Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella spp /Shigella spp sont pathogènes courants attribués à la diarrhée. Ici, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.

Abstract

La transmission fécale-orale de gastro-entérite aiguë se produit de temps en temps, surtout quand les personnes qui manipulent les aliments et l’eau sont infectées par Salmonella spp/Shigella spp. La méthode de l’étalon-or pour la détection de Salmonella spp/Shigella spp est culture directe mais c’est long et fastidieux. Nous décrivons ici une plate-forme haut débit pour Salmonella spp/Shigella spp de dépistage, à l’aide de la PCR en temps réel (PCR) combiné avec la culture guidée. Il y a deux grandes étapes : PCR en temps réel et la culture guidée. Pour la première étape (PCR temps réel), nous expliquer chaque étape de la méthode : échantillons de collection, pré-enrichissement, extraction d’ADN et la PCR en temps réel. Si le résultat de la PCR en temps réel est positif, la deuxième étape (culture guidée) est réalisée : la culture sélective, identification biochimique et caractérisation sérologique. Nous illustrons aussi résultats représentatifs générés à partir d’elle. Le protocole décrit ici serait une plate-forme utile pour le dépistage rapide, précise, sensible et haut débit de Salmonella spp /Shigella spp.

Introduction

La diarrhée est toujours un problème de santé courant à forte incidence taux globalement1,2. Bien que la mortalité est relativement faible, certains patients présentent des symptômes divers pendant des semaines (par exemple, molles et aqueuses tabourets, une urgence à aller aux toilettes), qui rendent l’impact socioéconomique très élevé3,4. Plus sérieusement, certains patients peuvent même développer le syndrome du côlon irritable si laissé non traité5. Il existe différents types de bactéries, les virus et les parasites qui peuvent causer la diarrhée6. Salmonella spp /Shigella spp sont parmi les bactéries les plus courantes pour la transmission de la gastro-entérite aiguë7,8,9,10,11. Par conséquent, beaucoup de comtés ont émis des lois ou aux règlements réguliers Salmonella spp /Shigella spp. dépistage parmi les gens qui traiteront de nourriture et eau. Par exemple, le gouvernement chinois ont publié des lois pour obligatoire Salmonella spp /Shigella spp. dépistage une fois par an.

La méthode de l’étalon-or pour Salmonella spp / détection deShigella spp est la culture de bactéries. Par le biais de la culture de bactéries et identification biochimique successive et caractérisation sérologique, nous pouvons identifier les espèces de bactéries, ce qui pourraient faciliter la gestion des épidémies maladie et profilage antimicrobienne pour faciliter le traitement des patients 12. il pourrait aussi aider à remonter à la source de l’infection au cours de la Salmonella spp /Shigella spp éclosion13. Toutefois, cette méthode est fastidieuse (nécessitant une opération manuelle) et beaucoup de temps (prendre plusieurs jours), en particulier pour les essais d’un grand nombre d’échantillons7. En outre, viable mais non cultivable (VBNC) Salmonella spp /Shigella spppeut exister dans certains échantillons de selles14. Compte tenu de ces inconvénients, plusieurs laboratoires ont tenté de développer de nouvelles techniques pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. tous ces méthodes utilisent le test nucléaire acid amplification (TAAN), parmi lesquels la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est le plus fréquent. Une limitation majeure de ces méthodes TAAN basé est que les bactéries mortes, ADN génomique incomplet contenant des débris même bactérienne, pourraient montrer des résultats positifs26, qui peuvent largement influencer le diagnostic précis de maladie. Blanco et coll. ont montré que test moléculaire est très sensible, non seulement viable Salmonella dans les cultures, mais aussi aux génomes partielles et bactéries infections passées ou contamination26morts ou non viables. Donc, les nouvelles technologies devraient être développés.

Ici, nous avons décrit une nouvelle méthode que combine le TAAN base de méthode et culture. Tel qu’illustré à la Figure 1, cette nouvelle méthode s’applique de PCR en temps réel contrôle premier et ensuite les échantillons positifs sont envoyés pour l’identification et de la culture de bactéries.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le protocole suit les lignes directrices établies par le Comité d’éthique de la recherche humaine de Zhuhai International Travel Centre de soins de santé. S’il vous plaît utiliser opération stérile standard pendant l’expérience.

