Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Spp. السالمونيلا هيدوسنتاريا spp. مسببات الأمراض الشائعة المنسوبة إلى الإسهال. هنا، يمكننا وصف منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. بكر في الوقت الحقيقي باستخدام جنبا إلى جنب مع الثقافة المصحوبة بمرشدين.

Abstract

انتقال البراز عن طريق الفم لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد يحدث من وقت لآخر، خاصة عندما يصاب الناس الذين يتناولون الطعام والماء من السالمونيلا spp./Shigella spp. الأسلوب معيار الذهب للكشف عن السالمونيلا spp./Shigella spp. الثقافة مباشرة لكن هذا ذات العمالة الكثيفة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، يصف لنا منبرا الفائق السالمونيلا spp./Shigella spp. الفحص، واستخدام الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) جنبا إلى جنب مع الثقافة المصحوبة بمرشدين. هناك مرحلتان الرئيسية: PCR الوقت الحقيقي والثقافة المصحوبة بمرشدين. للمرحلة الأولى (PCR الوقت الحقيقي)، ونحن شرح كل خطوة من الأسلوب: عينة جمع واستخراج الحمض النووي وتخصيب اليورانيوم قبل PCR الوقت الحقيقي. إذا كانت نتيجة PCR الوقت الحقيقي الإيجابي، ثم يتم تنفيذ المرحلة الثانية (ثقافة الإرشادية): ثقافة انتقائية، والبيوكيميائية تحديد وتوصيف المصلية. نحن أيضا توضيح الممثل النتائج المتولدة عن ذلك. البروتوكول هو موضح هنا سيكون منبرا قيماً لفحص سريعة ومحددة، وحساسة والفائق السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Introduction

الإسهال لا تزال قضية صحية مشتركة مع حدوث ارتفاع معدل عالمياً1،2. على الرغم من أن معدل وفيات منخفض نسبيا، إظهار بعض المرضى أعراض مختلفة لمدة أسابيع (مثل مائي وفضفاضة البراز، ملحة للذهاب إلى الحمام)، التي تجعل الأثر الاجتماعي-الاقتصادي عالية جداً3،4. الأخطر من ذلك، بعض المرضى قد حتى وضع القولون العصبي إذا ما تركت دون علاج5. وهناك أنواع مختلفة من البكتيريا والفيروسات والطفيليات التي يمكن أن تسبب الإسهال6. Spp. السالمونيلا دوسنتاريا spp. هي بين البكتيريا الأكثر شيوعاً لانتقال العدوى من التهاب المعدة والأمعاء الحاد7،،من89،،من1011. ولذلك، قد أصدرت العديد من المقاطعات القوانين أو الأنظمة العادية السالمونيلا spp./spp.دوسنتاريا الفرز بين الناس الذين سيكون التعامل مع المواد الغذائية والمياه. على سبيل المثال، أن الحكومة الصينية قد أصدرت قوانين إلزامية السالمونيلا spp./spp.دوسنتاريا الفحص مرة واحدة في سنة.

