Summary
Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.
Abstract
Orientação de intestino de células do sistema imunológico é importante para a patogênese de doenças inflamatória intestinal (IBD). Aderência de célula dependente de integrinas para addressins é um passo crucial neste processo e interferir com a adesão de estratégias terapêuticas foram estabelecidas com sucesso. O anticorpo anti-α4β7 de integrina, vedolizumab, é usado para o tratamento clínico da doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC) e mais compostos são propensos a seguir.
Os detalhes do processo de adesão e os mecanismos de ação dos anticorpos anti-integrina não são ainda claras em muitos aspectos, devido às limitadas técnicas disponíveis para a pesquisa funcional neste campo.
Aqui, apresentamos um ensaio dinâmico de adesão para a análise funcional da aderência de célula humana sob condições de fluxo e o impacto das terapias anti-integrina no contexto do IBD. Ele se baseia a perfusão de células humanas primárias através de capilares de vidro ultrafinos morada revestido com análise microscópica em tempo real. O ensaio oferece uma variedade de oportunidades de melhorias e modificações e detém potenciais para descobertas mecanicistas e aplicações translacionais.
Introduction
Movimento de célula é um processo bem regulamentada área indispensável para o desenvolvimento e a função dos organismos multicelulares, mas também está implicado na patogênese de uma infinidade de doenças1. Recentemente, o processo de localização de células do sistema imunológico do fluxo de sangue para os tecidos periféricos ganhou a atenção crescente, uma vez que contribui para a reposição e expansão de células patogênicas em tecidos inflamados em doenças imunologicamente mediadas2 ,3. Em particular, homing foi mostrado para ter relevância translacional em doenças inflamatória intestinal (IBD). A terapêutica anti-α4β7 integrina anticorpo vedolizumab interferir com orientação de intestino tem demonstrado eficácia em ensaios clínicos grande4,5 e tem sido utilizado com sucesso na prática clínica do mundo real6,7 , 8. outras compostos são propensos a seguir9,10. Da mesma forma, o anticorpo de integrina terapêutica anti-α4, natalizumab, é usado para o tratamento da esclerose múltipla (em)11.
No entanto, nossa compreensão funcional do processo de sinalização em geral e o mecanismo de ação de tais anticorpos terapêuticos em particular ainda é limitada. Está bem estabelecido que a orientação consiste de várias etapas, incluindo a célula tethering e rolando com aderência de célula subsequente levando a prisão firme, seguido por trans endoteliais migração12,13. Os anticorpos acima mencionados neutralizam integrinas na superfície das células, impedindo a interação com addressins no endotélio da parede do vaso. Isto é pensado para impedir a aderência de célula firme14,15. Ainda, estamos apenas começando a entender a relevância diferencial das integrinas específicas para orientação de célula de subconjuntos distintos de célula. Além disso, os efeitos dos anticorpos anti-integrina em diferentes subconjuntos de células e associações de dose-resposta são em grande parte desconhecidas, levando a muitas questões no campo das terapias de localizador e antiaderência de intestino no IBD.
Portanto, ferramentas convenientes para abordar tais questões são desesperadamente necessários. O efeito dos anticorpos anti-integrina na interação integrina-morada predominantemente até agora tem sido avaliado por avaliar a inibição da eficácia/vinculação vinculação com citometria de fluxo ou através de de16,de ensaios de adesão estática17 ,19,18,20, assim, com a aparente simplificação e desvio da situação fisiológica. Recentemente estabelecemos um ensaio de adesão dinâmico para estudar dependente de integrinas adesão de células humanas para addressins e os efeitos dos anticorpos anti-integrina sob tensão de cisalhamento2. O princípio da técnica anteriormente foi demonstrado com rato células21,22. Aqui, foi adaptado e desenvolvido para abordar as questões acima mencionadas translacionais, abertura de avenidas romance para melhor compreender os mecanismos da terapia com anti-integrina anticorpos na vivo.
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Protocol
Os estudos descritos nas seções a seguir foram realizados de acordo com a aprovação do Comitê de ética da Universidade Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg.
1. preparação dos capilares
- Conecte retangulares capilares para o tubo de borracha esticando a tubagem de um lado com uma pequena tesoura e cuidadosamente, inserindo o capilar (cerca de 0,5 cm) no tubo. Feche a conexão entre o capilar e tubo com filme plástico de parafina.