1. préparation et Composition de milieux de Culture

  1. Préparer le bouillon nutritif : Dissoudre 1 % de peptone, 0,3 % d’extrait de boeuf, chlorure de sodium 0,5 %, 0,1 % de glucose en H2O, ajuster le pH à 7,5 et stériliser à 121 ° C pendant 15 min.
  2. Préparer le milieu Selenite Cystine : dissoudre la peptone de 0,5 %, 1 % Na2HCO3, 0,4 % de lactose, 0,4 % de sélénite de sodium hydrogène, 0,001 % L-Cystine en H2O, ajuster le pH à 7.0 et faire bouillir pendant 5 min.
  3. Préparer le Xylose, Lysine, gélose au désoxycholate (XLD) : extrait de levure de dissoudre 0,3 %, 0,5 % L-lysine, xylose 0,375 %, 0,75 % de lactose, 0,75 % de sucrose, 0,5 % de chlorure de sodium, rouge de phénol de 0,008 %, 0,68 % du thiosulfate de sodium, citrate d’ammonium ferrique et 0,08 %, sodium 0,25 % désoxycholate, 1,5 % d’agar en H2O et ajuster le pH à 7,4. Faire bouillir pendant 5 min, puis versez-la dans des plaques de 90 mm.
  4. Préparer la gélose Salmonella -épreuve à développement chromogène : dissoudre 1,5 % d’agar, 0,7 % d’extrait de peptone et levure, 1,29 % réactif sélective en H2O. Faire bouillir pendant 5 min, puis versez-la dans des plaques de 90 mm.
  5. Préparer la plaque de gélose nutritive : dissoudre 1 % de peptone, 0,3 % d’extrait de boeuf, chlorure de sodium 0,5 %, 1,5 % d’agar en H2O et ajuster le pH à 7,3. Puis l’autoclave à 121 ° C pendant 15 min et verser dans des plaques de 90 mm.
  6. Préparer la gélose de MacConkey (MAC) : dissoudre la peptone de 2 %, 1 % de lactose, chlorure de sodium 0,5 %, 0,5 % sels biliaires OX, 0,0025 % rouge neutre, 1,5 % d’agar, 0,0001 % cristal violet en H2O et ajuster le pH à 7,2. Puis l’autoclave à 115 ° C pendant 20 min et verser dans des plaques de 90 mm.

2. Real-time PCR

  1. Prélèvement d’échantillons
    1. Insérer un écouvillonnage rectal dans l’anus du patient 3-5 cm de profondeur et la tourner 360° autour.
    2. Mettre l’Écouvillonnage rectal dans un tube de prélèvement stérile. Marquer le code échantillon.
    3. Envoyer l’échantillon au laboratoire dès que possible.
      Remarque : Les échantillons pourraient être conservés à 4 ° C pendant pas plus de 24 h.
  2. Pré-enrichissement
    1. Ajouter 3 mL de bouillon nutritif dans chaque échantillon dans le tube de prélèvement.
    2. Incuber à 36 ° C pendant 6 h dans un incubateur.
  3. Exemple de mélange (en option)
    1. Collecter 100 µL de chaque culture de pré-enrichissement et mélanger les échantillons de 8-10 de 1 échantillon dans un tube de 1,5 mL s’il n’y a plus de 10 échantillons.
    2. Marquer correctement.
  4. Extraction d’ADN
    1. Centrifuger la culture de pré-enrichissement à 800 g pendant 2 min permettre les grosses particules se calment, et transfert le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant par aspiration.
    2. Ajouter 100 µL de solution d’extraction de l’ADN (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01 % Nonidet P 40 (NP40)) au culot. Vortex vigoureusement pendant 1 min.
    3. Faire bouillir à 100 ° C pendant 5 min sur un bain sec.
    4. Centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min. récupérer le surnageant à l’aide d’un nouveau tube, qui sera le modèle pour l’analyse postérieure de la PCR en temps réel.
  5. PCR en temps réel
    1. Configurer le mélange réactionnel comme suivre : pour chaque échantillon, ajoutez 12,5 µL de 2 x 5 µL du modèle tel qu’établi à l’étape 2.4.4, 0,2 µM de chaque sonde (séquences dans le tableau 1)27, 0,4 µM de chaque amorce, mélange réactionnel et utilisez FD2O pour ajouter jusqu'à 25 µL de total volume.
    2. Configurer le programme de cyclisme comme suit : 95 ° C pendant 3 min, suivie de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 34 s. signaux de fluorescents virés de 6-carboxy-fluorescéine (FAM) et les canaux Hexachlorofluorescein (HEX) à l’étape d’élongation (72 ° C) automatiquement par la machine PCR en temps réel fluorescente.
    3. Effectuer la PCR en temps réel sur une machine PCR en temps réel fluorescente, conformément aux instructions de l’instrument.
    4. Aller directement à l’étape 4 et publier des rapports négatifs en cas de résultats négatifs sur les canaux de FAM/HEX, ce qui signifie que les échantillons sont négatifs pour la Salmonella spp /Shigella spp.
    5. Passez à l’étape 3.1 ou 3.2 Si positif résultats surviennent sur des canaux de l’hexagone ou FAM, ce qui signifie que l’échantillon peut être positif pour Salmonella spp et/ou de Shigella spp., respectivement.
      Remarque : Si le mélange de l’échantillon a été effectuée à l’étape 2.3, puis PCR en temps réel sur des échantillons individuels qui compose l’un positif est souhaitable pour écarter l’échantillon réel positif.