طريقة معيار الذهب السالمونيلا spp. هو كشف spp.دوسنتاريا البكتيريا الثقافة. من خلال الثقافة البكتيريا وتحديد البيوكيميائية المتعاقبة وتوصيف المصلية، يمكننا تحديد هذه أنواع البكتيريا، والتي يمكن أن تسهل إدارة تفشي الأمراض والميكروبات التنميط للمساعدة في علاج المرضى 12-يمكن أن يساعد أيضا تتبع مصدر العدوى خلال spp. السالمونيلا /دوسنتاريا spp. اندلاع13. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو كثيفة العمالة (التي تتطلب عملية يدوية) وتستغرق وقتاً طويلاً (عدة أيام أخذ)، خاصة بالنسبة لاختبار عدد كبير من العينات7. وعلاوة على ذلك، قابلة للتطبيق ولكن غير كولتورابل (فبنك) السالمونيلا spp./قد تكون موجودة في بعض عينات البرازدوسنتاريا spp.14. ونظرا لهذه العيوب، حاولت العديد من المختبرات لتطوير تقنيات جديدة للكشف عن السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.15،16،،من1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25-كل هذه الأساليب استخدام اختبار تضخيم الحمض النووي (NAAT)، بينها البلمرة المتسلسل (PCR) هو الأكثر شيوعاً. هو القيد الرئيسي واحد من هذه الأساليب NAAT على أساس أن الميت البكتيريا، الحطام حتى البكتيرية المحتوية على ناقصة الحمض النووي، يمكن أن تظهر نتائج إيجابية26، التي يمكن أن تؤثر إلى حد كبير في التشخيص الدقيق للمرض. وأظهرت بلانكو et al. أن المقايسة الجزيئية حساسة للغاية، ليس فقط لصالحه السالمونيلا في الثقافات، ولكن أيضا للجينوم جزئية وبكتيريا ميتة أو غير قادرة على البقاء من الالتهابات الماضية أو تلوث26. ولذلك، ينبغي تطوير تكنولوجيا جديدة.

هنا، يمكننا وصف أسلوب رواية أن يجمع NAAT أساس الأسلوب واستزراع. كما هو مبين في الشكل 1، يطبق هذا الأسلوب الجديد PCR الوقت الحقيقي الفرز الأولى وثم يتم إرسال عينات إيجابية للبكتيريا الثقافة والهوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في تشوهاى مركز الرعاية الصحية السفر الدولي. الرجاء استخدام العملية العقيمة القياسية من خلال التجربة.

1. إعداد وتكوين ثقافة الإعلام

  1. إعداد مرق المغذيات: يحل الجلوكوز 0.1% في ح2س، كلوريد الصوديوم 0.5% ببتون 1%، استخراج لحوم البقر 0.3 في المائة، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.5 والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. إعداد متوسطة "سيلينيت السيستين": حل ببتون 0.5%، 1% Na2HCO30.4% سيلينيت الصوديوم الهيدروجين،، اللاكتوز 0.4% 0.001 في المائة ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0 لام-السيستين في ح2س، ويغلي لمدة 5 دقائق.
  3. إعداد إكسيلوسي، يسين، طبق أجار (XLD) ديوكسيتشولاتي: استخراج ذوب الخميرة 0.3%، 0.5% L-يسين، xylose 0.375%، اللاكتوز 0.75 في المائة، السكروز 0.75 في المائة، وكلوريد الصوديوم 0.5%، % 0، 008 الفينول الأحمر، 0.68% ثيوكبريتات الصوديوم، 0.08 في المائة الأمونيوم سترات الحديديك، الصوديوم 0.25% deoxycholate، أجار 1.5% في ح2س، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4. ثم يغلي لمدة 5 دقائق وصب ذلك في لوحات 90 ملم.
  4. إعداد لوحة اللونية أجار السالمونيلا : حل أجار 1.5%، واستخراج 0.7% ببتون والخميرة، كاشف 1.29 في المائة انتقائية في ح2o. ثم يغلي لمدة 5 دقائق وصب ذلك في لوحات 90 ملم.
  5. إعداد لوحة أجار المغذيات: حل ببتون 1%، واستخراج لحوم البقر 0.3%، 0.5% كلوريد الصوديوم، أجار 1.5% في ح2س، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.3. ثم اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وأنه صب في لوحات 90 ملم.
  6. إعداد لوحة ماكونكي أجار (MAC): حل ببتون 2%، 1% لاكتوز، وكلوريد الصوديوم 0.5%، 0.5% ثور الصفراوية الملح، 0.0025% "الأحمر محايدة"، أجار 1.5%، 0.0001% الكريستال البنفسجي في ح2س، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2. ثم اﻷوتوكﻻف في 115 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وصب ذلك في لوحات 90 ملم.

