोस और Dusp1 ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम कोशिकाओं को खत्म करने के लिए पर्याप्त होगा । टेट्रासाइक्लिन-inducible BCR-ABL1 ट्रांसजेनिक चूहों जहां tTA एक Scl बढ़ाने, जो विशेष रूप से टेम स्टेम सेल में व्यक्त किया जाता है द्वारा व्यक्त किया है, पहले से LSCs में लक्ष्य जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है । ट्रांसजेनिक में सी-7A और 7B की भूमिका की जांच करने के लिए टेट्रासाइक्लिन-inducible BCR-ABL1 फोस चूहों (फिगर Dusp1-LSCs) का उपयोग किया गया । इन चूहों से LSK कोशिकाओं FACS का उपयोग कर हल किया गया और प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन (चित्रा 7सी). प्रत्यारोपण के एक महीने के बाद, ल्यूकेमिया से प्रभावित engraftment रन बनाए, दवा उपचार के बाद किया गया था । ल्यूकेमिया से प्रभावित बोझ और LSK के स्तर को हर महीने छह महीने के लिए निर्धारित किया गया था । अकेले imatinib के साथ इलाज चूहों ल्यूकेमिया का दमन दिखाया लेकिन MRD के साथ छोड़ दिया गया । इसलिए, उपचार विच्छेदन, के रूप में क्लिनिक में मनाया, रोग पतन के परिणामस्वरूप । इसके विपरीत, चूहों दवाओं के संयोजन के साथ इलाज किया imatinib + डीएफसी (सी-फोस अवरोध करनेवाला) + बीसीआई (Dusp1 अवरोधक) पूरी तरह से ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं का उन्मूलन, और चूहों CML (चित्रा 7d और 7E) के ठीक थे.
c-फोस और Dusp1 अवरोधकों के लिए pharmaco-गतिशील पढ़ने के लिए बाहर की स्थापना करने के लिए और उनके पर लक्ष्य प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, phospho-p38 स्तर (Dusp1 अवरोध के लिए एक किराए मार्कर) मापा गया और सी की अभिव्यक्ति-फोस-विनियमित जीन, जैसे IL-6, bcl2l11, और लिफ, quantified था । हम और दूसरों की स्थापना की है कि p38 के सक्रियकरण में Dusp1 परिणाम के निषेध (p38 की वृद्धि हुई फास्फारिलीकरण द्वारा मापा)13. Phospo-p38 स्तर पूरे में FACS द्वारा मापा गया-रक्त दवा इलाज चूहों से अलग कोशिकाओं. जैसा कि अपेक्षित था, phospho-p38 का स्तर बढ़ा (चित्रा ८ए) और सी-फोस-विनियमित जीन (आईएल-६, bcl2l11, और लिफ) की अभिव्यक्ति औषध-व्यवहारिक चूहों (चित्रा ८बी) में downregulated की गई. इन परिणामों का सुझाव है कि अवरोधकों अपने लक्ष्य को रोकते हैं और चूहों के अस्तित्व के कारण सी-फोस और Dusp1 के निषेध है.
मानव प्रासंगिकता के लिए, सी-फोस और Dusp1 अवरोधकों की प्रभावकारिता में इन विट्रो (एलटीसी-आईसी) में रोगी के नमूनों का उपयोग कर परीक्षण किया गया और vivo परख (माउस xenografts) में. डीएफसी + बीसीआई के साथ इलाज ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम सेल पर प्रभावी नहीं है । हालांकि, डीएफसी का एक संयोजन + बीसीआई + imatinib चुनिंदा दोनों परख में ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम कोशिकाओं उंमूलन जबकि सामांय स्टेम सेल (चित्रा 9A - 9C) बख्शते । इन परिणामों की स्थापना कि सी-फोस और Dusp1 ल्यूकेमिया से प्रभावित परिवर्तन के लिए आवश्यक हैं, और इन जीनों की एक ऊंचा अभिव्यक्ति abrogates oncogene रोग पतन और दवा प्रतिरोध में जिसके परिणामस्वरूप निर्भरता । इसलिए, ड्राइवर oncogene के साथ सी-फोस और Dusp1 का मिश्रित लक्ष्यीकरण अधिक प्रभावी होगा और शायद, कई प्रकार के कैंसर के लिए एक उपचारात्मक रणनीति । हमें आशंका है कि यहां वर्णित तरीके आम तौर पर अतिरिक्त लक्ष्य पहचान और सत्यापन के लिए लागू किया जा सकता है ।
चित्रा 1 : c-फोस और Dusp1 वृद्धि कारक IL-3 के जवाब में व्यक्त कर रहे हैं । (क) सी-फोस और (ख) Dusp1 में cytokine-उपचारित BaF3-बा कोशिकाओं के एक एक् सप्रेस का qPCR विश्लेषण । β-actin के लिए सामान्यीकरण के बाद संबंधित व्यंजक निर्धारित किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन से तीन प्रतिकृति नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) BaF3-बा कोशिकाओं का पश्चिमी दाग विश्लेषण IL-3 के साथ इलाज किया और सी-फोस कुल या पी-सी-फोस और Dusp1 एंटीबॉडी के साथ जांच की । एंटी-actin एंटीबॉडी लोड नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था । यह आंकड़ा केसरवानी एट अल.13से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : Genotyping c-फोसfl/flDusp1 और रोजा cre-एर चूहों । (क) टेल डीएनए का पीसीआर एनालिसिस । उंमीद बैंड WT से या सी-फोसfl/fl-ले CreER transgene और Dusp1 KO चूहों से कर रहे हैं । बैंड आकार बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं । (ख) tamoxifen उपचार के साथ सी-फोस के विलोपन के बाद एक छोटे बैंड का पीसीआर विश्लेषण । एम = 1 केबी + डीएनए सीढ़ी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : transduction और प्रत्यारोपण मॉडल की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : FACS एक प्रत्यारोपित और एक WT माउस (नकारात्मक नियंत्रण) के रक्त से YFP+ कोशिकाओं की आवृत्ति दिखा. शीर्ष पैनलों कोशिकाओं और गेटिंग के एक तितर बितर भूखंड दिखाते हैं । कम पैनलों YFP बनाम साइड बिखराव के हिस्टोग्राम दिखाओ । > 103 की एक MFI के साथ कोशिकाओं YFP + माना जाता था । इसी तरह गेटिंग प्रतिशत transduction की गणना के लिए transduction के बाद अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : CFU चढ़ाना से प्रतिनिधि प्लेटें । प्लेटों iodonitrotetrazolium क्लोराइड के साथ दाग कालोनियों दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6 : सी-फोस और Dusp1 की कमी का समझौता ल्यूकेमिया विकास । (A-C) के साथ प्रत्यारोपण चूहों के अस्तित्व घटता सी किट+ BCR-ABL1 कोशिकाओं से WT, Dusp1-/-सी-फोस-/-, और सी-फोस- /-Dusp1- /-चूहों । (डीई) YFP + कोशिकाओं का प्रतिशत के रूप में प्रत्यारोपित चूहों के परिधीय रक्त में FACS द्वारा निर्धारित हर सप्ताह posttransplant. YFP वृद्धि के स्तर और चूहों WT और Dusp1 KO में के रूप में मौत का शिकार । चूहों कि उत्तरोत्तर बच YFP+ कोशिकाओं के रूप में सी-फोस और डबल KO जब imatinib के साथ इलाज में दिखाया खो । यह आंकड़ा केसरवानी एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। 13. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 7 : LSCs के अस्तित्व के लिए सी-फोस और Dusp1 की आवश्यकता होती है । (क) स्टेम कोशिकाओं में BCR-ABL1 व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों में प्रयुक्त transgene की योजनाबद्ध. (ख) डीएफसी और बीसीआई in vivo द्वारा Dusp1 और c-फोस अवरोध के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रायोगिक डिजाइन । (ग) FACS प्रत्यारोपण के लिए LSK कोशिकाओं छंटाई के लिए इस्तेमाल स्विंग गेटिंग रणनीति के भूखंडों । (घ) BCR-ABL1 का प्रतिशत (दाता चूहों से सीडी 45.2 के प्रतिशत द्वारा निर्धारित) चूहों में सकारात्मक कोशिकाओं के दौरान और अवरोधकों के साथ posttreatment. (ङ) जीवित कोशिकाओं में CD45 chimerism को दर्शाते हुए FACS कैटरिंग भूखंडों के साथ-साथ LSK कोशिका के डिब्बे में भी. कृपया ध्यान दें कुल में सीडी 45.2 की कमी और इलाज चूहों में LSK डिब्बे में । यह आंकड़ा केसरवानी एट अल.13से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 8: vivo डीएफसी और बीसीआई की गतिविधि में । (क) रेखा ग्राफ phospho के स्तर को दिखा रहा है बीसीआई उपचार के बाद p38 । (ख) आरटी-qPCR डीएफसी उपचार के बाद चूहों के परिधीय रक्त में सी-फोस लक्ष्य जीनों की अभिव्यक्ति दिखा रहा है. डॉट्स प्रत्येक माउस (n = 3) से तीन प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । ग्राफ़ के ऊपर की संख्या छात्र के t-परीक्षण द्वारा परिकलित p-मान का प्रतिनिधित्व करती है. यह आंकड़ा केसरवानी एट अल.13से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 9 : सी-फोस की भूमिका और एक मानव रोगी नमूना में DUSP1 निषेध. (एक) दो CML रोगियों से एलटीसी-आईसी परख द्वारा निर्धारित CFUs का प्रतिशत, और एक स्वस्थ वाहन या संकेत दवा संयोजन के साथ इलाज दाता । (ख) सप्ताह 2 में NSGS चूहों की अस्थि मज्जा में मानव ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं (hCD45) का प्रतिशत (बाएं) और 4 सप्ताह (दाएं) उपचार के । (ग) यह पैनल प्रतिनिधि FACS भूखंडों से पता चलता है दवा का इलाज चूहों में hCD45 कोशिकाओं की एक नाटकीय कमी दिखा रहा है जबकि mCD45 के रूप में दिखाया माउस कोशिकाओं बख्शते । यह आंकड़ा केसरवानी एट अल.13से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
कैंसर कोशिकाओं के थोक के लिए, TKI के लिए चिकित्सीय प्रतिक्रिया tyrosine-कळेनासे-oncoprotein संकेत है जो ट्यूमर आदी है की नाकाबंदी द्वारा मध्यस्थता है । हालांकि, अपेक्षाकृत कम कैसे कैंसर MRD योगदान oncogene निर्भरता और4चिकित्सा भागने की कोशिकाओं के एक अल्पसंख्यक के बारे में जाना जाता है । हाल के अध्ययनों से पता चला कि विकास कारक दोनों ल्यूकेमिया और ठोस अंग ट्यूमर में मध्यस्थता दवा प्रतिरोध संकेतन. यह पता चलता है कि विभिंन आणविक तंत्र आंतरिक प्रतिरोध आबाद सकता है10,11,12। तंत्र को समझने के लिए और चिकित्सीय विकास के लिए जीन लक्ष्यों की पहचान, हम व्यापक पूरे जीनोम अभिव्यक्ति माउस का उपयोग प्रोफाइल (BaF3) और मानव (K562) कोशिकाओं का प्रदर्शन किया । ल्यूकेमिया से प्रभावित चूहों या CML रोगियों से प्राथमिक नमूनों का इस्तेमाल नहीं किया गया क्योंकि हमें शक है कि, के रूप में प्राथमिक अस्थि मज्जा के नमूने काफी विषम हैं, वे मुखौटा प्रासंगिक जीन की पहचान/ यहां तक कि एंटीबॉडी द्वारा शुद्ध कोशिकाओं-मध्यस्थता छँटाई (स्टेम जनक कोशिकाओं) महत्वपूर्ण विविधता का प्रदर्शन. इसलिए, एक शुद्ध सेल लाइन शायद बेहतर लक्ष्य पहचान के लिए उपयुक्त किसी भी अवांछित आनुवंशिक विविधता द्वारा लगाए जटिलता से बचने के लिए है । पूरे जीनोम अभिव्यक्ति विश्लेषण की पहचान की है कि सी-फोस, Dusp1, और Zfp36 सामांयतः दवा प्रतिरोधी कोशिकाओं में विनियमित रहे हैं । एक बार जब लक्ष्य की पहचान कर रहे हैं, उनकी मांयता को दिया आनुवंशिक संदर्भ में अपनी भूमिका पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण हिस्सा बन जाता है । BaF3 कोशिकाओं में सीडीएनए और आनुवंशिक पछाड़ना अध्ययन का उपयोग कर पता चला कि सी के निषेध-फोस और Dusp1 के लिए पर्याप्त है और प्रभावी TKI संवेदनशीलता के लिए आवश्यक है । शायद लक्ष्य सत्यापन में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक को पहचान जीन की प्रासंगिकता को मांय है/दोनों माउस और मानव से प्राथमिक नमूनों में लक्ष्य । इस प्रोटोकॉल में, हम कई आनुवंशिक मॉडलों के कदम के उपयोग से कदम प्रदान करने और दवा के आगे शोधन के लिए बेहतर यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान/
CFUs या LTCIC परख का उपयोग सेलुलर स्तर पर एक त्वरित स्क्रीनिंग शोधकर्ताओं के लिए कई दवा संयोजनों का परीक्षण करने में मदद करता है, साथ ही सांद्रता, जल्दी और अधिक समय लेने वाली प्रत्यारोपण तरीकों के लिए जाने से पहले. यह देखते हुए कि CML एक स्टेम कोशिका रोग है, और retroviruses के आदिम और quiescent टेम कोशिकाओं को लक्षित करने की अक्षमता को देखते हुए, यह मॉडल है कि सीधे LSC अस्तित्व में अपनी भूमिका को संबोधित करने का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है । यह पता करने के लिए, हम एक टेट्रासाइक्लिन-inducible BCR-ABL ट्रांसजेनिक माउस जहां tTA एक Scl बढ़ाने के द्वारा व्यक्त की है का उपयोग किया । बहरहाल, आनुवंशिक मॉडल मानव रोग recapitulating में कमी कर रहे हैं । इसलिए, यह मानवीय माउस मॉडल में प्राथमिक रोगी के नमूनों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, समय के साथ MRD का पता लगाने के लिए एक दीर्घकालिक अध्ययन करने में सक्षम होना करने के लिए, एक स्थिर xenograft की आवश्यकता है, जो चूहों और कोशिकाओं के प्रकार पर निर्भर करता है, भिन्न हो सकते हैं. प्रत्यारोपण के चार महीने के बाद, मानव CD34 + कोशिकाओं को भी दवा उपचार के बिना समाप्त हो गया, जो सबसे मानवीय माउस मॉडलों में एक सीमा है । बेहतर मानवतावादी माउस मॉडल चूहों में मानव कोशिकाओं के परीक्षण के लिए विकसित किया जा रहा है26. हम दृढ़ता से किसी भी ऑफ-टारगेट प्रभाव के रूप में अवरोधकों के लक्ष्य गतिविधि निर्धारित करने की सिफारिश सामान्य कोशिकाओं को विषाक्तता का कारण हो सकता है, इसके आगे आवेदन सीमित. हालांकि, यदि अनुप्रवाह लक्ष्य ज्ञात नहीं है, विभिंन दृष्टिकोण का उपयोग किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, दवा प्रतिरोधी म्यूटेंट लक्ष्य प्रोटीन की यादृच्छिक mutagenesis का उपयोग कर सीधे पता कर सकते है कि क्या अवरोधक27लक्ष्य पर है की पहचान ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को लक्ष्य पहचान और कई विट्रो में और vivo मॉडल सिस्टम में उपयोग कर सत्यापन के लिए एक व्यापक विधि प्रदान करता है । इन तरीकों को आसानी से अंय लक्ष्यों और कैंसर के प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा पहचाने गए लक्ष्य और दवा लक्ष्यीकरण में शोधन पर यंत्रवत अध्ययन प्रभावी और/या उपचारात्मक उपचार के लिए बेहतर चिकित्सीय मोडलों के विकास में मदद कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक जी. क्यू. Daley को BaF3 और WEHI कोशिकाओं और रेया के लिए MSCV-BCR-ABL-आयरेस-YFP construction प्रदान करने के लिए आभारी हैं. लेखकों CML विस्फोट संकट से रोगी के नमूने प्रदान करने के लिए एम कैरोल के आभारी हैं । यह अध्ययन NCI (1RO1CA155091), ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन और वी फाउंडेशन, और NHLBI (R21HL114074-01) से एमए करने के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biological Materials | |||
RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
FBS | Atlanta biological | S11150 | |
Trypsin EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in water |
Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
HEPES | Sigma | H7006 | |
Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in water |
Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
WST-1 | Roche | 11644807001 | |
0.45 μM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
70 μm nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
PBS | Corning | 21040CV | |
LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
CD117 APC | BD | 553356 | |
BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
Mouse IgG control | BD | 554121 | |
Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
EDTA | Ambion | AM9261 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
human SCF | Prospec | CYT-255 | |
Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
SOC | New England Biolabs | B90920s | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
Kits | |||
Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
Instruments | |||
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
Hemavet (boold counter) | Drew-Scientific | ||
LSR II (FACS analyzer) | BD | ||
Fortessa I (FACS analyzer) | BD | ||
FACSAriaII (FACS Sorter) | BD | ||
Magnet Stand | Miltenyi | ||
Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
Mice | |||
ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
Cells | |||
BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
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