3. guidée Culture

  1. Échantillon positif le PCR Salmonella spp.
    1. Culture dans un milieu sélective
      1. Ajouter 100 µL de la culture de pré-enrichissement dans 5 mL de milieu de sélénite Cystine dans un tube à essai. Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 h dans un incubateur.
    2. Culture sur plaque de séparation
      1. Récupérer une boucle de la culture avec une micro boucle et étalé sur une plaque de XLD ou chromogènes de gélose Salmonella . Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 heures dans un incubateur.
    3. Identification biochimique
      1. Sélectionnez colonies suspectes sur plaque de XLD (colonie rose avec/sans coeur sombre ; sombre colonie colonie jaune avec/sans coeur sombre) ou Salmonella chromogenic agar (colonie pourpre ou prunosus, lisse et rond) (Figure 2).
      2. Objet suspecte colonie pour identification biochimique sur le système automatisé d’identification microbienne, conformément aux instructions de l’instrument.
    4. Caractérisation sérologique
      1. O caractérisation de l’antigène
        1. Ajouter une goutte du sera antigène polyvalent O sur une lame propre.
        2. Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la mouture dans le sérum.
        3. Passez à l’étape de 3.1.4.1.4 si elle ressemble à couler sable, ce qui signifie que la colonie est réactive pour les sérums (Figure 3). Sinon, passez à l’étape 3.1.4.1.5.
        4. Sérums monovalents de l’antigène O permet de répéter les étapes 3.1.4.1.1 à 3.1.4.1.3 jusqu'à ce que l’antigène O spécifique est caractérisée.
        5. Sérums Vi permet de répéter les étapes 3.1.4.1.1 à 3.1.4.1.3. Recueillir ces colonies réactives de sérums de Vi dans un tube et faire bouillir à 100 ° C pendant 5 min dans un bain sec. Centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min. recueillir culot et répétez les étapes 3.1.4.1.1 à 3.1.4.1.4 jusqu'à ce que l’antigène O spécifique est caractérisée.
      2. Caractérisation de l’antigène de H
        1. Ajouter une goutte du sera antigène polyvalent H sur une lame propre.
        2. Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la mouture dans le sérum.
        3. Passez à l’étape de 3.1.4.2.4 si elle ressemble à couler sable, ce qui signifie que la colonie est réactive pour les sérums.
        4. Sérums monovalents de l’antigène H permet de répéter les étapes 3.1.4.2.1 à 3.1.4.2.3 jusqu'à ce que l’antigène H spécifique est caractérisée.
          NOTE : Parfois induction sérum peut être nécessaire pour caractériser l’antigène phase H deuxième. Dans l’affirmative, puis les étapes facultatives suivantes doivent être effectuées.
        5. (Facultatif) Ajouter une goutte de spécifique sera antigène de H sur gélose nutritive. Attendez que tous les sérums sont absorbés.
        6. (Facultatif) Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la propagation sur la plaque où spécifique sera antigène de H est absorbés. Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 heures dans un incubateur.
        7. (Facultatif) Sérums monovalents de l’antigène H permet de répéter les étapes 3.1.4.2.1 à 3.1.4.2.3 jusqu'à ce que la deuxième phase de l’antigène H est caractérisée.
        8. Passez à l’étape 4.
  2. Échantillon positif le PCR Shigella spp.
    1. Culture sur plaque de séparation
      1. Récupérer une boucle de la culture de pré-enrichissement avec une micro boucle et étalé sur une plaque de XLD ou plaque de MAC. Incuber à 36 ° C pendant 18 à 24 h dans un incubateur.
    2. Identification biochimique
      1. Recueillir des colonies suspectes sur plaque de XLD (lisse, rond, colonie transparente et rouge) ou MAC (lisse, rond, colonie transparente et incolore avec 2-3 mm de diamètre ; Shigella sonnei peut être plus grand et se tournent vers la lumière rose comme l’allongement de la durée d’incubation) (Figure 4).
      2. Objet suspecte colonie pour identification biochimique sur le système automatisé d’identification microbienne, conformément aux instructions de l’instrument.
    3. Caractérisation sérologique
      1. Ajouter une goutte des sérums polyvalents de Shigella spp sur une lame propre.
      2. Recueillir une boucle de la colonie avec une micro boucle et la mouture dans le sérum.
      3. Passez à l’étape 3.2.3.4 si elle ressemble à couler sable, ce qui signifie que la colonie est réactive pour les sérums.
      4. Sérums monovalents de Shigella spp. permet de répéter les étapes 3.2.3.1 à 3.2.3.3 jusqu'à ce que des Shigella spp est caractérisée.
      5. Passez à l’étape 4.