2. في الوقت الحقيقي بكر

  1. جمع العينات
    1. إدراج مسحه الشرج إلى فتحه الشرج للمريض 3-5 سم عمق، واستدارة 360 درجة حول ذلك.
    2. وضع مسحه الشرج إلى أنبوب جمع عقيمة. معرف علامة عينة.
    3. إرسال العينة إلى المختبر بالسرعة الممكنة.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات في 4 درجات مئوية لأي أكثر من 24 ساعة.
  2. تخصيب اليورانيوم قبل
    1. أضف 3 مل من "مرق المغذيات" في كل عينة في أنبوب جمع.
    2. احتضان عند 36 درجة مئوية ح 6 في حاضنة.
  3. عينة خلط (اختياري)
    1. جمع 100 ميليلتر من كل ثقافة ما قبل تخصيب اليورانيوم ومزيج 8-10 عينات من العينات 1 في أنبوب 1.5 مل إذا كان هناك أكثر من 10 عينات.
    2. وضع علامة بشكل صحيح.
  4. استخراج الحمض النووي
    1. الطرد المركزي ثقافة تخصيب اليورانيوم قبل الساعة 800 x ز لمدة 2 دقيقة للسماح للجسيمات الكبيرة ليستقر، ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وأجهزة الطرد المركزي في س 12,000 ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية بالطموح.
    2. إضافة 100 ميليلتر من حل استخراج الحمض النووي (0.01 M pH 8.0 تريس-يدتا، 0.01 ٪ نونيديت ف 40 (NP40)) لبيليه. الدوامة بشدة لمدة 1 دقيقة.
    3. يغلي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حمام جافة.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز للحد الأدنى 5 جمع المادة طافية باستخدام أنبوب جديد، الذي سوف يكون القالب لتحليل PCR الوقت الحقيقي المتعاقبة.
  5. بكر في الوقت الحقيقي
    1. إعداد الخليط رد فعل كمتابعة: لكل عينة، إضافة 12.5 ميليلتر من 2 × خليط رد فعل، 0.4 ميكرون لكل التمهيدي، 0.2 ميكرون لكل مسبار (تسلسل في الجدول 1)27، 5 ميليلتر من القالب كما أعد الخطوة 2.4.4، واستخدام ddH2س لإضافة إجمالي يصل إلى 25 ميليلتر وحدة التخزين.
    2. إعداد البرنامج الدراجات كما يلي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 15 ق، 55 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لإشارات الفلورسنت جمع س. 34 من 6-كاربوكسي-فلوريسسين (الاتحاد الماليزي) وقنوات هيكساتشلوروفلوريسسين (ست عشري) في الخطوة استطالة (72 درجة مئوية) تلقائياً بواسطة آلة PCR الوقت الحقيقي الفلورسنت.
    3. إجراء PCR الوقت الحقيقي على جهاز PCR الوقت الحقيقي فلورسنت، وفقا لتعليمات من هذا الصك.
    4. انتقل إلى "الخطوة الرابعة" مباشرة وإصدار التقارير السلبية في حالة حدوث نتائج سلبية على قنوات الاتحاد الماليزي/ست عشري، مما يعني أن عينات سلبية السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.
    5. انتقل إلى الخطوة 3.1 أو 3.2 حالة إيجابية نتائج تحدث على قنوات HEX و/أو الاتحاد الماليزي، مما يعني أن العينة قد تكون إيجابية بالنسبة السالمونيلا spp. و/أو دوسنتاريا spp.، على التوالي.
      ملاحظة: إذا خلط العينة قد أنجز في الخطوة 2، 3، ثم بكر في الوقت الحقيقي على العينات الفردية التي تشكل واحدة إيجابية ينبغي إجراء لحجب نموذج إيجابي حقيقي.

3-تسترشد الثقافة

  1. السالمونيلا spp. بكر عينة إيجابية
    1. ثقافة انتقائية في المتوسط
      1. إضافة 100 ميليلتر لتخصيب اليورانيوم قبل الثقافة إلى 5 مل من "السيستين سيلينيت" المتوسطة في أنبوب اختبار. احتضان عند 36 درجة مئوية ح 18 – 24 في حاضنة.
    2. فصل الثقافة على لوحة
      1. جمع حلقة واحدة للثقافة مع الصغير-حلقة وانتشرت على لوحة XLD أو اللوحة اللونية أجار السالمونيلا . احتضان عند 36 درجة مئوية ح 18-24 في حاضنة.
    3. تعريف الكيمياء الحيوية
      1. حدد مستعمرة المشبوهة على لوحة XLD (مستعمرة الوردي مع/بدون قلب الظلام؛ الظلام مستعمرة مستعمرة أصفر مع/بدون قلب الظلام) أو اللوحة اللونية أجار السالمونيلا (مستعمرة الأرجواني أو برونوسوس، على نحو سلس وجولة) (الشكل 2).
      2. الموضوع مستعمرة المشبوهة لتحديد البيوكيميائية على نظام التعرف الآلي الميكروبية، وفقا لتعليمات من هذا الصك.
    4. توصيف المصلية
      1. O وصف مستضد
        1. أضف قطره واحدة سيرا مستضد O التخصصات إلى شريحة نظيفة.
        2. جمع حلقة واحدة مستعمرة مع حلقة صغيرة وطحن سيرا.
        3. انتقل إلى الخطوة 3.1.4.1.4 إذا كان يبدو وكأنه تتدفق الرمال، مما يعني أن هذه المستعمرة رد الفعل للأمصال (الشكل 3). وإلا، انتقل إلى الخطوة 3.1.4.1.5.
        4. استخدام مستضد O الأمصال الفموي الأحادي التكافؤ لكرر الخطوات من 3.1.4.1.1 إلى 3.1.4.1.3 حتى تتسم مستضد O محددة.
        5. استخدام الأمصال السادس إلى تكرار الخطوات 3.1.4.1.1 إلى 3.1.4.1.3. جمع تلك المستعمرات سيرا السادس رد الفعل في أنبوب ويغلي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حمام جافة. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز للحد الأدنى 5 جمع بيليه، وكرر الخطوات من 3.1.4.1.1 إلى 3.1.4.1.4 حتى تتسم مستضد O محددة.
      2. توصيف مستضد ح
        1. أضف قطره واحدة سيرا الشاملين مستضد ح إلى شريحة نظيفة.
        2. جمع حلقة واحدة مستعمرة مع حلقة صغيرة وطحن سيرا.
        3. انتقل إلى الخطوة 3.1.4.2.4 إذا كان يبدو وكأنه تتدفق الرمال، مما يعني أن هذه المستعمرة رد الفعل للأمصال.
        4. استخدام ح مستضد الفموي الأحادي التكافؤ الأمصال لتكرار الخطوات 3.1.4.2.1 إلى 3.1.4.2.3 حتى تتسم محددة ح مستضد.
          ملاحظة: في بعض الأحيان التعريفي المصل قد تحتاج لتوصيف مستضد ح المرحلة الثانية. إذا كان الأمر كذلك، ينبغي أن يكون تنفيذ الخطوات التالية اختيارية.
        5. (اختياري) أضف قطره واحدة من ح محددة مستضد سيرا على لوح أجار المغذيات. انتظر حتى يتم استيعاب جميع الأمصال.
        6. (اختياري) جمع حلقة واحدة مستعمرة بحلقة صغيرة وانتشار على اللوحة حيث يتم امتصاصها ح محددة مستضد الأمصال. احتضان عند 36 درجة مئوية ح 18-24 في حاضنة.
        7. (اختياري) استخدام الأمصال الفموي الأحادي التكافؤ مستضد ح لتكرار الخطوات 3.1.4.2.1 إلى 3.1.4.2.3 حتى تتميز المرحلة الثانية مستضد ح.
        8. انتقل إلى الخطوة 4.
  2. دوسنتاريا spp. بكر عينة إيجابية
    1. فصل الثقافة على لوحة
      1. جمع حلقة واحدة للثقافة قبل تخصيب اليورانيوم مع الصغير-حلقة وانتشرت على لوحة XLD أو لوحة ماك. احتضان عند 36 درجة مئوية ح 18 – 24 في حاضنة.
    2. تعريف الكيمياء الحيوية
      1. جمع مستعمرة المشبوهة في لوحة XLD (سلس، الجولة، مستعمرة شفافة وأحمر) أو لوحة ماك (السلس، الجولة، مستعمرة شفاف وعديم اللون مع 2-3 مم في القطر؛ سوني دوسنتاريا قد تكون أكبر وانتقل إلى الضوء الوردي استطالة وقت الحضانة) (الشكل 4).
      2. الموضوع مستعمرة المشبوهة لتحديد البيوكيميائية على نظام التعرف الآلي الميكروبية، وفقا لتعليمات من هذا الصك.
    3. توصيف المصلية
      1. أضف قطره واحدة سيرا دوسنتاريا الشاملين spp. إلى شريحة نظيفة.
      2. جمع حلقة واحدة مستعمرة مع حلقة صغيرة وطحن سيرا.
      3. انتقل إلى الخطوة 3.2.3.4 إذا كان يبدو وكأنه تتدفق الرمال، مما يعني أن هذه المستعمرة رد الفعل للأمصال.
      4. استخدام دوسنتاريا spp. الأمصال الفموي الأحادي التكافؤ لتكرار الخطوات 3.2.3.1 إلى 3.2.3.3 حتى تتميز spp. دوسنتاريا محددة.
      5. انتقل إلى الخطوة 4.

4-تقرير

  1. إصدار تقارير إيجابية أو سلبية وفقا للنتائج المذكورة أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان تطبيق البروتوكول لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. في الشرج من البراز عينات من الناس الذين سيكون التعامل مع المواد الغذائية والمياه.

في الخطوة PCR الوقت الحقيقي، كما هو مبين في الشكل 5ألف، كان هناك تضخيم ناجحة في قناة ست عشري، مما يعني أن العينة المختلطة إيجابية السالمونيلا spp. ثم أجرى مواصلة PCR الوقت الحقيقي على العينات الفردية التي تشكل واحدة إيجابية. كما هو موضح في الشكل 5ب، نموذج 2 كان إيجابيا. ولذلك، اختيرت عينة 2 لثقافة الإرشادية السالمونيلا spp. في الشكل 5ج، وكان هناك تضخيم ناجحة في قناة الاتحاد الماليزي، مما يعني أن العينة المختلطة إيجابية دوسنتاريا spp. ثم أجرى مواصلة PCR الوقت الحقيقي وتم العثور على نموذج 10 إيجابية (الشكل 5د). ولذلك، اختيرت عينة 10 لثقافة الإرشادية دوسنتاريا spp.

في ثقافة السالمونيلا spp. مرشد، كانت هناك مستعمرات الوردي والأرجواني المستعمرات على الصفيحة XLD وصفيحة اللونية أجار السالمونيلا ، كل على حدة، كما هو مبين في الشكل 2. ثم تعرض هذه المستعمرات لتحديد البيوكيميائية على نظام التعرف الآلي الميكروبية. وأظهرت النتائج أنه من السالمونيلا spp.، مع الأنواع غير معروف. ولذلك، كان توصيف المصلية المؤداة (الشكل 3)، وكان رد الفعل على O4، O12، غبطة، H1، 2. وفقا لمخطط "القصر" الأبيض-كاوفمان-جنيه، ذكر العينة 2 أخيرا أنها إيجابية السالمونيلا التيفية ب. بينما بالنسبة لثقافة دوسنتاريا spp. مرشد، هناك مستعمرات الأحمر وعديم اللون الوردي على الصفيحة XLD وصفيحة ماك، كل على حدة، كما هو موضح في الشكل 4. ثم هذه المستعمرات تعرضوا أيضا لتحديد البيوكيميائية على نظام التعرف الآلي الميكروبية. وأظهرت النتائج أنه من سوني دوسنتاريا. للتأكد من أن النمط المصلي المسيطر محددة، كان توصيف المصلية المؤداة (الشكل 3)، وكان رد الفعل على سوني المرحلة الثانية. ولذلك ذكر العينة 10 أخيرا إيجابية دوسنتاريا سوني المرحلة الثانية.

Figure 1
الشكل 1 : الرسم التخطيطي للبروتوكول. سيظهر خطوتين رئيسيتين ومفصولة بخط متقطع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : نتائج ثقافة الممثل السالمونيلا spp. على الصفيحة XLD وصفيحة اللونية أجار السالمونيلا . على لوحة XLD، كانت هناك مستعمرات الوردي مع/دون قلب الظلام، بينما في اللوحة اللونية أجار السالمونيلا ، كانت هناك مستعمرات الأرجواني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : نتيجة توصيف المصلية الممثل. كان رد الفعل للأمصال المستعمرة، بدأ وكأنه تتدفق الرمال (إلى اليسار). وإلا فإنه عكر (إلى اليمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : نتائج ثقافة الممثل دوسنتاريا spp. على الصفيحة XLD وصفيحة ماك. على لوحة XLD، كانت هناك مستعمرات حمراء، بينما في لوحة ماك، كانت هناك مستعمرات شفاف وعديم اللون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : الممثل نتائج PCR الوقت الحقيقي- (أ) عرافة قناة للعينات ميكس. (ب) عرافة قناة للعينات الفردية. (ج) الاتحاد الماليزي القناة للعينات ميكس. (د) الاتحاد الماليزي القناة للعينات الفردية. الكمبيوتر: مراقبة إيجابية. NC: المراقبة السلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الممرض الاسم Sequence(5'-3')
السالمونيلا سأل-F
سأل-R
سأل-التحقيق		 جكتكاتاتاتككجكاتتاك
كاجتكاتاجككاجااج
عرافة--أتاجتاتككاتككجااتجككتجكجت--الكسوف
دوسنتاريا و شي
شي-R
شي-التحقيق		 ككججاتااجتكاجاكتك
كاجتجاجاجكتجاجتتك
الاتحاد الماليزي--أجككاجتاجاكتكتاتكتكاتككاك--الكسوف

الجدول 1: الإشعال والمجسات المستخدمة. تم توفير اسم وتسلسلات الإشعال والمسابير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منذ السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. غالباً ما تكون مقترنة بالتسمم الغذائي وانتقال البراز عن طريق الفم لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد28،29 والأسلوب الروتيني أما كثيفة العمالة أو تستغرق وقتاً طويلاً 7، يصف لنا منهاج spp. السالمونيلا الفائق/دوسنتاريا spp. الفحص باستخدام PCR الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع الثقافة المصحوبة بمرشدين.

وهناك العديد من الخطوات التي تحتاج إلى النظر فيها تحقيق أقصى قدر من القدرة على هذا النظام الأساسي. الأول هو الخطوة قبل تخصيب عينات في "مرق المغذيات" (الخطوة 2، 2). على الرغم من أن لا خطوة تخصيب اليورانيوم قبل المسبق لعينات البراز التي جمعت من المرضى المصابين بأعراض واضحة، مثل الإسهال، و ما إلى ذلك، تزال هناك حاجة خطوة تخصيب اليورانيوم قبل عام ح 6 لعينات مسحه الشرج، عندما جمعت أثناء ما قبل التوظيف الفحص البدني للأشخاص الذين سيكون التعامل مع الغذاء والماء، كما أن هؤلاء الناس كانوا أساسا من البالغين صحية أو أعراض على الأقل. إذا كان تطبيق البروتوكول فقط للكشف عن السالمونيلا spp.، ثم قبل تخصيب اليورانيوم يمكن أن تجري في المتوسط "السيستين سيلينيت" بغية زيادة الحساسية. والخطوة الحاسمة الثانية هي تحديد المستعمرات المشبوهة (الخطوة 3.1.3.1 و 3.2.2.1). وهناك العديد من النباتات خلفية التدخل في عينات البراز التي قد تحجب كشف وعزل مسببات الأمراض المستهدفة30. ولذلك، ينبغي أن يوضع في الاعتبار السمة للمستعمرات المشبوهة كخطوة محددة في 3.1.3.1 و 3.2.2.1 أثناء التجربة. والخطوة الثالثة الحاسمة هو توصيف المصلية السالمونيلا spp. كما تحتوي غالبية السالمونيلا spp. مرحلة ثانية لح مستضد31، يحتاج التعريفي المصل المراد تنفيذها. ومع ذلك، التعريفي المصل ليست ناجحة دائماً، وعده جولات من الاستقراء قد تكون ضرورية لتحديد المرحلة الثانية ح الصحيح.

البروتوكول محدد للغاية وحساسة كما أكده لنا الدراسة السابقة27. خصوصية عالية للبروتوكول هو تجلى قدرته، في أي السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. يمكن تمييزها من مسببات الأمراض ذات الصلة الأخرى27. الحد الأدنى للكشف عن البروتوكول هو 104 زيمبابوي/مل و 103 زيمبابوي/mL السالمونيلا spp. و دوسنتاريا spp.، على التوالي27، ومماثلة للتقارير السابقة7،32 , 33 , 34-وكما ذكرنا أعلاه، حساسية السالمونيلا spp. الكشف يمكن زيادة من "السيستين سيلينيت" قبل تخصيب اليورانيوم إذا تم تطبيق البروتوكول فقط للكشف عن السالمونيلا spp. وعلاوة على ذلك، يمكن زيادة معدل الإيجابية طيتين البروتوكول وتقليل عبء العمل/المتوسط الوقت تحول إلى حد كبير27.

مماثلة لغيرها من فحوصات NAAT، واحد الحد الرئيسية للبروتوكول، إذا ما قورنت بطريقة زراعة البكتيريا الكلاسيكية، أن البروتوكول يمكن فقط تحديد السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.، بينما الأخرى الشائعة من البكتيريا المسببة للإسهال حذف7. وفي المقابل، خلال الثقافة البكتيريا الكلاسيكية، تلك البكتيريا يمكن تحديدها في التوازي إذا كانت موجودة. قيد آخر من البروتوكول أن بعض من السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. لا يمكن أن يحددها PCR الوقت الحقيقي بسبب الاختلافات تسلسل27. ومع ذلك، إذا تظهر النتائج السلبية PCR الوقت الحقيقي لتلك العينات من المرضى الذين يعانون من أعراض سريرية واضحة، فنيي المختبرات ينبغي إيلاء اهتمام ويجوز إجراء تجارب أخرى للتأكد من النتائج. أثناء تفشي كبيرة، يجوز لنا استخدام عينة واحدة بدلاً من العينات المجمعة للجولة الأولى من فحص PCR.

وفي الختام، يمكن أن البروتوكول المقدمة هنا بمثابة منبرا قيماً لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمه العلم والبرنامج تشوهاى التكنولوجيا، الصين (المنحة رقم 20171009E030064) والعلم وبرنامج التكنولوجيا في قوانغدونغ، الصين (المنحة رقم 2015A020211004) والعلوم والتكنولوجيا لإدارة البرنامج العام الرقابة على الجودة والتفتيش والحجر الصحي للجمهورية الشعبية للصين (المنحة رقم 2016IK302، 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

التهاب المعدة والأمعاء الحاد الإصابة، العدد 141، وعلم المناعة، السالمونيلا spp.، دوسنتاريا spp.، فحص PCR الوقت الحقيقي، تسترشد الثقافة
منصة الفائق لفحص <em>السالمونيلا</em> spp./<em>دوسنتاريا</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter