Summary
Här beskriver vi protokoll för genetiska och kemiska validering av c-Fos och Dusp1 som drog mål i leukemi med hjälp av in vitro- och in vivo genetiska och humaniserad musmodeller. Denna metod kan tillämpas på alla mål för genetiska validering och terapeutisk utveckling.
Abstract
Demonstration av tyrosinkinashämmare (TKI) vid behandling av kronisk myeloisk leukemi (KML) har inneburit en ny era i cancer therapeutics. Dock reagerar en liten population av celler inte på TKI-behandling, vilket resulterar i minimal residual sjukdom (MRD); även de mest potenta TKI misslyckas att utrota dessa celler. Dessa MRD celler fungera som en reservoar att utveckla resistens mot behandlingen. Varför TKI behandling är ineffektivt mot MRD celler är inte känt. Tillväxtfaktor signalering är inblandad i att stödja överlevnad av MRD celler under behandling med TKI, men en mekanistisk förståelse saknas. Nyligen genomförda studier visat att ett förhöjt c-Fos och Dusp1 uttryck till följd av konvergerande onkogena och tillväxtfaktor signalering i MRD celler medla TKI motstånd. Genetiska och kemiska hämning av c-Fos och Dusp1 återger CML utsökt känslig för TKI och botar CML i både genetiska och humaniserad musmodeller. Vi har identifierat dessa målgener med flera microarrays från TKI-känslig och -resistenta celler. Här, tillhandahåller vi metoder för målet validering med hjälp av in vitro- och in vivo musmodeller. Dessa metoder kan enkelt tillämpas på alla mål för genetiska validering och terapeutisk utveckling.
Introduction
Konstituerande tyrosin Kinas aktivitet av BCR-ABL1 fusion onkogen orsakar KML, vilket ger en logik för att rikta kinase aktiviteten av liten molekyl-hämmare. TKI framgång vid behandling av patienter med KML revolutionerat begreppet riktad terapi1,2. Därefter utvecklades mot Kinas behandling som precision medicin för flera andra maligniteter, inklusive solida tumörer. Hittills har mer än trettio kinashämmare godkänts av United State FDA för behandling av olika maligniteter. TKI-behandling är mycket effektiv i undertrycka sjukdomen, är det inte botande. Dessutom en liten population av cancerceller kvarstår under behandlingen: den MRD3,4,5. Även patienter som visade fullständig remission är kvar med MRD, som så småningom resultat i återfall om inte kontinuerligt undertrycks. Utrotning av MRD celler behövs därför att uppnå ett hållbart eller botande svar. CML representerar en värdefull paradigm för att definiera begreppet precision medicin, mekanismer för Onkogenes, rationella mål-regisserad therapeutics, sjukdomsprogression och läkemedelsresistens. Dock även i dag, den mekanism som driver TKI-inducerad celldöd i cancerceller är inte helt klarlagt, inte heller varför MRD celler (bestående av leukemiska stamceller [LSCs]) är naturligt resistenta mot TKI4,6. Ändå är fenomenet ”onkogen beroende” till mutant kinase onkoprotein inblandad i TKI effekt där akut hämning av riktade onkogen av TKI orsakar en onkogen chock som leder till en massiv proapoptotiska svar eller rofylld i cell innehållsberoende sätt6,7,8,9. Dock saknas den mekanistiska basen av onkogen beroende. Nyligen genomförda studier har inblandade att tillväxtfaktor signalering upphäver onkogen beroende och följaktligen ger resistens mot TKI terapi10,11,12. Därför, för att få inblick i mekanismen av onkogen beroende har vi utfört helgenom-uttryck profilering från BCR-ABL1 beroende och nonaddicted celler (vuxit med tillväxtfaktorer), som visade att c-Fos och Dusp1 är viktiga mediatorer av onkogen missbruk13. Genetiska strykningen av c-Fos och Dusp1 är syntetiska dödliga för BCR-ABL1-uttryckande celler och de möss som används i experimentet utvecklade inte leukemi. Dessutom botade hämning av c-Fos och DUSP1 av liten molekyl-hämmare BCR-ABL1-inducerad CML i möss. Resultaten visar att nivåerna av c-Fos och Dusp1 definiera apoptotiska tröskeln i cancerceller, så att lägre nivåer ger drogen känslighet medan högre nivåer orsakar resistens mot behandling13.
För att identifiera de gener som kör onkogen beroendet, utfört vi flera helgenom-uttryck profilering experiment i närvaro av tillväxtfaktor och en TKI (imatinib) med både mus- och CML patientderiverade celler (K562). Dessa uppgifter analyseras parallellt med KML patienten datauppsättningar som erhållits från CD34+ hematopoetiska stamceller före och efter behandling med imatinib. Denna analys visade tre gener (en transkriptionsfaktor [c-Fos], dubbla specificitet fosfatas 1 [Dusp1], och en RNA-bindande protein [Zfp36]) som är vanligen uppreglerad i TKI-resistenta celler. För att validera betydelsen av dessa gener i ge läkemedelsresistens, genomförde vi steg för steg in vitro- och in-vivo analys. Uttrycksnivåerna av dessa gener bekräftades av realtids qPCR (RT-qPCR) och western blotting i resistenta celler. Ytterligare, cDNA överuttryck och Nedslagning av shRNA hårnålar av c-Fos, Dusp1, och Zfp36 visade att förhöjt c-Fos och Dusp1 uttryck är tillräckligt och nödvändigt att TKI motstånd. Därför gjorde vi en invivo validering med musmodeller med c-Fos och Dusp1 bara. För genetiska validering av c-Fos och Dusp1, vi skapade ROSACreERT-inducerbara c-Fosfl/fl möss (villkorlig knockout)14 och korsade dem med Dusp1- / - (raka knockout)15 att göra ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - dubbel-transgena möss. Benmärg-derived c-Kit+ celler (från c-Fosfl/fl-, Dusp1- / --, och c-Fosfl/flDusp1- / -) uttrycker BCR-ABL1 var analyserade i vitro i kolonibildande enhet (CFU) analys och i vivo av benmärgstransplantation i dödligt bestrålade möss, testa kravet på c-Fos och Dusp1 ensamma eller tillsammans i leukemi utveckling. Likaså de kemiska hämningar av c-Fos av DFC (difluorinated curcumin)16 och Dusp1 av BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 testades in vitro och in vivo med BCR-ABL1-uttrycker, ben benmärg-derived c-Kit+ celler från vildtyp (WT) musen. För att bekräfta behovet av c-Fos och Dusp1 i leukemic stamceller, utnyttjade vi en CML musmodell där BCR-ABL1 var specifikt induceras i dess stamceller av doxycyklin (Tet-transactivator uttrycker under murina stem cell leukemi (SCL) gen 3' förstärkare förordning)18,19. Vi använde benmärgen Lin–Sca+c-Kit+ (LSK) celler från dessa möss i ett invivo transplantation test. Dessutom vi etablerat phopsho-p38 nivåer och uttrycket av IL-6 som farmakodynamiska biomarkörer för Dusp1 och c-Fos hämning, respektive i vivo. Slutligen, för att utöka studien för människors relevans, patientderiverade CD34+ celler (motsvarande i c-Kit+ celler från möss) var utsätts för långsiktiga in vitro-kultur-inleda cell analyser (LTCIC) och en i vivo humaniserad musmodell av CML20,21. Nedsatt immunförsvar mössen transplanterades med KML CD34 + celler, följt av läkemedelsbehandling och analys av mänsklig leukemic cellöverlevnad.