4. rapport

  1. Présenter des rapports positifs ou négatifs selon les résultats ci-dessus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le protocole a été appliqué pour le dépistage des espèces de Salmonella ouShigella spp tabouret anal échantillons de personnes qui traiterait de nourriture et eau.

Dans l’étape PCR en temps réel, comme illustré à la Figure 5A, il y avait une amplification réussie en canal HEX, ce qui signifie que l’échantillon mélangé est positif pour Salmonella spp. Puis une PCR en temps réel le plus a été réalisée sur des échantillons individuels qui compose l’un positif. Comme le montre la Figure 5B, exemple 2 a été positive. Par conséquent, échantillon 2 a été choisi pour le culture guidée de Salmonella spp. Figure 5C, il y avait une amplification réussie dans le canal FAM, ce qui signifie que l’échantillon mélangé est positive pour les Shigella spp. Puis une PCR en temps réel le plus a été réalisée et échantillon 10 s’est avéré positif (Figure 5D). Par conséquent, échantillon 10 a été choisie pour la culture guidée des Shigella spp.

Dans la culture guidée de Salmonella spp., il y avait des colonies roses et pourpre sur plaque XLD et chromogénique gélose Salmonella , séparément, comme illustré à la Figure 2. Puis, ces colonies ont été soumis à une identification biochimique sur le système automatisé d’identification microbienne. Les résultats ont montré qu’il s’agissait de Salmonella spp., avec des espèces inconnues. Par conséquent, caractérisation sérologique a été réalisée (Figure 3) et il réagissait au O4, O12, Hb, H1, 2. Selon le schéma de Kauffmann-White-Le mineur, échantillon 2 a enfin signalé comme positif pour Salmonella paratyphi B. Tandis que pour la culture guidée des Shigella spp., il y avait des colonies rouges et incolores roses sur plaque XLD et plaque de MAC, séparément, comme illustré à la Figure 4. Ensuite, ces colonies ont également été soumis à une identification biochimique sur le système automatisé d’identification microbienne. Les résultats ont montré qu’il s’agissait de Shigella sonnei. Pour confirmer son sérotype spécifique, caractérisation sérologique a été réalisée (Figure 3) et il est réactif à sonnei phase II. Par conséquent, échantillon 10 a enfin signalé comme positif pour la phase de Shigella sonnei II.

Figure 1
Figure 1 : Le schéma du protocole. Deux avancées majeures ont été montrées et séparées par une ligne pointillée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs de la culture de Salmonella spp sur tôles de XLD et Salmonella chromogenic agar. Sur plaque XLD, il y avait des colonies roses avec/sans cœur sombre, lors d’un chromogène gélose Salmonella , il y avait des colonies pourpres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultat de la caractérisation sérologique représentatif. Si la colonie a été réactive pour les sérums, il ressemblait à couler sable (à gauche). Sinon, c’est trouble (droit). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs de la culture de Shigella spp sur tôles de XLD et MAC. Plaque de XLD, il y avait des colonies rouges, tandis que sur la plaque de MAC, il y avait des colonies transparentes et incolores. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats PCR en temps réel représentatifs. (A), HEX canal pour les échantillons de mélange. (B), HEX canal pour des échantillons individuels. (C), à la FAM canal pour les échantillons de mélange. (D), à la FAM canal pour des échantillons individuels. PC : contrôle positif. NC : contrôle négatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Agent pathogène Nom Sequence(5'-3')
Salmonella SAL-F
SAL-R
SAL-sonde		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse
Shigella Shi-F
Shi-R
Shi-sonde		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse

Tableau 1 : amorces et sondes utilisées. Le nom et les séquences des amorces et des sondes ont été fournis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Depuis Salmonella spp /Shigella spp. sont souvent associés aux intoxications alimentaires et transmission fécale-orale de la gastro-entérite aiguë28,29 , et la méthode de routine est beaucoup de travail ou de longue durée 7, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la Salmonella spp / le dépistageShigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.