- Revestir o capilar com 20 µ l de morada (recombinante Quimera Fc; 5 µ g/mL, morada, por exemplo, MAdCAM-1, no buffer de revestimento (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) ou a solução de controle do isotipo apropriado usando uma pipeta de p20 (fluido irá mergulhar em si do capilar). Em seguida, selar o lado não conectado para o tubo com o filme plástico da parafina e incubar durante pelo menos 1 h a 37 ° C. Use um capilar preenchido apenas com o buffer de revestimento ou com o controle adequado do isotipo como controlo negativo.
- Retire a película de plástico da parafina da ponta do capilar, esvazie o revestimento, deixando o banho líquido fora do capilar em um papel toalha e bloquear os capilares pelo menos 1 h com 20 µ l de bloqueio solução (1X PBS com 5% BSA) a 37 ° C. Feche o lado aberto do capilar com filme plástico de parafina. Não remova a solução de bloqueio antes de prosseguir para microscopia.
2. cela de isolamento, tratamento e preparação para a microscopia
Nota: Estas etapas podem ser executadas durante a incubação os períodos necessários para a preparação capilar.
- Recolher 18 mL de sangue total humano anticoagulados com uma coleção de sangue asséptico da Veia cubital do voluntariado de pessoas (por exemplo, os pacientes de DII e/ou controles saudáveis) após consentimento informado de acordo com os regulamentos do local Comitê de ética.
Nota: Este passo só deve ser realizado por pessoal médico treinado e experiente, de acordo com normas nacionais e/ou locais. - Encher o sangue em um tubo de 50 mL e diluir para um volume de 35 mL com PBS 1x. Então subjacência da mistura de sangue-PBS com 10 mL de meio de gradiente de densidade.
- Realize a centrifugação gradiente de densidade por 15 min a 800 x g e 24 ° C sem freio para celas separadas.
- Colete as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) aspirando a camada de células brancas em cima da camada média densidade de gradiente (camada clara média). PBMC de transferência em um tubo 50 mL, enchem a 50 mL de 1X PBS e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g e 10 ° C.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de 1X PBS posteriormente contar números de telemóvel, por exemplo, usando uma célula de Neubauer, contando com a câmara.
- Opcional: Para estudar a aderência dos granulócitos executar o procedimento a seguir. Caso contrário, prossiga com a etapa 2.7 ou 2.8.
- Recolha a camada de colônias de granulócitos (bottommost camada após centrifugação gradiente de densidade que contém também as hemácias). Ressuspender as células em 40 mL de 1X PBS. Em seguida, adicionar 8 mL de 6% Dextran em PBS 1x, misture delicadamente e deixe o sedimento de células durante 30 min à temperatura ambiente.
Nota: As hemácias vão afundar até o fundo do tubo, enquanto os granulócitos vão ficar em suspensão. - Depois de 30 min, recolher o sobrenadante, transferir para um tubo de 50ml fresco e centrifugar para 6 min a 300 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e lisar as hemácias restantes pela adição de 5 mL de 0,2% NaCl em ddH2O. Incubar durante 1 min.
- Adicionar 5 mL de 1,4% NaCl em ddH2O e incube por mais um minuto. Pare a Lise hipotónica adicionando 20 mL de 1X PBS e centrifugar para 6 min a 300 x g e 4 ° C.
- Ressuspender as células em 10 mL de 1X PBS. Em seguida, conte números de celular usando uma célula de Neubauer, contando com a câmara.
- Recolha a camada de colônias de granulócitos (bottommost camada após centrifugação gradiente de densidade que contém também as hemácias). Ressuspender as células em 40 mL de 1X PBS. Em seguida, adicionar 8 mL de 6% Dextran em PBS 1x, misture delicadamente e deixe o sedimento de células durante 30 min à temperatura ambiente.
- Opcional: Para estudar a aderência dos subconjuntos PBMC, purificar diferentes tipos de células ou subconjuntos (por exemplo, CD4+ e CD8+ T células ou CD19+ B células) usando microbeads de acordo com o protocolo do fabricante ou por fluorescência-ativado célula de triagem (FACS). Caso contrário, prossiga com a etapa 2.8.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 300 x g e 10 ° C. Desprezar o sobrenadante e mancha as células com celular rastreamento corante (por exemplo, CFSE) de acordo com as instruções do fabricante.
- Posteriormente, Centrifugar as células durante 10 minutos a 300 x ge descartar o sobrenadante. Resuspenda em 1X PBS, determinar o número de telemóvel e centrifugar novamente por 10 min a 300 x g.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o células manchadas em quantidade adequada de buffer de adesão (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obter uma suspensão de 1,5 x 106 células/mL. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de MnCl2 para obter uma concentração final de 1 mM a 100 mM.
Nota: Estas células estão agora prontas para microscopia. - Opcional: Tratar as células com citocinas, neutralizando anticorpos ou outros compostos. Caso contrário, proceda com o passo 3.
- Pular a etapa 2.10 e resuspenda o pellet de células coradas da etapa 2.9 em meio RPMI (com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina) para obter uma concentração de 1,5 x 106 células/mL.
- Pipete 1 mL da suspensão celular para tantos poços de uma placa de 48-bem como há condições para ser analisado. Sempre prepare um poço com células não tratadas para ser perfundidos através de um capilar não revestido como controle negativo e um poço com células não tratadas para ser perfundidos através de um capilar morada revestido como controle positivo.
- Para o tratamento com anticorpos anti-integrina, adicione a quantidade apropriada de anticorpo (por exemplo, 10 µ g/mL vedolizumab) para a suspensão de eritrócitos. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Para tratamento com citocinas, adicione a quantidade apropriada de citocinas recombinantes (por exemplo, 10 ng/mL CXCL10) para a suspensão de eritrócitos. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
- Após a incubação, colha células por resuspending células várias vezes usando uma pipeta p1000. Transferência de células para um tubo de 2 mL, lave bem novamente com 1 mL de 1X PBS e adicionar ao tubo de 2 mL. Determine o número de células.
Nota: Incubação de populações de células aderentes (por exemplo, monócitos) pode exigir medidas adicionais (ex., tratamento com tripsina) para separar as células da placa.
- Células de centrifugar durante 10 minutos a 300 x g a 10 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em quantidade adequada de buffer de adesão para obter uma suspensão de 1,5 x 106 células/mL. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de MnCl2 para obter uma concentração final de 1 mM a 100 mM. Quando pretreating com quimiocinas não adicione MnCl2 à suspensão de células. Estas células estão agora prontas para microscopia.
Nota: O volume mínimo utilizado para o ensaio é dependente da bomba e a tubulação usada. Neste estudo, utilizando a bomba peristáltica e o tubo especificado na Tabela de materiais, foi necessário um volume mínimo de 400 µ l. Se desejado e aplicável (dependendo do tipo de célula e rendimento), a concentração de células em suspensão pode ser aumentada para medir a aderência superior em um período mais curto de tempo. - Modificação de potencial: ensaio de adesão dinâmica competitiva
- Execute as etapas supracitadas, com populações de células diferentes para ser comparado com os outros (por exemplo, regulamentar e células efetoras T isoladas por meio de isolamento magnético do grânulo, seguindo as instruções do fabricante como por passo 2.7).
- Mancha de cada população com um corante diferente (por exemplo, CFSE e FarRed) como descrito nos passos 2,8-2,9 para ser capaz de diferenciar populações de células durante a microscopia.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de células coradas em quantidade adequada de buffer de adesão (150 mM NaCl 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obter uma suspensão de 1,5 x 106 células/mL.
- Misturar volumes iguais das suspensões celulares (por exemplo, 500 µ l de pilhas de T reguladoras) e 500 µ l de células efetoras T obter um final misturado a concentração celular de 1,5 x 106 células/mL. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de MnCl2 para obter uma concentração final de 1 mM a 100 mM. Tais suspensões subsequentemente podem ser usadas para análise competitiva do processo de adesão por perfusing populações de células diferentes através do mesmo capilar.
3. imagem latente da pilha de adesão dinâmica ao vivo
- Ligue o microscópio e selecione o filtro apropriado ou laser para excitar a célula dye(s) (por exemplo, 488 nm laser para CFSE), um objectivo adequado (por exemplo, 40 X) e imagens de lapso de tempo permitindo uma aquisição modo de rastreamento.
- Retire a película de plástico da parafina da ponta do capilar e conectar o capilar com um pedaço curto de tubo (aproximadamente 5 cm de comprimento), estendendo-se a tubagem de um lado com uma pequena tesoura e cuidadosamente inserindo o capilar (cerca de 0,5 cm) dentro do tubo. Feche a conexão entre o capilar e o tubo com o filme plástico de parafina.
- Montar o capilar em uma bandeja de fixação (por exemplo, a tampa de uma placa com um corta-circuito retangular ligeiramente menor do que o comprimento do capilar de 6) e coloque o capilar fixo no suporte da bandeja do microscópio, para que o capilar em foco e pronto para a microscopia.
- Insira o tubo de borracha no entalhe correspondente da bomba peristáltica e coloque a extremidade não anexada para o capilar no tubo de amostra de acordo com contendo a suspensão de eritrócitos. Inserir um tubo de 15 mL para coletar o fluxo através do tubo curto do outro lado do capilar.
- Deixe-o preenchimento da tubulação com uma vazão de 500 µ l por minuto até a suspensão de células quase atinge o capilar. Então deixe o preenchimento capilar com um caudal de 100 µ l/min.
Nota: Um rápido enchimento do capilar assegura uma distribuição regular da suspensão celular dentro do capilar. - Quando o capilar é preenchido com a suspensão de eritrócitos, ajuste a taxa de fluxo de 10 µ l/min.
Nota: Estas taxas de fluxo podem variar, quando os capilares de um tamanho diferente ou diferentes bombas peristálticas são usados. Neste estudo, a taxa de fluxo de 10 µ l/min foi otimizada para a bomba e capilares para imitar o fluxo de sangue na vivo . - Capturar imagens de lapso de tempo das células movendo-se lentamente através do capilar ao longo da morada revestido no interior da parede cada 2 s para um total de 3 min.
Nota: Intervalos e tempo total podem variar dependendo do tipo de célula e pergunta a ser dirigida. - Antes de eliminar o capilar, tela inteiro capilar através da peça de olho do microscópio para certificar-se que a seção mostrada no vídeo é representante. Se necessário, fazer uma segunda gravação.
- Livre da tubulação da bomba e deixe o líquido restante correr de volta para o tubo de 2 mL, em seguida, desligue o capilar e tubos da bandeja de fixação e continuar com o próxima capilar.
4. a avaliação e contagem de células
- Abra a sequência lapso de tempo com o software adequado e exportar as três primeiras imagens ("início") e as três últimas imagens ("End") como arquivos Tiff.
- Abra as três imagens de "Começo" no ImageJ, converter para 32 bits ('imagem | Tipo | 32 bits ') e Mesclar fotos (' imagem | Cor | Mesclagem de canais; Atribua as cores vermelhas, verdes e azuis para as fotos diferentes). Converter imagem composta em RGB (' imagem | Type-RGB') e salve como um arquivo Tiff. Repita com as imagens de "Fim".
Nota: Em ensaios de aderência dinâmica competitiva com células coradas com cores diferentes, primeiro dividi os canais das imagens para analisar a adesão das populações celulares diferentes separadamente. - Contar as células brancas visíveis no "Início" e "End" composto e subtrair o número de células brancas no "Princípio" de células brancas no "Final".
Nota: A diferença representa o número de recém aderindo células no intervalo de tempo de 3 min. Na imagem composta, células que moveu são visíveis na cor específica que foi atribuído ao respectivo quadro, desde que eles localizar em outro lugar no quadro anterior e seguinte. Para as células que são aderentes, os sinais de vermelhos, verdes e azuis na mesma sobreposição lugar ao branco. - Para visualizar melhor os resultados, compile um vídeo das sequências de lapso de tempo, por exemplo, usando o ImageJ.
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Representative Results
O método apresentado neste manuscrito visa simular o processo in vivo da aderência de célula humana à parede endotelial quanto possível para funcionalmente avaliar aderência de célula e o papel dos anticorpos interferentes. Portanto, capilares ultrafinos são revestidos com addressins e pintados com fluorescente etiquetadas células humanas de interesse usando uma bomba de perfusão. Usando a célula viva, a adesão de células humanas para a addressins de imagem pode ser observado em tempo real (Figura 1).
Este método é particularmente adequado para elucidar os mecanismos de terapias antiaderência em IBD. Como mostrado na Figura 2A, perfusão de capilares recobertos de ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 e Quimera Isotype Fc com PBMC humano leva à adesão marcado, quando um dos três addressins está presente. Em contraste, a adesão aos capilares isotipo-revestido é mínima. Inibição da integrina-morada interações usando anticorpos neutralizantes normalmente leva a uma diminuição acentuada de adesão dinâmico que está ausente, quando anticorpos do isotipo controle são adicionados (modo representativo ilustrado na Figura 2B, em pool dados quantitativos na Figura 2).
Da mesma forma, o impacto de quimiocinas na modulação de integrina-afinidade pode ser investigado neste sistema de pré-incubação com tal de peptídeos em vitro. Como mostrado por dados representativos na Figura 3, tratamento de CD4+ células T humanas com CCL2 ou CXCL10 leva a maior adesão ao MAdCAM-1, em comparação com as células humanas não tratadas.
Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho. Preparação de morada revestido ultrafinos capilares e células humanas fluorescente etiquetadas (à esquerda) é seguido de perfusão de células através do capilar usando uma bomba peristáltica (médio) e microscopia de lapso de tempo (à direita). Modificado com a permissão de referência23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: adesão dinâmico de periférico humano sangue células mononucleares (PBMC) de doadores de controle para diferentes addressins. (A) número de recém aderindo PBMCs aos capilares revestidos com addressins específica ou com Fc isotipo controle (n = 6). (B) imagens representativas de adesão dinâmico no ICAM-1 revestido capilares perfundidos com não tratadas PBMCs (NT) ou células incubadas com anticorpo de anti-CD18 10 µ g/mL ou 10 µ g/mL de controlo do isotipo IgG. Início: Fundiu três primeiras imagens da sequência de 3 min; Final: Fundiu três últimas imagens da sequência de 3 min; células aderente são retratadas branco. Seus números, bem como a diferença (i.e., células recém aderente) é indicada. Barra de escala = 100 µm. (C) impacto de anticorpos anti-integrina (cada um usado em uma concentração de 10 µ g/mL) na adesão dinâmico. Esquerda: O número de recém células aderindo aos capilares recobertos de ICAM-1 e pintadas com não-tratada, anti-CD18-tratados ou IgG do isotipo controle-Tratado de células; Médio: Número de recém células aderindo aos capilares revestidos com VCAM-1 e pintadas com não-tratada, tratados com natalizumab ou IgG do isotipo controle-Tratado de células; Direita: Número de recém células aderindo aos capilares revestidos com MAdCAM-1 e pintadas com não tratada, tratada com vedolizumab ou IgG do isotipo controle-Tratado células (n = 5 – 6). As barras indicam meios com erro padrão da média (SEM). Foram realizados testes estatísticos com One-Way ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Newman-Keuls (* p < 0,05; * * p < 0,01). Modificado com a permissão de referência23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Adesão mediada por Chemokine dinâmico de CD4 humano+ T células de MAdCAM-1. Imagens de uma adesão dinâmica representante do ensaio em MAdCAM-1-revestido capilares perfundidos com não tratada (NT) CD4+ T células ou células incubadas com 10 ng/mL rhCXCL10 ou com 100 ng/mL rhCCL2. Início: Fundiu três primeiras imagens da sequência de 3 min; Final: Fundiu três últimas imagens da sequência de 3 min; células aderente são retratadas branco. Seus números, bem como a diferença (i.e., células recém aderente) é indicada. Barra de escala = 100 µm. pré-incubação com quimiocinas conduz ao aumento adesão dinâmico, presumivelmente devido à modulação de integrina-afinidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
SupplementaryVideos: filmes de três minutos de sequências de imagem de MAdCAM-1 revestido capilares perfundidos com fluorescente etiquetadas PBMCs. (A) capilar perfundido com células não tratadas. (B) capilar perfundido com células tratadas com 10 µ g/mL vedolizumab. (C) capilar perfundido com células tratadas com 10 controle de isotipo IgG humano µ g/mL. Fluxo de célula de baixo para cima, aderindo recentemente células são indicadas pelas setas brancas. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O protocolo acima descreve uma técnica útil para estudar a dinâmica adesão das células do sistema imunológico humanas para ligantes endoteliais. Através da variação dos ligantes revestidos, tipos de células perfundidos ou subconjuntos, incubação com estímulos adicionais ou diferentes anticorpos neutralizantes, que tem quase ilimitada de aplicações potenciais. Portanto, tais ensaios dinâmicos de adesão podem ser útil para responder a ambas as questões fundamentais da pesquisa básica, bem como consultas de translação que podem ajudar a desenvolver e otimizar a terapia clínica com drogas, interferindo com o processo de adesão.
Recentemente foi demonstrado, o utilitário do ensaio para investigar os efeitos da clínicas terapias antiaderência. Além disso, populações de diferentes células expressando diferentes tipos e quantidades de integrinas mostram níveis consistentes de adesão dinâmico para os respectivos addressins, apoiando a validade do ensaio23.
Em geral, a conclusão do protocolo precisa de cerca de 6 horas de trabalho e apresenta desafios técnicos intermédios. Depois começou o revestimento do capilar, uma questão crítica é para evitar a desidratação. Isto requer precisa selagem durante as etapas de incubação e cuidado com os vasos capilares, quando troca de soluções. Além disso, o início do processo de perfusão exige alguma cautela. Devido ao volume morto do tubo, não é viável para encher o tubo inteiro com a taxa de fluxo de perfusão final. Por outro lado, muda a taxa de fluxo após lavagem capilar com alta velocidade implica o risco de interrupção de fluxo, levando à possibilidade de adesão estática, limitando a validade em relação à adesão dinâmico. Portanto, um oportuno interruptor para a taxa de fluxo final é essencial. A taxa de fluxo final deve ser escolhida depende do tamanho da bomba, tubulação e capilar usado. Para imitar o fluxo de sangue humano em vênulas endoteliais altas como quanto possível, um fluxo de volume de 0,1 a 5 mm/s é recomendado24,25.
A dificuldade do ensaio pode aumentar consideravelmente, quando as modificações são aplicadas. Por exemplo, análise de subconjuntos de célula T específica pode exigir exigindo estratégias de polarização ou purificação26. Também, incluindo as etapas de localização de tethering, rolamento e célula de ativação12 para o experimento continuem a aumentar a dificuldade, uma vez que pode ser necessário revestir uma combinação de ligantes para dentro dos capilares ou deleite (pré-) o perfundidos população celular com quimio - ou citocinas para contabilizar dependente selectina rolando e celular induzida por chemokine afinidade modulação da ativação e integrina27. No entanto, estes podem ser particularmente interessantes questões para futuras pesquisas, especialmente como a técnica apresentada permite abordar funcionalmente uma interação sofisticada de moléculas diferentes com células humanas e ligantes. Como mencionado acima, analisando competitivamente adesão dinâmico de várias populações de células coradas diferentemente no mesmo capilar pode adicionar um outro nível de complexidade. Além disso, também foi demonstrado que as células endoteliais podem ser usadas em sistemas fluídico em vez de recombinantes ligantes28.
Embora seja um ensaio funcional, a técnica é limitada pela redução de redes complexas em vivo para um conjunto selecionado de moléculas envolvidas em vitro. Isto significa que os efeitos de factores adicionais desconhecidos ou inesperadas podem ser ignorados ou não suficientemente considerados. No entanto, este é um problema frequente na investigação humana, porque as considerações éticas frequentemente proíbem mecanicista na vivo investigações29.
Tomados em conjunto, este protocolo apresenta um ensaio funcional para a análise da dinâmicas terapias de adesão e anti-integrina integrina-dependente em doenças inflamatórias intestinais. Enquanto o princípio básico é bastante simples e direta e não muito difícil de executar, ele pode ser embelezado e modificado em vários aspectos e tem o potencial para responder perguntas translacionais sobre terapia antiaderência no IBD.
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Disclosures
M.F.N. serviu como um conselheiro para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. M.F.N. e S.Z. receberam apoio à pesquisa de Takeda e Roche.
Acknowledgments
A pesquisa de CN, IA, MFN e SZ foi apoiada pelo centro interdisciplinar para pesquisa clínica (IZKF) e o programa ELAN da Universidade de Erlangen-Nuremberga, a outra Kröner-Fresenius-Stiftung, o Fritz-Bender-Stiftung, o alemão de Crohn e Colite Foundation (DCCV), a CEDER de grupo investigação clínica do Conselho alemão de pesquisa (DFG), DFG tópico programa de Microbiota, a iniciativa de campo emergente e a DFG Collaborative Research centros 643, 796 e 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
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