I detta projekt utvecklar vi metoder för target identifiering och validering med hjälp av både genetiska och kemiska verktyg använder olika prekliniska modeller. Dessa metoder kan användas framgångsrikt för att validera andra mål som utveckling av kemiska för terapeutisk utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök genomfördes enligt riktlinjerna i den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) på Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Mänskliga prover (Normal BM och som från KML (p210-BCR-ABL +) leukemi) erhölls genom institutionella Review Board-godkända protokoll (institutionella Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children's Hospital Medical Center) och givare-informerat samtycke från CCHMC och vid University of Cincinnati.
1. realtids qPCR analys
- Isolera total-RNA från BaF3 celler växer i RPMI kompletteras med 10% FBS och 10% WEHI tillbringade odlingsmedium som en källa till interleukin-3 (IL-3).
- Skörda cellerna på logaritmiska fas (99% lever) från behandlade (IL-3 och imatinib) samt från obehandlade prover och centrifugera dem 435 x g i 3 min. Hälsa och skall tillväxtstadierna för cellerna är kritisk, eftersom deras gen uttryck profiler kan förändras dramatiskt.
- Isolera RNA genom att rena totala RNA22. Kvantifiera den total-RNA; sedan underkasta den DNAS behandling23. Konvertera lika mängder DNA-fria RNA (2 µg) till cDNA med omvänt transkriptas24.
- Utföra qPCRs med gen-specifika primers (tabell 1). Utföra primärvården i 20 µL reaktioner i 0,2 mL, tunnväggiga PCR-rör med optisk mössor, med en 1 x polymeras blanda (se Tabell för material), 0,5 µM varje grundfärg, 1 µL av DNA, och vatten. Placera reaktionen i termocyklern med följande cykel: steg 1, 95 ° C i ca 10 min; Steg 2, 95 ° C under 15 s; Steg 3 vid 60 ° C i 1 min. Steg 4, upprepa steg 2 – 3 40 gånger. Utföra alla primärvården i exemplar och normalisera realtidsdata till β-aktin uttrycket innan plottning.
2. Western Blotting
Obs: Hela-cell extrakt var förberedda genom att lägga till 250 µL av 1 x lyseringsbuffert som beskrivs i Kesarwani et al.13 kompletteras med proteashämmare cocktail och fosfatas hämmare cocktail 2.
- Skörden fem miljoner BaF3 celler på logaritmiska fas (99% lever) från behandlade (IL-3 och imatinib) as well as från obehandlade BaF3 celler genom centrifugering vid 435 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Lysera celler i lyseringsbuffert (250 µL) av pipettering upp och ner 1 x, följt av en 5 minuters inkubation vid 80 ° C. Sonikera den lysate att bryta ner alla DNA med 5 – 6 pulser av 5 s varje i ett kallt rum vid 4 ° C.
- Överföra den lysate till ett 1,5 mL rör och centrifugera det 16 000 x g för 5 min att ta bort olösligt material. Extraktet kan lagras vid-80 ° C fram till användning. Värme prover till 80 ° C i 5 min i en värme block före lastning. Ladda 10 µL av provet med en gel-lastning spets på 10% SDS-PAGE gel.
- Lösa proteinerna på 150 V tills referens färgämnet når botten av gelen. Överföra proteinet till nitrocellulosa membran genom en elektrofores överföring på 1 ampere för 1 h. Efter överföringen, blockera membranen i 1 x Tris-buffrad koksaltlösning + 0,1% Tween 20 (TBST) med 5% fettfri mjölk för 1 h och sond övernattning på 4 ° C med lämpliga antikropparna vid en 1:1,000 spädning.
- Tvätta membranen 3 x till 5 x med TBST i 10 min varje; sedan, sond med en HRP-konjugerad lämpliga sekundär antikropp (1:5, 000 utspädning) vid rumstemperatur för 1 h. Mängden TBST som används beror på storleken på behållaren. Se till att dränka membranet i TBST helt. Tvätta den sekundära antikroppen 3 x 5 min varje med TBST.
- Utveckla blot med Kemiluminiscens substrat reagens. Blanda lika stora volymer av substrat och bufferten från två flaskor, precis före användning. Lägg till substratet till toppen av membranet att täcka hela membranet med en 1 mL pipett och inkubera i 1 min. Blopparna bör avbildas inom 1 – 10 min att lägga till substratet.
- Med trubbig pincett, noggrant placera membranet på plattformen av bildgivande systemet (se Tabell för material), undvika mycket av vätskan. Välj en live-vyn och välj blotting och chemiluminiscence från menyn. Använda manuell förvärv, förvärva flera exponeringar vid olika tidpunkter. Dessa filer kan visualiseras och kvantifieras med hjälp av avbildningsprogrammet.
3. generation av knockoutmöss
- Korsa c-Fosfl/fl möss med ROSACreERT2 möss att generera ROSACreERT2c-Fosfl/fl möss13. För att skapa de dubbel-knockoutmöss som (KO), rasen ROSACreERT2c-Fosfl/fl möss med Dusp1- / - möss att generera ROSACreERT2c-Fosfl/fl Dusp1- / - möss13. Genotyp möss av svans clips följt av PCR, som beskrivs nedan.
-
Genotypning:
- Att förbereda DNA, klipp en liten del av svansen med sax och Lägg den i en 1,5 mL tub. Bränna svansen med uppvärmd sax. Tillsätt 200 µL av 50 mM NaOH till klippt svans i röret och inkubera vid 95 ° C i en värme block för 1 h.
- Vortex röret väl och, sedan, neutralisera genom att lägga till 50 µL 1 M Tris HCl pH 6,8 och vortex igen. Centrifugera röret med maximal hastighet för 1 min.
- Genomföra primärvården i 20 µL reaktioner i 0,2 mL, tunnväggiga PCR-rör med 1 x Taq polymeras master mix som innehåller färgämne, 0,5 µM varje grundfärg, 1 µL av DNA, och vatten. Placera rören i termocyklern och köra de lämpliga cyklerna som visas i tabell 2.
- Köra PCR-produkten på 2% agarosgel och bild med en geldokumentationssystem.
4. isolering av c-Kit+ celler från benmärg
- Offra möss enligt institutionella riktlinjer.
Obs: Här, möss utsattes för koldioxid (CO2) på enligt till den AVMA rekommenderat flöde tills döden bestämdes av upphörande av andning och hjärtverksamhet, följt av cervikal dislokation. - Skörda den benben från musen — två lårbenet, två förbenade, två iliacs. Rensa bort alla vävnader från benen genom att skrapa bort med en skalpell. Sätta de ben ben i kallt 1 x PBS på isen — 5 mL i en 15 mL tub. Häll innehållet i röret i en mortel och krossa den med en mortelstöt.
- Filtrera cellsuspensionen genom en sil med 70 µm i cellen till en 50 mL skruvlock tub med 10 mL pipett fäst, med pipett. Tvätta mortel flera gånger med kallt 1 x PBS, samla och lägga till cellsuspension till 50 mL-röret. Snurra ner benmärgen på 1,200 x g vid 4 ° C i 5 min. ta bort den supernatant via ett vakuum med glas pipett bifogas. Centrifugerade cell i 5 mL 1 x PBS med en pipett.
- Med en pipett, Tillsätt långsamt svävande benmärg till toppen av 5 mL av rumstemperatur (temperaturen är kritiska) polysucrose, tar stor omsorg att inte störa gränssnittet. Snurra på 400 x g i rumstemperatur i 20 min med broms avstängd.
- Samla in gränssnittet grumlig mono-nukleära summacell (TMNC) med en pipett och sätta det i en ny 15 mL tub. Ta med volym upp till 10 mL med 1 x PBS för tvätten, tar 20 µL för inventering, och snurra på 1,200 x g vid 4 ° C i 5 min. Kassera supernatanten och spara pelleten på is för steg 4.6.1.
-
Utföra c-Kit+ cell isolering.
- Följ ett microbead kit protokoll för c-Kit+ cell isolering. Återsuspendera cellpelleten i 80 µL av 1 x PBS + EDTA + BSA 107 celler. Att cellsuspensionen, tillsätt 20 µL av CD117 mikrokulor/107 totala celler. Blanda väl genom vortexa och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C. Ta med volymen upp till 10 mL genom att lägga till 1 x PBS + EDTA + BSA och snurra på 1,200 x g vid 4 ° C i 5 min.
- Ta bort supernatanten via ett vakuum och centrifugerade cell i 500 µL/108 totalt celler i 1 x PBS + EDTA + BSA. Med magnet stativet med kolumnen magnetiska fäst, tillsätt 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA och låt det rinna genom via gravitation i en 15 mL samling röret.
- När det första buffer-tillägget har slutförts passerar genom kolonnen, lägga till kolumnen, så att den kan flöda genom via gravitation i 15 mL samling röret cellsuspension. Detta att är andelen oönskade cell.
- Tvätta kolonnen 3 gånger med 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA varje gång, gör det möjligt att strömma genom via gravitation i samling röret. Ta bort kolumnen från magneten och fäst på toppen av en 15 mL tub.
- Tillsätt 5 mL av 1 x PBS + EDTA + BSA och omedelbart spola med kolven med kolumnen. Ta bort kolven och upprepa jäms med ytterligare 5 mL 1 x PBS + EDTA + BSA. Räkna cellerna i den totala volymen med standardmetoder.
- Snurra ner cellerna på 1,200 x g vid 4 ° C i 5 min. ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i komplett IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) för kultur. Kultur dessa celler med övernattning i 2 x 106 celler/1 mL cell IMDM komplett media genom att placera dem i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
5. transduktion
-
Retrovirala plasmid transfection
- Nymalen Tina HEK293 celler på eftermiddagen innan i vattenbad inställt på 37 ° C. Snurra den cryotube som innehåller HEK celler på 435 x g i rumstemperatur i 3 min. ta bort den supernatant via ett vakuum och centrifugerade cell i 1 mL DMEM kompletteras med 10% FBS, penicillin, streptomycin och glutamin.
- Räkna cellerna och Lägg till lämplig volym till en 10 cm behandlade maträtt (~ 4 x 106 HEK293T celler). Lägga 14 mL DMEM 10 media i skålen och blanda väl genom att skjuta upp och ner för en jämn fördelning. Placera skålen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator över natten.
- På nästa morgon, kontrollera sammanflödet av cellerna under ett inverterat ljusmikroskop (50% eller mer fungerar bra).
- Kombinera den DNA (önskad retrovirala plasmid), PclEco (förpackning plasmid), 2 M CaCl2och H20 i en 1,5 mL tub (= 500 µL) med hjälp av en mikropipett i följande belopp: 7,5 µg av DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 µg av pCLeco, 62 µL av 2 M CaCl2 , och vatten till en slutlig volym av 500 µL. Tillsätt 500 µL 2 x HBS till en annan 1,5 mL tub.
- Lägg till DNA blanda droppvis till 1,5 mL röret som innehåller 500 µL av 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES och 1,5 mM Na2HPO4) under omrörning. Uppnå detta genom att ställa en virvel på den lägsta hastigheten och håll HBS röret på det för konstant blandning samtidigt lägga transfection mixen.
- Tillåta transfection mixen till Inkubera i 20 – 30 min i rumstemperatur. Under inkubationstiden, lägga till 25 nM klorokin i HEK cellerna och placera dem tillbaka i inkubatorn. Efter inkubering, lägga till transfection mixen droppvis i HEK cellerna och sedan snurra försiktigt media att blanda transfection mixen i hela plattan.
- Inkubera cellerna med mixen för ~ 8 h i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Ändra media på dessa celler genom mycket långsamt lägga 14 mL färsk DMEM 10 media. Pipettering långsamt mot väggen av skålen hjälper till att förebygga eventuella strippar HEK celler. Inkubera cellerna övernattning i de 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Samla viral supernatanten med en 10 mL spruta, dra supernatanten i sprutan och bifoga 0,45 µm spruta filtret. Störta viral supernatanten i en ny samling tub. Ta den första samlingen av viral supernatant ~ 16 h senare.
-
Fibronektin viral koncentration och transduktion
- Tillsätt 2 mL av en 0,1 mg rekombinant humant Fibronektin fragmentet i 1 x PBS till obehandlade 6-väl kultur plattor. Förbered så mycket Fibronektin som behövs, vilket beror på antalet celler och genotyper. Man kan väl tillräckligt transduce 10 miljoner c-Kit+ celler. Inkubera plattan över natten vid 4 ° C.
- Nästa dag, ta bort Fibronektin från brunnarna med en pipett, pipett 2 mL steril 2% BSA i 1 x PBS att blockera plattan och inkubera i 30 min i rumstemperatur. Ta bort BSA via ett vakuum och tvätta ordentligt genom att spruta 2 mL 1 x PBS och sedan ta bort den via ett vakuum.
- Tillsätt omedelbart nymalen samlas in och filtreras (vid 0,45 µm) viral supernatant upp till 5 mL. Centrifugera vid 435 x g vid 32 ° C för 2 h. bort den supernatant via ett vakuum och upprepa detta steg med ytterligare nyligen uppsamlat viral supernatanten och snurra igen. Ta bort den supernatant via ett vakuum och Tvätta brunnarna genom att tillsätta 2 mL 1 x PBS; ta sedan bort det via ett vakuum.
- Lägg till c-Kit+ musen celler att var odlade övernattning (steg 4.6.6) till viral belagda brunnarna av blandningskopp cellsuspensioner och pipett dem till nu viral koncentrerad Fibronektin plattan. Snurra på 1,200 x g vid 25 ° C för 90 min. sätta cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- 48 h posttransduction, pellet cellerna genom centrifugering vid 1,200 x g vid 4 ° C i 5 min och återsuspendera dem i FACS buffert #1 (1 x PBS + 0,5% BSA) till 6 x 106/ml. Bestämma procentandelen av BCR-ABL1 positiva celler genom att mäta andelen YFP positiva med flödescytometri.
- Förvärva händelser med standardförfarandet. Först, gate levande celler baserat på framåt och side scatter. Sedan, gate YFP positiva levande celler exklusive den YFP-negativecells bestäms av negativ kontroll (figur 4).
6. kolonibildande UnitAssays
- Tina metylcellulosa med cytokiner för mus i rumstemperatur i 1 – 2 h. alikvotens 3 mL metylcellulosa på FACS tub med en 5 mL spruta utan nål. Sortera en cell sorterare YFP-positiva celler.
- Snurra cellerna ner och centrifugerade i IMDM komplett media. Räkna cellerna för att vara klädd och späda ut dem för att få 5.000 YFP-positiva celler i 100 µL av IMDM komplett media.
- Tillsätt 100 µL cellsuspension som innehåller 5000 YFP-positiva celler och de lämpliga hämmare till 3 mL metylcellulosa (se Tabell för material). Vortex på hög att blanda det för 10 – 30 s.
- Efter de flesta av luften bubblor har rymt, Använd en 1 mL spruta till tallrik 1 mL av media i tre replikera 3 cm plattor av mata ut media på ena sidan och långsamt luta plattan i en cirkelrörelse till jämnt.
- De hämmare att använda slutliga koncentration är imatinib vid 3 µM, DFC på 0,2 µM och BCI på 0,5 µM, ensam eller i kombinationer. Där det är lämpligt, ta bort c-Fos genom plätering cellerna med 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) tillsätts metylcellulosa.
- Efter plätering, sätta plattorna i en stor petriskål med en öppen maträtt innehållande 2 mL sterilt vatten i mitten. Täcka stora petriskål och noggrant Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Posten kolonin numrerar efter en vecka av plätering av räknar det totala antalet kolonier under ett mikroskop.
- Analysera några kolonier från lämpliga plåtar för c-Fos borttagning av PCR. Samla in kolonierna genom att suga dem med P1000 spets. Få bort cellerna i 500 µL 1 x PBS genom att tvätta spetsen i PBS flera gånger. Spinn cellsuspensioner vid 6000 x g i 1 min och extrahera DNA från cellpelleten och använda ett genomisk DNA isolering kit.
- Använd den genomiskt DNA för PCR primers mFos-FP3 och mFos-RP5, som beskrivs i tabell 2. Analysera PCR-produkter på en 2% agarosgel och bild med en geldokumentationssystem.
- För en grafisk presentation av kolonierna, fläcken kolonierna, använder Iodonitrotetrazolium klorid. Lös 10 mg av den Iodonitrotetrazolium klorid i 10 mL vatten för att få en 1 mg/mL lösning. Filter sterilisera om lösningen med en luerlock med ett 0,2 µm filter bifogas en 10 mL spruta under sterila förhållanden i vävnadsodling huva.
- I vävnadsodling huven, tillsätt 100 µL av färglösningen droppvis runt CFU plåten; var noga med att inte glida eller störa kolonier. Inkubera plattorna övernattning i en 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator. Kolonierna blir mörk rödaktig brun. Med en vit bakgrund i sterila vävnadsodling huven, ta bilder av färgade CFU plattan.
7. transplantation och dödlighet Assay
- Dödligt bestråla möss med split strålning med en 137 Cs-baserade Gamma-ray vid en dos av 7,0 Gy följt av 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h apart innan transplantation.
- Transplantera 4 x 104 osorterade YFP-positiv (beräknat på andelen YFP) celler med 3 x 105 normal benmärgsceller som bärare i varje mus genom svansen ven injektion.
- Efter en vecka för transplantation, bestämma engraftment genom att analysera YFP-positiva celler från perifert blod med FACS.
-
Utföra en svans ven blöda och FACS analys.
- Varma buren av möss under en värmelampa med försiktighet att inte överhettas eller bränna dem.
- Hindra en mus i en mus fasthållning och nick svans venen med sterila blad. Försiktigt mjölk svansen från främre till bakre, så att en droppe blod ansamlas. Samla in blod med en hepariniserad kapillärrör tills den är fylld (samla runt 75-100 µL). Störta blodet från det fyllda kapillärröret i ett bloduppsamlingsrör som innehåller EDTA och blanda väl.
- Lysera de röda blodkropparna genom att lägga till 30 – 40 µL blod 3 mL 1 x lyseringsbuffert RBC (150 mM ammoniumklorid, 10 mM kaliumbikarbonat och 0,13 mM EDTA). Blanda väl, Invertera röret flera gånger. Odla i rumstemperatur i 10 – 15 min. Spin vid 1200 x g vid 4 ° C för 5 min. ta bort de supernatant via ett vakuum och centrifugerade i 2 mL 1 x PBS för en tvätt.
- Snurra på 1,200 x g vid 4 ° C i 5 min. ta bort supernatanten och avbryta det i FACS buffert #1. Utföra FACS analys som beskrivs ovan i steg 5.2.5–5.2.66. Kortsiktiga store återstående blodet i samling röret, som kan användas för olika andra ändamål, vid 4 ° C.
- Transplanterade möss som visade 10 – 40% YFP-positiva celler i perifert blod användes för experimentet. Möss som hade mindre än 2% av YFP-positiva celler uteslöts från studien.
- Förbereda tamoxifen 20 mg/ml i majsolja vid 60 ° C med intermittent omskakas tills helt upplöst, och lagra den på 4 ° C i mörker under hela behandlingen. Efter en vecka av transplantation, stryka den c-Fosfl/fl allelen genom att injicera tamoxifen (100 mg/kg i majsolja) intraperitonealt (i.p.) till mössen, varje dag i tre följande dagar. Det är viktigt att mössen vägs för att avgöra hur mycket tamoxifen att injicera. Efter behandlingen med tamoxifen (om tillämpligt), grupp möss för läkemedelsbehandlingar (n = 5/grupp).
- Övervaka möss för leukemi progression och överlevnad och bestämma leukemiska börda (YFP-positiva celler av FACS) per vecka upp till åtta veckor i överlevande möss.
- Analysera blod för c-Fos radering där det är lämpligt, som beskrivs ovan i avsnitt 6. Registrera antalet överlevande möss varje dag och plotta kurvan överlevnad i slutet av experimentet med en grafritande programvara.
8. transgena möss modell av BCR-ABL1 leukemi
-
LSK isolering
- Upprätthålla de Scl-tTA transgena möss på doxycyklin chow att förhindra ett uttryck av BCR-ABL1. Fyra veckor före transplantationen, ta möss utanför doxycyklin chow för BCR-ABL1 uttryck.
- Isolera TMNCs från Scl-tTA transgena möss som beskrivs ovan i avsnitt 4. Avbryta TMNCs i FACS buffert #2 (1 x PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) för att erhålla 106 celler/mL.
- Bryter ned TMNCs för härstamning-positiva celler genom att lägga till 10 µL av härstamning cell upptäckt cocktail biotin (biotin-konjugerad monoklonal antikroppar mot CD5 [råtta IgG2a], CD11b [råtta IgG2a], CD45R [B220] [råtta IgG2a], Anti-7-4 [råtta IgG2a], [Ly-6G/C, råtta Anti-Gr-1 IgG2a], och Anti-Ter-119 [råtta IgG2b]) per 1 x 106 celler. Inkubera cellerna vid 4 ° C för 10 min i mörker, följt av en tvätt med 5 mL FACS buffert #2, och snurra på 1,200 x g vid 4 ° C i 5 min. Aspirera supernatanten helt och avbryta cellerna i 400 µL av FACS buffert #2.
- Tillsätt 5 µL anti biotin antikropp-FITC konjugat, 1,2 µL av Ly-6A/E (Sca1) PECy7 och 2.4 µL av CD117 (c-Kit) APC antikroppar för upp till 108 miljoner celler. Inkubera i mörker vid rumstemperatur i 10 min. Tvätta genom att föra volymen upp till 5 mL med FACS buffert #2; sedan Centrifugera 1200 x g vid 4 ° C i 5 min. ta bort supernatanten och centrifugerade cell i 500 µL FACS buffert #2.
- Filtrera cellsuspensionen i ett blått filter-cap FACS rör.
- Gate levande celler använder framåt och side scatter. Markera de lin– celler som visade MFI (menar fluorescensintensiteten hos mindre än 102) att få LSK celler c-Kit+ och Sca1+ på en biexponentiell tomt från Lin– förälder och sortera dem (figur 7 C).
- Samla de sorterade cellerna och centrifugera dem 1.200 x g vid 4 ° C i 5 min.
-
Transplantation
- Dödligt bestråla BoyJ möss med en split strålning dosering av 7,0 Gy följt av 4,75 Gy efter 3 h, innan transplantation.
- Injicera 3 x 103 till 5 x 103 BCR-ABL1-LSK celler med 0,3 x 106 helper benmärgsceller från WT BoyJ möss via svans ven (intravenös) i de bestrålade BoyJ möss.
- Fyra veckor posttransplantation, analysera mottagarens möss för CD45.1 och CD45.2. Få TMNC från perifert blod genom svansen ven blödning som beskrivs i steg 7,4. Att resuspendera cellerna i 100 µL av FACS buffert. Inkubera cellerna med 1 µL varje CD45.1-FITC och CD45.2-PE antikroppen i rumstemperatur i 1 h.
- Tvätta cellerna genom att föra upp volymen till 3 mL med FACS buffert och snurra på 1,200 x g vid 4 ° C för 5 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera det i 200 µL 1 x PBS.
- Analysera procentsatsen på CD45.1 och CD45.2 av första gating levande celler baserat på framåt och side scatter, följt av gating FITC - och PE-positiva celler baserat på ofärgade provet.
- Gruppera möss i fyra grupper (n = 6 per grupp). Starta behandlingen med imatinib (75 mg/kg 2 x dagligen) ensamt och i kombination med DFC + BCI (båda läkemedlen gavs i en dos på 10 mg/kg 2 x dagligen).
- Jämväl, behandla andra grupper med kombinationer av imatinib (75 mg/kg) + curcumin (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) och imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) i tre månader, 2 x per dag, av injicerade i.p.
- Analysera mössen 1 x en månad i sex månader för leukemiska chimärism genom att bestämma andelen CD45.2 positiva celler i perifert blod svansen ven blödning som beskrivs i steg 7,4.
9. i Vivo utvärdering av BCI och DFC aktivitet
-
Phospho-p38 analys
- Ta tre leukemiska möss (8 – 12 veckor gamla) som transplanterades med BCR-ABL1-uttryckande c-Kit+ celler, som beskrivs i avsnitt 7. Injicera möss BCI (10 mg/kg) genom att injicera i.p. fyra veckor signifikant.
- Mäta nivåerna av phospho-p38 perifert blod TMNC med hjälp av fosforylering flöde flödescytometri kit enligt leverantörens anvisningar. Samla blod från varje mus före och 6 h efter drogen injektionen. Isolera TMNCs av RBC utarmning och åtgärda dem enligt följande.
- Tillsätt 4 mL RBC lysis lösning per 100 µL av perifert blod. Blanda och inkubera på is för 5 min att lysera röda blodkroppar. spinn ner cellerna vid 1200 x g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten. Upprepa Lys 1 x mer.
- Efter det andra lysis steget, tvätta cell pellets med 1 mL 2% BSA i PBS. Fixa cellerna genom att lägga till 100 µL av fixering och permeabilisering lösningar och inkubera i 20 minuter vid 4 ° C i mörker. Pellet cellen genom centrifugering vid 1,200 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta pellets med 1 mL 1 x permeabilisering tvätt. Blockera cellerna genom att lägga till 300 µL av 2% BSA i vilket tvättbuffert vid rumstemperatur för 20 min. dela celler i tre lika alikvoter av 100 µL varje (~ 1 x106).
- Tillsätt 1 µL av totala p-38 antikropp, 1 µL phospho-p38 antikropp eller 1 µL av isotypen IgG kontroll, respektive varje alikvot av fasta celler och inkubera över natten vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna 1 x 5 ml 2% BSA i PBS och inkubera med sekundär antikropp (1 µL av Alexa Fluor-488 konjugerat) för 1 h i rumstemperatur. Tvätta cellerna 1 x igen och avbryta dem i 200 µL 1 x PBS.
- Förvärva data efter FACS och analysera dem med mjukvara Flödesanalys flödescytometri.
- Dra av MFI i kontrollen IgG från MFI av experimentella proverna. Phospho-p38 MFI värden är sedan normaliseras som totalt p-38 att bestämma phospho-p38 nivåerna efter BCI injektionen.
-
Kvantitativ gen uttryck analys av c-Fos målgener
- Ta tre leukemiska möss (8 – 12 veckor gamla), som transplanterades med BCR-ABL1-uttryckande c-Kit+ celler som beskrivs i avsnitt 7. Samla in perifert blod från varje mus och sedan injicera möss med 10 mg/kg varje DFC + BCI.
- Samla perifert blod 6 h efter drogen injektionen. Isolera TMNCs av RBC utarmning, som beskrivs ovan. Pellets av TMNCs och upphäva dem i en fenol-baserade lyseringsbuffert (se Tabell för material).
- Gör RT-qPCR-analys (som beskrivs i avsnitt 1) för Bcl2l11, Lif och IL-6 med gen-specifika primers (visas i tabell 1).
10. långsiktigt kultur-inleda Cell Assay
Obs: Ett LTCIC test utfördes enligt den tidigare25.
- Väx en mus fibroblast cellinje MS-5 i MEMα till konfluens i en kolv med T175 i vävnadskultur. Trypsinize cellerna som beskrivs ovan för HEK293T. Avbryta cellerna i MEMα på 2 x 106 celler/mL. Ta 10 x 106 celler i en 50 mL konisk tub och bestråla på 80 Gy. Späd cellerna till 0,5 x 106 celler/mL i MEMα kompletteras med 10% FBS (M10) media. Tavla 2 mL per brunn i en 12-well platta och inkubera det i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator över natten.
- Nästa dag, förbereda den hydrokortison natrium hemisuccinate genom upplösning 2,5 mg i 5 mL av MEMα (1 M lösning). Filter-sterilisera hydrokortison lösningen med ett 0,2 µm spruta filter i biosäkerhet huva. Späd hydrokortison genom seriell utspädning i MEM att erhålla en 100 µM lösning. Tillsätt 250 µL av detta till 25 mL av människors långsiktiga odlingsmedium (HLTM) (se Tabell för material) strax före att använda, att uppnå en slutlig koncentration på 1 µM.
- Snurra ner KML-CD34+ och UCP3 TMNCs och upphäva dem i HLTM av kort vortexa och bestämma räkningarna genom en hemocytometer.
- Vakuum från M10 media från 12-väl plattan ympats med stroma cellerna och ersätta det med de 1 mL av patientens cell (KML-CD34+ [10.000] och UCP3 TMNCs [1 x 106]) suspension i HLTM. Använd tre brunnar per drog kombination per celltyp.
- Späd droger bestånden till 2 x krävs koncentration i HLTM. Tillsätt 1 mL av media med droger till ovannämnda celler att få en 1 x drog koncentration. Byt ut hälften av media med nylagade HLTM vecka i fem veckor.
- I slutet av perioden sex veckors LTC-IC assay, samla in nonadherent celler i ett rör från kulturer. Trypsinize vidhäftande celler och kombinera dem med motsvarande nonadherent celler.
- Tvätta cellerna och analys för CFUs i metylcellulosa medium som innehåller 30% fetalt kalvserum, erytropoietin (3 enheter/mL), SF (50 ng/mL), och IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), och granulocyt/makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF) (20 ng / mL). bestämma räkningarna genom en hemocytometer.
- Tallrik 5 x 104 celler i tre replikat. Frysa ner resterande celler i 20% FBS och 10% DMSO. Ordna plattorna i en stor petriskål med en öppen maträtt som innehåller vatten i mitten. Täcka stora petriskål noggrant och inkubera det i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för två veckor.
- Poäng kolonierna två veckor senare. I vissa fall är bara en del av skörden analyseras för CFUs). Beräkna det totala antalet LTCIC i första cellsuspensionen genom att extrapolera utifrån de CFUs som erhålls från cellen skörd. Den genomsnittliga CFU uteffekt LTC-IC är 8.
Obs: Till exempel om initialt 1 x 106 celler var klädd i en brunn, efter fem veckor, 0,5 x 106 celler skördats och för CFU, 5 x 104 celler var klädd och 50 CFUs erhölls. Detta motsvarar 500 CFUs/1 miljon guldpläterade celler. Dela siffran med 8 få LTCIC, vilket är 62,5.
11. humaniserad musmodell använder CML CD34+ celler
- Sublethally bestråla 8 veckor gamla nicka scid gamma möss, att uttrycka mänskliga IL3, GM-CSF och SCF (Nätverkssäkerhetsgrupper), med en engångsdos av 7,0 Gy (700 rads) med 50 rads/min.
- Injicera 3 x 106 CD34+ markerade celler från patienter med BCR-ABL1-positiv KML i kronisk fas till de bestrålade möss genom intravenös injektion.
- Efter två veckor av transplantation, bestämma leukemiska engraftment i benmärgen av FACS använda mus - och mänskliga-specifika antikroppar mot CD45.
-
Utföra en FACS analys.
- Ta benmärgsaspiratet från lårbenet av transplanterade möss. Lysera röda blodkroppar med RBC lyseringsbuffert enligt beskrivningen ovan och samla TMNCs genom centrifugering. Tvätta pelleten 1 x med kall 1 x PBS.
- Blockera cellerna med mänskliga FcR block och mus FcR block följt av färgning med anti-humant CD45 FITC och antimus CD45 APCCy7 över natten vid 4 ° C. Utföra FACS analysen på LSRII och analysera data med hjälp av mjukvara Flödesanalys flödescytometri.
- Gruppera möss i fyra olika kohorter (n = 6/grupp) för behandling med fordon, imatinib (75 mg/kg), DFC + BCI (båda på 10 mg/kg), eller imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (båda på 10 mg/kg). Späd lager narkotika i 1 x PBS (fordon) och administrera dem genom att injicera dem i.p. 2 x dagligen.
- Behandla möss i sex veckor och bestämma den leukemiska bördan varannan vecka fram till vecka åtta efter transplantation som beskrivs ovan i 11,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onkogen missbruk har varit inblandad i den terapeutiska effekten av TKI. Men är drivkrafterna bakom onkogen beroendet inte klarlagda. Vi genomförde flera opartiska gen uttryck analyser för att identifiera genetiska komponenten inblandade i iscensättandet missbruk. Dessa analyser avslöjade uppreglering av tre gener, c-Fos, Dusp1 och Zfp36, i cancerceller som inte är beroende av onkogena signalering för överlevnad och, således, är okänsliga för TKI-behandling. Nedreglering av c-Fos och Dusp1 av shRNA-medierad knockdown är tillräcklig för att återställa drog känslighet i annars TKI-resistenta celler.
För att validera c-Fos och Dusp1 roll som den terapeutiska mål i leukemi, bekräftades deras överuttryck först med BaF3 celler som uttrycker den BCR-ABL1 onkogen. Tillväxtfaktor signalering i BaF3-BA cellerna upphäver onkogen beroende; Följaktligen, svarar de inte på TKI-behandling. Kvantitativa uttryck analys av RT-qPCR och western blotting bekräftat att både c-Fos och Dusp1 induceras av BCR-ABL1 och deras uttryck är ytterligare förstärkt av tillväxtfaktorn IL-3 (figur 1A - 1 C).
Att studera c-Fos och Dusp1 in vivo roll möss som saknar c-Fos (villkorlig mus modell c-Fosfl/fl med Rosa26-CreERT2) eller Dusp1 (raka KO Dusp1- / -) och möss som saknar både c-Fos och Dusp1 (Rosa26-CreERt2-Fosfl/fl/Dusp1- / - ) utvecklades. Dessa möss var genotypbestämts med PCR med genomiskt DNA från svansen och PCR skiljas lätt c-Fosfl/fl, Dusp1 KO från WT möss (figur 2A). Inducerad strykningen av c-Fos av tamoxifen behandling bekräftades av PCR, genom uppkomsten av ett band jämfört med inga band i möss som inte behandlats med tamoxifen (figur 2B).
För att testa roll c-Fos och Dusp1, benmärg-derived c-Kit+ celler från WT, Dusp1- / -, var c-Fosfl/fl, och Dusp1- / -/c-Fosfl/fl isolerade och sensorik med MSCV-BCR-ABL1-Ires-YFP retrovirus; en schematisk av förfarandet är visas i figur 3. YFP+ uttrycker (används som en surrogatmarkör för BCR-ABL1 uttryck) var sorterade efter FACS (figur 4) för ytterligare in vitro-(CFU) och invivo analyser. Resultaten visar att strykningen av c-Fos och Dusp1 ensam hämmade CFU nummer (< 50%). Intressant, celler som saknar både c-Fos och Dusp1 var betydligt äventyras i kolonibildande förmåga, och imatinib behandling utplånades alla CFUs, tyder på att förlusten av c-Fos och Dusp1 är syntetiskt dödliga för BCR-ABL1 uttryck (figur 5 ).
In vitro-CFU analyserna ge forskarna möjlighet att snabbt testa fenotypen av KO och aktivitet av de liten molekyl-hämmare. Dock ytterligare bekräftar i vivo analys giltigheten av målen. För Invivo validering utnyttjade vi först en snabb transduktion transplantation modell1 där BCR-ABL1 orsakar dödlighet inom två till tre veckor. Femtio tusen YFP-positiva celler, tillsammans med 300 000 – 500 000 benmärg-derived mononukleära celler från normal mus, skulle injiceras i dödligt bestrålade möss att inducera KML. Möss bära c-Fosfl/fl cellerna eller c-Fosfl/flDusp1- / - celler injicerades med tamoxifen efter 10 dagar av transplantation ta bort den c-Fos. Möss som fick antingen WT eller Dusp1- / - celler utvecklade leukemi och dukade under till döden inom två till fyra veckor, medan radering av c-Fos ensam visade en betydande försening i sjukdomsutvecklingen och TKI behandling räddade nästan 50% av mössen från döden. Intressant, mössen transplanteras med celler som saknar både c-Fos och Dusp1 överlevde längre, och TKI behandling botas alla möss CML (figur 6A - 6 C). Mössen som överlevde successivt förlorat YFP+ cellerna, som visas i c-Fos och dubbel KO vid behandling med imatinib (figur 6 d-6F), vilket tyder på clearance av BCR-ABL1 positiva celler.
KML är en stamcellstransplantation sjukdom och tanke retrovirus oförmåga att rikta de primitiva och quiescent hematopoetiska cellerna, det är absolut nödvändigt skulle för att testa om inriktning c-Fos och Dusp1 vara tillräcklig för att undanröja leukemiska stamcellernas. Tetracyklin-inducerbara BCR-ABL1 transgena möss där tTA är uttryckt av en Scl-förstärkare, som är specifikt uttryckt i hematopoetiska stamceller, har tidigare använts för att studera målgener i LSCs roll. Tetracyklin-inducerbara BCR-ABL1 transgena möss (figur 7A-7B) utnyttjades för att undersöka rollen som c-Fos och Dusp1 i LSCs. LSK cellerna från dessa möss sorterades använder FACS och injiceras i mottagarens möss (figur 7C). Efter en månad av transplantation, var leukemiska engraftment gjorde, följt av läkemedelsbehandling. Den leukemiska bördan och nivåer av LSK bestämdes varje månad i sex månader. Möss som behandlats med imatinib ensam visade en dämpning av leukemi men lämnades med Antiapnéskenan. Därför resulterade behandlingsavbrott, som observerats i kliniken, i återfall. Däremot möss behandlas med en kombination av droger imatinib + DFC (c-Fos-hämmare) + BCI (Dusp1 hämmare) utrotad helt i leukemic celler och möss botade av KML (figur 7 d och 7E).
Att upprätta de farmakodynamiska avläsningssystem för c-Fos och Dusp1-hämmare och att studera deras på målet effekt, phospho-p38 nivåer (en surrogatmarkör för Dusp1 hämning) mättes och uttrycket av c-Fos-reglerade gener, som IL-6, bcl2l11 och Lif, kvantifierades. Vi och andra har etablerat att hämning av Dusp1 leder till aktivering av p38 (mätt genom ökad fosforyleringen av p38)13. Phospo-p38 nivåerna mättes av FACS i helblod celler isolerade från drog-behandlade möss. Som förväntat, de phospho-p38 ökat (figur 8A) och uttrycket av c-Fos-reglerade gener (IL-6, bcl2l11 och Lif) var nedreglerade i drog-behandlade möss (figur 8B). Dessa resultat tyder på att hämmare hämmar deras mål och överlevnad möss är på grund av hämning av c-Fos och Dusp1.
För människors relevans, effekten av c-Fos och Dusp1-hämmare testades med patientprover i in vitro-(LTC-IC) och invivo analyser (mus xenograft). Behandlingen med DFC + BCI är inte effektiv på leukemiska stamceller. Dock utrotad en kombination av DFC + BCI + imatinib selektivt leukemiska stamcellerna i båda analyser samtidigt skona normala stamceller (figur 9A - 9 C). Dessa resultat fastställa att c-Fos och Dusp1 är avgörande för leukemiska omvandling, och ett högt uttryck av dessa gener upphäver onkogen beroende vilket resulterar i återfall och läkemedelsresistens. Därför blir en kombinatorisk inriktning av c-Fos och Dusp1 tillsammans med föraren onkogen effektivare och, kanske, en läkande strategi för många cancerformer. Vi räknar med att de metoder som beskrivs här generellt kan användas för ytterligare target identifiering och validering.
Figur 1 : c-Fos och Dusp1 är i ökad utsträckning bemöta tillväxtfaktor IL-3. qPCR-analys av ett överuttryck av (A) c-Fos och (B) Dusp1 i cytokin-behandlade BaF3-BA-celler. Relativa uttrycket bestämdes efter normalisering till β-aktin. Felstaplar representera standardavvikelsen från tre identiska prover. (C) Western blot analys av BaF3-BA celler behandlas med IL-3 och utforskad med c-Fos summa eller P-c-Fos och Dusp1 antikropp. Anti aktin antikropp användes som laddar kontroll. Denna siffra var anpassad med tillstånd från Kesarwani et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Genotypning av c-Fosfl/flDusp1 och Rosa cre-ER möss. (A), PCR analys av svans DNA. Förväntat band är från WT eller c-Fosfl/fl-bär CreER transgenens och Dusp1 KO möss. De band storlekarna anges till vänster. (B), PCR analys av ett mindre band efter strykningen av c-Fos med tamoxifen-behandling. M = 1 kb + DNA stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Schematisk transduktion och transplantation modellens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : FACS visar frekvensen av YFP+ celler från blodet av en transplanterad och en WT mus (negativ kontroll). De översta panelerna visar ett spridningsdiagram av cellerna och den gating. De lägsta panelerna visar histogrammen för YFP vs. side scatter. Celler med ett MFI av > 103 ansågs YFP +. Liknande gating användes för benmärgsceller efter transduktion för beräkning av den procentuella transduktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa tallrikar från CFU plätering. Plåtarna visar kolonierna färgas med iodonitrotetrazolium klorid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : c-Fos och Dusp1 brister kompromissa leukemi utveckling. (A-C) Överlevnadskurvor för möss transplanteras med c-Kit+ BCR-ABL1 celler från WT, Dusp1- / -c-Fos- / -, och c-Fos- / - Dusp1- / - möss. (D-E) Procentandel av YFP + celler som bestäms av FACS i perifert blod av de transplanterade möss dras varje vecka signifikant. Nivåerna av YFP ökar och mössen duka till döden som i WT och Dusp1 KO. De möss som överlever successivt förlorar YFP+ celler som visas i c-Fos och dubbel KO vid behandling med imatinib. Denna siffra var anpassad med tillstånd från Kesarwani et al. 13. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7 : c-Fos och Dusp1 krävs för överlevnaden av LSCs. (A) Schematisk bild av den transgene som används i transgena möss uttrycker BCR-ABL1 i stamceller. (B) experimentell design för att studera effekterna av Dusp1 och c-Fos hämning av DFC och BCI in vivo. (C) FACS tomter av swing Usenets strategi används för sortering LSK celler för transplantation. (D) andel av BCR-ABL1 (bestäms av procentandelen av CD45.2 från givare möss) positiva celler i möss under och uppföljningsbesök-hämmare. (E), FACS scatter diagram som visar den CD45 chimärism i levande celler, liksom i LSK cell facket. Vänligen notera avsaknaden av CD45.2 totalt och i LSK facket på behandlade möss. Denna siffra var anpassad med tillstånd från Kesarwani et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: In vivo aktivitet DFC och BCI. (A) linje graf visar nivåerna av phospho-p38 efter BCI behandling. (B) RT-qPCR visar uttrycket av de c-Fos målgener i perifert blod av möss efter DFC behandling. Prickarna representerar tre replikat från varje mus (n = 3). Numret ovanför kurvorna representerar p-värde som beräknas av Students t-test. Denna siffra var anpassad med tillstånd från Kesarwani et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : C-Fos och DUSP1 hämning i en mänsklig patientprov roll. (A) andel av CFUs bestäms av LTC-IC analysen från två KML-patienter och friska givare behandlas med fordonet eller de angivna läkemedelskombinationer. (B) andelen mänskliga leukemic celler (hCD45) i benmärgen av Nätverkssäkerhetsgrupper möss vecka 2 (vänster) och vecka 4 (höger) av behandlingen. (C) i denna panel visas representativa FACS tomter visar en dramatisk minskning av hCD45 celler i drog-behandlade möss samtidigt skona musen celler visas som mCD45. Denna siffra var anpassad med tillstånd från Kesarwani et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För huvuddelen av cancerceller medieras det terapeutiska svaret till TKI av en blockad av tyrosin-Kinas-onkoprotein signaler som tumören är beroende av. Dock är relativt lite känt om hur en minoritet av cancerceller som bidrar till MRD fly onkogen beroende och terapi4. Senare studier visade att tillväxtfaktor signalering förmedlar resistens i både leukemi och solida organ tumörer. Detta tyder på att olika molekylära mekanismer kan ligga till grund för inneboende motstånd10,11,12. För att förstå mekanismen och identifiera genen mål för terapeutisk utveckling, utfört vi omfattande helgenom-uttrycket profiler med hjälp av musen (BaF3) och mänskliga (K562) celler. Primära prover från leukemic möss eller KML patienter användes inte eftersom vi misstänkte att som primär benmärg prover är betydligt heterogena, kommer de mask identiteten för relevanta gener/mål. Även celler renas av antikroppsmedierad sortering (perifera stamceller) uppvisar betydande heterogenitet. Därför, en renad cellinje är förmodligen bättre lämpad för target identifiering för att undvika oönskad komplexitet som införts av genetisk heterogenitet. Helgenom-uttryck analys identifierat att c-Fos, Dusp1 och Zfp36 är vanligen uppreglerad i resistenta celler. När målen har identifierats, blir deras validering en viktig del att erkänna sin roll i det givna genetiska sammanhanget. Med hjälp av cDNA överuttryck och genetiska knockdown studier i BaF3 celler visade att hämning av c-Fos och Dusp1 är tillräckliga och nödvändiga för effektiv TKI känslighet. Kanske är en av de viktigaste stegen i målet validering att validera relevansen av identifierade gener/mål i delprov från både mus och människa. I detta protokoll, vi tillhandahåller steg för steg utnyttjande av flera genetiska modeller och ge bättre mekanistiska insikter för ytterligare förfining av drogen/target utvärdering.
En snabb screening på cellnivå utnyttjar CFUs eller LTCIC analysen hjälper forskare att testa flera läkemedelskombinationer som koncentrationer, snabbt innan du går till mer tidskrävande transplantation metoder. Tanke på att KML är en stamcellstransplantation sjukdom och tanke retrovirus oförmåga att rikta de primitiva och quiescent hematopoetiska cellerna, det är absolut nödvändigt att testa med hjälp av modeller som direkt rör deras roll i LSC överlevnad. För att åtgärda detta, utnyttjade vi en tetracyklin-inducerbara BCR-ABL transgena möss där tTA är uttryckt av en Scl-förstärkare. Nonetheless, genetiska modeller är bristfällig i går igenom den mänskliga sjukdomen. Det är därför nödvändigt att testa primära patientprover i humaniserad musmodeller. För att kunna göra en undersökning för detektion av MRD över tiden, en stabil xenograft krävs dock som, beroende på möss och cell typer, kan variera. Efter fyra månader av transplantation tömdes de mänskliga CD34 + cellerna även utan den missbruksbehandling, vilket är en begränsning i mest humaniserad musmodeller. Bättre humaniserad musmodeller utvecklas för att testa de mänskliga cellerna i möss26. Vi rekommenderar starkt att bestämma aktiviteten på målet av hämmare eftersom någon off-target effekt kan orsaka toxicitet för normala celler, begränsa dess ytterligare ansökan. Om nedströms målet inte är känd, bör dock olika metoder utnyttjas. Till exempel kan att identifiera resistenta mutanter med slumpmässig mutagenes av målproteinet direkt upp huruvida hämmaren är målet27.
Det protokoll som presenteras här ger en omfattande metod för target identifiering och validering med flera in vitro- och in-vivo modellsystem. Dessa metoder kan enkelt anpassas till andra mål och typer av cancer. Ytterligare mekanistiska studier på identifierade målen och förfining i drogen inriktning kan bidra till utveckling av bättre terapeutiska för effektiv eller kurativ behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma att G. Q. Daley för att ge de BaF3 och WEHI cellerna och T. Reya för den MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruerar. Författarna är tacksam till M. Carroll för att tillhandahålla patientproverna från den CML blastkris. Denna studie stöddes av bidrag till M.A. från NCI (1RO1CA155091), leukemi Research Foundation och V stiftelse, och från NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 μM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 μm nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet (boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II (FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I (FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII (FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
- DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
- SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
- Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