Il y a plusieurs étapes nécessitant un examen afin de maximiser la capacité de cette plate-forme. Le premier est l’étape de pré-enrichissement des échantillons dans le bouillon nutritif (étape 2.2). Bien qu’aucune étape de pré-enrichissement n’est nécessaire pour les échantillons de selles prélevés dans les patients présentant des symptômes évidents, tels que diarrhée, etc., une étape de pré-enrichissement générales 6 h est toujours nécessaire pour les échantillons d’Écouvillonnage rectal, lorsque recueillies pendant les préalables à l’emploi examen physique pour les personnes qui gérerait la nourriture et eau, car ces gens étaient principalement des adultes en bonne santé ou asymptomatiques au moins. Si le protocole a été appliqué seulement pour la détection de Salmonella spp., pré-enrichissement pourrait être effectué dans un milieu Selenite Cystine afin d’augmenter la sensibilité. La deuxième étape critique est l’identification des colonies suspectes (étape 3.1.3.1 et 3.2.2.1). Il y a nombreux interférents flore de fond dans les échantillons de selles qui peuvent masquer la détection et l’isolement de cible pathogènes30. Par conséquent, la caractéristique des colonies suspectes comme défini à l’étape 3.1.3.1 et 3.2.2.1 devrait garder à l’esprit pendant l’expérience. La troisième étape critique est la caractérisation sérologique de Salmonella spp. Une majorité de Salmonella spp., contenant une seconde phase de l’antigène H31, induction de sérum doit être effectuée. Cependant, on ne réussite pas toujours de l’induction de sérum, et plusieurs séries d’induction peuvent être nécessaire pour déterminer la bonne deuxième phase H.

Le protocole est très spécifique et sensible, tel que vérifié par notre précédente étude27. La grande spécificité du protocole témoigne de sa capacité, dans laquelle Salmonella spp /Shigella spp pouvaient être distinguées des autres agents pathogènes apparentés27. La limite inférieure de détection du protocole est 104 UFC/mL et 103 UFC/mL pour la Salmonella spp., Shigella spp., respectivement27, qui sont comparables aux précédents rapports7,32 , 33 , 34. comme nous avons indiqué ci-dessus, la sensibilité de la détection de Salmonella spp. pourrait augmenter de pré-enrichissement Selenite Cystine si le protocole a été appliqué seulement pour la détection de Salmonella spp. En outre, le protocole pourrait augmenter le taux de positivité de deux plis et diminuer la charge de travail/médiane délais considérablement27.

Similaire aux autres déterminations TAAN, une limitation majeure du protocole, par rapport à la méthode de culture des bactéries classiques, est que le protocole pourrait identifier seulement Salmonella spp /Shigella spp., tandis que les autres bactéries causant des diarrhées courantes sont omis de7. En revanche, au cours de la culture de bactéries classiques, ces bactéries pourraient être identifiés en parallèle si elles existaient. Une autre limitation du protocole est que certains des Salmonella spp /Shigella spp n’a pas pu être identifié par la PCR en temps réel en raison de variations de séquence27. Toutefois, si des résultats négatifs de PCR en temps réel s’affiche pour les échantillons provenant de patients présentant des symptômes cliniques évidents, techniciens de laboratoire devraient prêter attention et peuvent procéder à d’autres expériences pour confirmer les résultats. Au cours d’une flambée importante, nous pouvons utiliser un seul échantillon au lieu des pools d’échantillons pour le premier tour du dépistage de la PCR.

En conclusion, le protocole fourni ici pourrait servir d’une plate-forme utile pour le dépistage de Salmonella spp /Shigella spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Science et technologie Programme de Zhuhai, Chine (subvention numéro 20171009E030064), la Science et technologie Programme de Guangdong, Chine (subvention numéro 2015A020211004) et la Science et technologie Programme de l’Administration générale de la Supervision de la qualité, Inspection et la quarantaine de la République populaire de Chine (numéro grant 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

Immunologie et Infection numéro 141 une gastro-entérite aiguë, Salmonella spp. Shigella spp. dépistage PCR en temps réel guidé de la culture
Une plate-forme haut débit pour la détection de <em>Salmonella</em> spp /<em>Shigella</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter