Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

टिक अगली पीढ़ी 16S rRNA Amplicon अनुक्रमण द्वारा Microbiome लक्षण वर्णन

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/58239
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, San Francisco State University

Summary

यहाँ हम 16S rRNA sequencing जो पहचान और वैक्टर के भीतर माइक्रोबियल समुदायों के लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है के लिए एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि डीएनए निष्कर्षण, प्रवर्धन और पीसीआर के माध्यम से नमूनों की barcoding, एक प्रवाह-सेल पर अनुक्रमण, और वंशावली जानकारी के लिए अनुक्रम डेटा से मेल करने के लिए bioinformatics शामिल है ।

Abstract

हाल के दशकों में, वेक्टर जनित रोगों फिर से उभरा है और खतरनाक दरों पर विस्तार किया है, काफी रुग्णता और दुनिया भर में मृत्यु के कारण । प्रभावी और व्यापक रूप से उपलब्ध टीकों इन रोगों के बहुमत के लिए कमी कर रहे हैं, उपंयास रोग शमन रणनीतियों के विकास necessitating । इस अंत करने के लिए, रोग नियंत्रण के एक होनहार एवेंयू वेक्टर microbiome लक्ष्यीकरण शामिल है, रोगाणुओं के समुदाय वेक्टर का निवास । वेक्टर microbiome रोगज़नक़ गतिशीलता में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, और microbiome के जोड़तोड़ वेक्टर जनित रोगों के एक मुट्ठी भर के लिए कम वेक्टर बहुतायत या रोगज़नक़ संचरण के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि, रोग नियंत्रण अनुप्रयोगों में इन निष्कर्षों का अनुवाद वेक्टर माइक्रोबियल पारिस्थितिकी की एक पूरी तरह से समझ की आवश्यकता है, ऐतिहासिक इस क्षेत्र में अपर्याप्त प्रौद्योगिकी द्वारा सीमित । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के आगमन तेजी से सक्षम है, विविध माइक्रोबियल समुदायों के अत्यधिक समानांतर अनुक्रमण । लक्ष्यीकरण अत्यधिक-संरक्षित 16S rRNA जीन अलग पारिस्थितिकी और प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत वैक्टर के भीतर मौजूद रोगाणुओं के characterizations की सुविधा है । इस तकनीक 16S rRNA जीन का प्रवर्धन, पीसीआर के माध्यम से barcoding नमूना शामिल है, अनुक्रमण के लिए एक प्रवाह सेल पर नमूने लोड हो रहा है, और bioinformatics दृष्टिकोण वंशावली जानकारी के साथ अनुक्रम डेटा मैच के लिए । एक उच्च संख्या के लिए प्रजातियों या जीनस-स्तर की पहचान आमतौर पर इस दृष्टिकोण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार पारंपरिक संवर्धन, माइक्रोस्कोप, या ऊतकवैज्ञानिक धुंधला से कम पता लगाने, संकल्प, और उत्पादन की चुनौतियों को दरकिनार तकनीक. इसलिए, इस विधि निस्र्पक वेक्टर रोगाणुओं के लिए विभिंन स्थितियों के तहत अच्छी तरह से अनुकूल है, लेकिन वर्तमान में माइक्रोबियल समारोह के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकते, वेक्टर के भीतर स्थान, या एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिक्रिया । कुल मिलाकर, 16S अगली पीढ़ी के अनुक्रमण बेहतर पहचान और रोग गतिशीलता में वेक्टर रोगाणुओं की भूमिका को समझने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है ।

Introduction

हाल के दशकों में वेक्टर जनित रोगों का पुनरुत्थान और प्रसार वैश्विक मानव और वन्यजीव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करता है । प्रभावी टीके इन रोगों के बहुमत के लिए कमी कर रहे हैं, और नियंत्रण के प्रयासों वैक्टर और वेक्टर-मेजबान बातचीत के जटिल जैविक प्रकृति द्वारा रुकावट हैं । रोगज़नक़ संचरण में एक सदिश के भीतर माइक्रोबियल बातचीत की भूमिका को समझना उपंयास रणनीतियों जो इन चुनौतियों को दरकिनार के विकास के लिए अनुमति दे सकते हैं । विशेष रूप से, वेक्टर जुड़े माइक्रोबियल commensals, symbionts, और रोगजनकों, microbiome के रूप में संदर्भित के बीच बातचीत, रोगज़नक़ संचरण के लिए महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं । भारी सबूत अब इस जोर का समर्थन करता है, वेक्टर microbiome और मलेरिया के रूप में रोगों के लिए क्षमता के बीच एक कड़ी का प्रदर्शन उदाहरण के साथ, Zika वायरस, और लाइम रोग1,2,3। हालांकि, रोग नियंत्रण के लिए रणनीतियों में इन निष्कर्षों का अनुवाद संरचना, समारोह के एक कहीं अधिक विस्तृत समझ की आवश्यकता है, और वेक्टर microbiomes की उत्पत्ति । पारिस्थितिकी और प्रायोगिक परिस्थितियों के तहत वेक्टर माइक्रोबियल समुदाय की पहचान और लक्षण वर्णन इस क्षेत्र में आगे एक महत्वपूर्ण पथ का गठन ।

एक रोगज़नक़ के माइक्रोबियल निवासियों की पहचान करने के लिए एक प्रक्रिया यहां पश्चिमी काले पैर टिक, Ixodes pacificus, लाइम रोग रोगज़नक़ अरै burgdorferiकी एक वेक्टर प्रजातियों का उपयोग करके प्रदान की जाती है । जबकि किसी भी अंय सन्धिपाद से मानव रोगजनकों के अधिक प्रकार के बंदरगाह ticks, अपेक्षाकृत कम टिक microbiomes4के जीव विज्ञान और सामुदायिक पारिस्थितिकी के बारे में जाना जाता है । यह स्पष्ट है कि ticks बंदरगाह वायरस, बैक्टीरिया, कवक, और protozoans जो commensals, endosymbionts, और परिवर्तनीय माइक्रोबियल निवासियों5,4शामिल है की एक विविध सरणी । पहले काम भूगोल, प्रजातियों, लिंग, जीवन स्तर, और रक्त भोजन के स्रोत6,7,8के साथ जुड़े Ixodes microbiomes में मजबूत बदलाव का प्रदर्शन किया है । हालांकि, इस भिन्नता अंतर्निहित तंत्र अज्ञात रहते हैं और इन माइक्रोबियल समुदायों के मूल और विधानसभा के अधिक विस्तृत जांच वारंट. ticks ऊर्ध्वाधर संचरण, मेजबान के साथ संपर्क के माध्यम से रोगाणुओं प्राप्त कर सकते हैं, और spiracles, मुंह के माध्यम से पर्यावरण से ऊपर, और गुदा ताकना9। प्रारंभिक गठन और टिक microbiome के विकास को आकार देने कारकों को समझने, विशेष रूप से ऊर्ध्वाधर और पर्यावरण संचरण के सापेक्ष योगदान, प्राकृतिक पैटर्न और टिक में बदलाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है microbiome विविधता और कैसे इन समुदायों रोगज़नक़ संचरण के दौरान, रोग या वेक्टर नियंत्रण के लिए संभव अनुप्रयोगों के साथ बातचीत ।

इस तरह की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में शक्तिशाली आणविक तकनीक, अब माइक्रोबियल समुदायों की पहचान के लिए मौजूद है और विविध पर्यावरणीय या प्रयोगात्मक शर्तों के तहत वेक्टर microbiomes की विशेषता के लिए नियोजित किया जा सकता है । इन उच्च प्रवाह अनुक्रमण दृष्टिकोण के आगमन से पहले, सूक्ष्मता और संस्कृति पर मुख्य रूप से भरोसा रोगाणुओं की पहचान । जबकि माइक्रोस्कोपी एक तेजी से और आसान तकनीक है, रोगाणुओं की पहचान के लिए रूपात्मक तरीकों स्वाभाविक व्यक्तिपरक और मोटे और कम संवेदनशीलता और10का पता लगाने के द्वारा सीमित कर रहे हैं । संस्कृति आधारित विधियों मोटे तौर पर माइक्रोबियल पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है और दवा उपचार के लिए रोगाणुओं की संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है11। हालांकि, इस विधि भी कम संवेदनशीलता से ग्रस्त है, के रूप में यह अनुमान लगाया गया है कि पर्यावरण रोगाणुओं से कम 2% एक प्रयोगशाला12में स्थापित किया जा सकता है । ऊतकवैज्ञानिक धुंधला दृष्टिकोण भी पता लगाने के लिए नियोजित किया गया है और वैक्टर के भीतर विशिष्ट रोगाणुओं स्थानीयकरण, टिक के भीतर विभिंन taxa वितरण की जांच सक्षम करें, और अध्ययन माइक्रोबियल बातचीत के बारे में परिकल्पना । हालांकि, माइक्रोबियल पहचान के पहले ज्ञान उपयुक्त दाग का चयन करने के लिए आवश्यक है, इस दृष्टिकोण बीमार माइक्रोबियल लक्षण वर्णन और पहचान के लिए अनुकूल बना । इसके अलावा, ऊतकवैज्ञानिक धुंधला एक उच्च समय गहन, श्रमसाध्य प्रक्रिया है और बड़े नमूना आकार के लिए अच्छी तरह से पैमाने पर नहीं है । ऐसे सैंज अनुक्रमण के रूप में पारंपरिक आणविक दृष्टिकोण इसी तरह उनकी संवेदनशीलता और विविध माइक्रोबियल समुदायों का पता लगाने में सीमित हैं ।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण नमूनों की एक बड़ी संख्या से रोगाणुओं की तेजी से पहचान के लिए अनुमति देता है । मानक मार्कर जीन और संदर्भ डेटाबेस की उपस्थिति आगे बढ़ाया वर्गीकरण संकल्प, अक्सर जीनस या प्रजातियों के स्तर के लिए सक्षम बनाता है । लघु इकाई राइबोसोमल RNAs अक्सर इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, 16S rRNA के साथ सबसे आम की उपस्थिति के कारण संरक्षित और जीन के भीतर चर क्षेत्रों, एक जीवाणु के लिए अद्वितीय amplicons के साथ यूनिवर्सल प्राइमरी के निर्माण के लिए अनुमति प्रजाति13,14. यह रिपोर्ट विवरण 16S rRNA अगली पीढ़ी sequencing के माध्यम से टिक microbiome में taxa की पहचान करने के लिए एक प्रक्रिया है । विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल sequencing के लिए नमूने तैयार करने में शामिल चरणों पर बल देता है । sequencing और bioinformatics चरणों पर अधिक सामान्यीकृत विवरण प्रदान किए जाते हैं, के रूप में वहाँ अनुक्रमण प्लेटफार्मों और विश्लेषण वर्तमान में उपलब्ध कार्यक्रमों की एक किस्म है, व्यापक मौजूदा प्रलेखन के साथ प्रत्येक. इस अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के समग्र व्यवहार्यता एक प्रमुख रोग वेक्टर के भीतर माइक्रोबियल समुदाय विधानसभा की एक जांच करने के लिए इसे लागू करने के द्वारा प्रदर्शन किया है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. टिक संग्रह और सतह नसबंदी

  1. एक टिक जुड़े निवास स्थान पर एक 1 मीटर2 सफेद कपड़े खींचकर ticks ले लीजिए, मेजबान प्रजातियों के लिए संलग्न ticks हटाने, या लैब15,16में टिक के पीछे । ठीक संदंश में हेरफेर और उंहें दुकान पर-८० ° c का उपयोग करें ।
  2. व्यक्तिगत पीसीआर ट्यूबों में टिक प्लेस और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2), ७०% इथेनॉल, और ddH2ओ के ५०० μL के साथ 15 एस क्रमिक के लिए भंवर द्वारा सतह संदूषणों को हटा दें ।
  3. एक नई पीसीआर ट्यूब में ticks प्लेस और उंहें हवा शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. इस ट्यूब में, यांत्रिक एक मोर्टार और मूसल (इस अध्ययन में प्रयुक्त) के साथ ticks कुचल द्वारा टिक ऊतकों को बाधित, एक मनका डिब्बा में छोटे मोतियों का उपयोग कर, या एक स्केलपेल के साथ अलग टिक काटने ।

2. डीएनए शुद्धिकरण

  1. व्यक्तिगत ticks से डीएनए शुद्ध, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट में दिए गए निर्देशों का पालन । १०० μL की अंतिम मात्रा के लिए Elute ।
    नोट: 2.2-2.8 चरणों का एक सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें । वैकल्पिक निष्कर्षण विधियों में phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण17,18, इथेनॉल वर्षण19, या एक chelating सामग्री20,21के साथ निष्कर्षण शामिल हैं ।
  2. सफल डीएनए शुद्धि एक fluorometer या spectrophotometer का उपयोग करने की पुष्टि करें । fluorometry के लिए, डीएनए टेम्पलेट के 10 μL का उपयोग एक १९० μL डबल कतरा डीएनए परख में । अपेक्षित उपज 0.1-1.0 एनजी/μL22है । spectrophotometry के लिए, एक न्यूक्लिक अम्ल ठहराव में डीएनए टेम्पलेट का 1 μL का उपयोग करें । अपेक्षित A260/280 अनुपात लगभग १.८23है ।
  3. यदि प्रवर्धन करने के लिए तुरंत कार्यवाही नहीं, पर नमूनों की दुकान-20 ° c.

3.16S rRNA जीन वर्धन

  1. एक २७.५ μL प्रतिक्रिया में amplicon पीसीआर की स्थापना: 1 माइक्रोन पर प्रत्येक प्राइमरी के 5 μL; व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर के १२.५ μL मिश्रण; और 5 एक 5 एनजी/μL एकाग्रता में व्यक्तिगत ticks से निकाले डीएनए के μL ।
    नोट: 16S rRNA जीन13के hypervariable V3-V4 क्षेत्र के प्रवर्धन के लिए निंनलिखित प्राइमरों का प्रयोग करें:
    5 '--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3 ',
    5 '--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3 '
  2. के लिए क्रमादेशित एक thermocycler के लिए ट्यूब हटो: 3 मिनट के लिए ९५ ° c पर एक प्रारंभिक विकार; 1 के 25 चक्र) 30 एस के लिए ९५ ° c, 2) ५७ ° c 30 एस के लिए, 3) ७२ ° c 30 s के लिए; 5 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक अंतिम विस्तार; और 10 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम पकड़ो ।
  3. एक बार जब पीसीआर किया जाता है, तो 4-6 μL/१.५% agarose जेल पर नमूना लोड करके पीसीआर उत्पाद कल्पना । ४६० बीपी पर एक बैंड के लिए देखो प्रवर्धन की पुष्टि करें ।
    नोट: Amplicon पीसीआर उत्पाद जेल पर दिखाई नहीं हो सकता है अगर नमूना एकाग्रता बहुत कम है (< 10 एनजी) । प्राइमर डिमर उपस्थिति कम एकाग्रता के नमूनों में आम है । अन्य गैर लक्ष्य बैंड मौजूद हैं, तो एनीलिंग तापमान को समायोजित या चक्र की संख्या में कमी.
  4. शुद्धि के लिए तुरंत कार्यवाही नहीं करते हैं, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.

४. 16S Amplicon शुद्धि

  1. प्रत्येक नमूने के लिए एक नई पीसीआर ट्यूब का प्रयोग, ddH2ओ के साथ पीसीआर उत्पाद गठबंधन ६० μL कुल प्राप्त करने के लिए । कम डीएनए सांद्रता के साथ नमूनों के लिए, तपसिल में amplicon पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए प्रवर्धन पूर्वाग्रह को कम करने और पूल नमूनों ध्यान केंद्रित करने के लिए ।
  2. कमरे के तापमान के लिए paramagnetic मोती लाओ और उपयोग करने से पहले उंहें अच्छी तरह से भंवर ।
  3. नमूना के लिए ६० μL के लिए paramagnetic मोतियों की ४८ μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए मशीन के लिए 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर ट्यूब प्लेस जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है । supernatant निकालें ।
    नोट: यह मनका एकाग्रता लक्ष्य प्राइमरी dimers के हटाने (< ६० bp) । यदि आवश्यक हो, मनका एकाग्रता को समायोजित करने के लिए अंय गैर विशिष्ट बैंडिंग को दूर ।
  4. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों के साथ, जोड़ने के ५०० μL हौसले से तैयार ८०% ेतोः । सभी ट्यूबों के लिए ेतोः जोड़ने के बाद तुरंत, बाहर तरल पिपेट । मोतियों को न निकालें । ेतोः इसके अलावा दोहराएं और एक और समय निकालने ।
  5. एयर सूखी नमूने 5 मिनट, या जब तक छोटे दरारें मोतियों में दिखाई दे रहे है के लिए चुंबकीय रैक पर खुली ट्यूबों छोड़ने के द्वारा अतिरिक्त ेतोः हटाने के लिए ।
  6. ते के 20 μL जोड़ें बफर और चुंबक से नमूने गर्मी, कमरे के तापमान पर, 5-10 मिनट के लिए ।
  7. चुंबक पर ट्यूबों वापस प्लेस । एक बार मोतियों और तरल अलग कर रहे हैं, supernatant एक ताजा ट्यूब करने के लिए साफ पीसीआर उत्पाद प्राप्त करने के लिए स्थानांतरण ।
  8. वैकल्पिक एक १.५% जेल पर 4-6 μL/नमूना लोड करके सफल amplicon शुद्धि की पुष्टि करने के लिए उत्पाद कल्पना । ४६० बीपी बैंड दिखाई देना चाहिए, और कोई प्राइमरी डिमर होना चाहिए ।
  9. यदि तत्काल कार्रवाई नहीं की जा रही है, तो नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।

5. नमूना Barcoding और शुद्धिकरण

  1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय सूचकांक किट से या तो आगे या रिवर्स प्राइमरों, या दोनों का चयन करके प्रत्येक नमूने के लिए अद्वितीय प्राइमरी संयोजन निरुपित ।
    नोट: विशिष्ट लेबलिंग नमूनों sequencing के बाद भेदभाव के लिए अनुमति देता है । किट आमतौर पर 96-384 नमूनों अनुक्रम के लिए पर्याप्त प्राइमर प्रदान करते हैं ।
  2. दोहरी प्राइमरों, या सूचकांकों संलग्न, एक 25 μL प्रतिक्रिया में पीसीआर प्रदर्शन द्वारा नमूने के लिए प्रत्येक प्राइमरी के २.५ μL (N7xx और S5xx), व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर मास्टर मिक्स के १२.५ μL, μL2ओ के 5 ddH, और २.५ μL के जरुर amplicon उत्पाद ।
  3. एक thermocycler के लिए क्रमादेशित ट्यूबों के लिए ले जाएं: 3 मिनट के लिए ९५ ° c पर एक प्रारंभिक विकार; 8-14 1 के चक्र) ९५ ° c 30 एस के लिए, 2) ५५ ° c 30 s के लिए, 3) ७२ ° c 30 s के लिए; 5 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक अंतिम विस्तार; और 10 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम पकड़ो ।
  4. एक बार जब पीसीआर किया जाता है, तो 4-6 μL/१.५% agarose जेल पर नमूना लोड करके पीसीआर उत्पाद कल्पना । ५५० बीपी पर एक बैंड के लिए देखो प्रवर्धन की पुष्टि करें ।
    नोट: इंडेक्स पीसीआर साइकलिंग शर्तों को सूचित करने के लिए विज़ुअलाइज़ेशन परिणामों का उपयोग करें. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को कम करने या प्रत्येक नमूने के लिए दृश्यमान बैंड को प्राप्त करने के लिए सायकल गणना को बढ़ाने के लिए चक्र की गणना को निंन करें ।
  5. चरण 4 में सूचीबद्ध क्लीन-अप प्रक्रिया को दोहराएँ । सफाई के दौरान कमजोर पड़ने से बचने के लिए, डुप्लिकेट में सूचकांक पीसीआर प्रदर्शन और उत्पाद यहां पूल ।
  6. पुस्तकालय ठहराव और सामान्यीकरण करने के लिए तुरंत कार्यवाही नहीं करते हैं, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.

6. पुस्तकालय ठहराव और सामान्यीकरण

  1. एक fluorometer या spectrophotometer का उपयोग करते हुए चरण ५.५ से प्रत्येक शुद्ध, बारकोड्ड उत्पाद की एकाग्रता का अनुमान लगाएं (चरण २.२ देखें) । लगभग 1 बजे की सांद्रता प्राप्त करने के लिए ते बफर में नमूनों को पतला करें ।
    नोट: लाइब्रेरी ठहराव अनुक्रमण मंच के लिए अनुशंसित नमूना लोडिंग एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । पुस्तकालय ठहराव qPCR के माध्यम से हासिल की है, लेकिन qPCR करने से पहले नमूना एकाग्रता का आकलन करने से बचाता है और समय । 1 pM एकाग्रता पुस्तकालय ठहराव की सटीकता को अधिकतम करने के लिए सिफारिश की है, के रूप में यह qPCR ठहराव किट24में प्रदान की मानकों का मतलब एकाग्रता है ।
  2. एक 10 μL प्रतिक्रिया में qPCR प्रदर्शन qPCR मास्टर मिश्रण के ६.० μL युक्त (लाइब्रेरी ठहराव किट से), २.० μL के ddH2हे, और २.० नमूना या मानक के μL. अधिक सटीकता और परिशुद्धता के लिए तपसिल में प्रत्येक नमूना और मानक चलाएँ. सटीक ठहराव सुनिश्चित करने के लिए तीन या अधिक कमजोर पड़ने के स्तर पर प्रत्येक नमूना (जैसे, ०.१ बजे, 1 बजे, और अनुमानित शुरू सांद्रता के लिए 10 बजे) चलाते हैं ।
    नोट: प्रदान की प्राइमरों और मानकों के बारे में विस्तृत जानकारी ठहराव किट का इस्तेमाल किया और उत्पादों के तकनीकी डेटा शीट में उपलब्ध है के आधार पर भिंन होगा । इस अध्ययन में प्रयुक्त ठहराव किट के लिए सामग्री तालिका का संदर्भ लें ।
  3. के लिए क्रमादेशित एक वास्तविक समय पीसीआर साधन के लिए qPCR प्लेट या ट्यूबों हटो: 5 मिनट के लिए ९५ ° c के एक प्रारंभिक विकार; ३५ 1 के चक्र) ९५ ° c 30 एस के लिए और 2) ६० ° c ४५ s के लिए; और 1 के एक पृथक्करण कदम) 15 एस के लिए ९५ ° c, 2) ६० ° c 30 एस के लिए, और 3) ९५ ° c 15 एस के लिए
  4. qPCR परिणाम और नमूना कमजोर पड़ने के स्तर से प्राप्त ठहराव मूल्यों का उपयोग करते हुए, प्रत्येक नमूने के लिए औसत शुरू एकाग्रता की गणना ।
    नोट: उदाहरण के लिए, एक नमूना 1 पतला के लिए 2 बजे की एक औसत एकाग्रता: 100000 २०० एनएम के एक मूल शुरू एकाग्रता पैदावार । यदि किसी दिए गए नमूने के लिए कमजोर पड़ने के स्तर से कोई भी मानक curves की सीमा के भीतर गिर जाता है, ठहराव परिणाम सही नहीं हो सकता है; जो मामले में, कमजोर पड़ने के स्तर को समायोजित करने और qPCR फिर से प्रदर्शन ।
  5. प्रत्येक शुद्ध, बारकोड नमूना करने के लिए 4 एनएम में ते बफर, ७.५ चरण में गणना की औसत सांद्रता के आधार पर पतला ।
    नोट: उदाहरण के लिए, २०० एनएम के एक औसत नमूना एकाग्रता के लिए, एक 4 एनएम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ते बफर में नमूना 1:50 पतला । सटीक नमूना एकाग्रता sequencing प्रणाली और एजेंट इस्तेमाल किया किट के आधार पर भिन्न होगा. अनुशंसित एकाग्रता के लिए sequencing सिस्टम उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका देखें ।
  6. एक एकल ट्यूब में सभी व्यक्तिगत पुस्तकालयों के बराबर खंड (आमतौर पर 5-10 μL) जोड़कर संयुक्त पुस्तकालय बनाएं ।
    नोट: के रूप में सभी नमूनों एक 4 एनएम एकाग्रता पर होना चाहिए, बराबर मात्रा में जोड़ने के सभी नमूनों की एक बराबर एकाग्रता प्राप्त पूल में पुस्तकालय.
  7. दोहराएँ चरण 6.2-6.4 संयुक्त लाइब्रेरी पर 4 एनएम एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए.
  8. संयुक्त पुस्तकालय एकाग्रता की गणना और पतला या फिर से 4 एनएम प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में Tris बफर का उपयोग कर अंतिम, परित पुस्तकालय का गठन ।
  9. नमूना लोड करने के लिए तुरंत कार्यवाही नहीं करते हैं, तो-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान. ठहराव भंडारण के दौरान डीएनए एकाग्रता के लिए नुकसान या परिवर्तन को कम करने के लिए शीघ्र ही के बाद sequencing रन प्रदर्शन करते हैं ।

7. पुस्तकालय विकार और कमजोर पड़ने, और अनुक्रमण चलाने (एक ही दिन पर प्रदर्शन)

  1. स्वभाव 4 एनएम NaOH के साथ ६.९ कदम से संयुक्त पुस्तकालय ।
    नोट: ये अंतिम लायब्रेरी तैयारी चरण प्रत्येक sequencing सिस्टम के लिए भिन्न होता है । अधिक विस्तृत और अद्यतन किए गए प्रोटोकॉल के लिए sequencing सिस्टम उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका देखें । नए उपयोगकर्ताओं की संभावना sequencing मंच के उपयोग पर प्रशिक्षित किया जा करने के लिए या एक कोर sequencing सुविधा के लिए अपने पुस्तकालयों भेज सकते हैं की आवश्यकता होगी ।
  2. अनुक्रमणक एजेंट किट (सामग्री की तालिका) में प्रदान की बफर का उपयोग कर वांछित लोडिंग एकाग्रता के लिए विकृत पुस्तकालय को पतला ।
    नोट: इष्टतम लोडिंग सांद्रता अनुक्रमण प्रणाली द्वारा बदलती है और आम तौर पर 1-250 pM25से रेंज ।
  3. स्वभाव और अनुक्रमण नियंत्रण को कमजोर ।
    नोट: अनुक्रमण नियंत्रण जोड़ना कम विविधता पुस्तकालयों से उत्पन्न होने वाली समस्याओं sequencing के लिए सही है । NaOH का उपयोग कर अनुक्रमण नियंत्रण स्वभाव और पुस्तकालय के रूप में एक ही एकाग्रता को पतला ।
  4. लायब्रेरी और अनुक्रमण नियंत्रण संयोजित करें ।
    नोट: अनुक्रमण नियंत्रण के संयुक्त पुस्तकालय के अनुपात पुस्तकालय विविधता और अनुक्रमण प्रणाली का इस्तेमाल किया पर निर्भर करेगा, लेकिन यह आम तौर पर 1:126है ।
  5. संयुक्त लाइब्रेरी और अनुक्रमण नियंत्रण मिश्रण sequencing प्रवाह कक्ष पर लोड ।

8. Amplicon अनुक्रम विश्लेषण

  1. का उपयोग करते हुए sequencing सिस्टम करने के लिए संगत क्लाउड कंप्यूटिंग वातावरण पर रन मैट्रिक्स का परीक्षण करके चलाने की समग्र सफलता का आकलन करें ।
    नोट: sequencing की संख्या पढ़ता, जैसे रन मैट्रिक्स, sequencing प्लेटफ़ॉर्म और एजेंट का उपयोग किया गया किट के आधार पर भिन्न होगा । सामान्य sequencing सिस्टमों के लिए लक्ष्य मान तालिका 1में सूचीबद्ध होते हैं ।
  2. कच्चे अनुक्रमण डेटा और वांछित bioinformatics खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, माइक्रोबियल पारिस्थितिकी (QIIME)27 या Mothur28में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि डाउनलोड करें ।
    नोट: दोनों QIIME और Mothur खुले स्रोत और डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र हैं । इन प्रोग्रामों के उपयोग पर विस्तृत निर्देश ऑनलाइन पाया जा सकता है और पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए पर्याप्त रूप से विस्तृत हैं । नीचे दिए गए चरणों में एक bioinformatics पाइपलाइन QIIME में आयोजित की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं । अजगर के साथ परिचित आवश्यक नहीं है, लेकिन निंनलिखित लिपियों के कार्यांवयन की सुविधा होगी
  3. बनाएं और QIIME में "validate_mapping_file. py" स्क्रिप्ट का उपयोग कर मैपिंग फ़ाइल को मांय करें ।
    नोट: मैपिंग फ़ाइल में नमूना ID, amplicon प्राइमरी दृश्यों, और नमूना विवरण सहित, डेटा विश्लेषण करने के लिए आवश्यक सभी मेटाडेटा है । मांयता चरण जांचता है कि सभी आवश्यक डेटा उचित स्वरूप में दर्ज किया गया है ।
  4. "split_libraries. py" स्क्रिप्ट (आरेख 1) का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स और फ़िल्टर अनुक्रम ।
    नोट: यह स्क्रिप्ट प्रदान करता है बारकोड को इंडेक्स प्राइमरी युग्म और मानचित्रण फ़ाइल में नमूना आईडी इनपुट के आधार पर नमूनों को पढ़ता है । यह भी न्यूनतम गुणवत्ता स्कोर, अनुक्रम लंबाई, और अंत ट्रिमिंग के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित कट-नापसंद के आधार पर sequencing त्रुटि के लिए नियंत्रित करने के लिए कई गुणवत्ता फ़िल्टरिंग कदम करता है.
  5. संचालन वर्गीकरण इकाइयों (OTUs) "pick_open_references_otus. py" स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए अनुक्रम असाइन करें ।
    नोट: इस चरण में, अनुक्रम पहचान की सीमा पर आधारित संदर्भ अनुक्रम संग्रह के विरुद्ध clustered है (सामांयतया ९७%) । संदर्भ अनुक्रम संग्रह से मेल नहीं खाती जो पढ़ता एक-दूसरे के विरुद्ध संकुल रहे हैं । De नोवो और बंद संदर्भ ओटू खरीदना विकल्प भी उपलब्ध हैं, लेकिन खुला संदर्भ उठा QIIME डेवलपर्स द्वारा सिफारिश की है ।
  6. "alpha_rarefaction. py" या "normalize_table. py" स्क्रिप्ट का उपयोग कर ओटू तालिका को सामान्य ।
    नोट: यह चरण स्तंभ योग में भिंनता के लिए ठीक करता है, या कुल अनुक्रम प्रति नमूना पढ़ता है, जो आधुनिक sequencing तकनीकों से परिणाम है । सामांयीकरण पारंपरिक rarefaction का उपयोग कर, या वैकल्पिक विधियों जैसे संचई योग स्केलिंग के माध्यम से किया जा सकता है ।
  7. कई अल्फा प्रदर्शन-विविधता, बीटा विविधता, और वर्गीकरण संरचना विविधता विश्लेषण में एक बार "core_diversity_analysis. py" स्क्रिप्ट का उपयोग कर ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इन विश्लेषण अलग से व्यक्तिगत लिपियों (जैसे, "alpha_diversity. py") का उपयोग कर चलाया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

तीन अलग अंडा चंगुल और दो पर्यावरण जोखिम समय, 0 और मिट्टी में 2 सप्ताह से ४२ ticks की कुल, microbiome अनुक्रमण के लिए कार्रवाई की गई । प्रत्येक उपचार समूह, एक भी क्लच और जोखिम समय माना जाता है, निहित 6-8 टिक नमूनों दोहराने । इन संसाधित टिक निष्कर्षों एक अगली पीढ़ी sequencer पर लोड किया गया और १२,८८५,७१३ युग्मित-अंत फ़िल्टर गुजर पढ़ता है । इस रन में शामिल 3 नकारात्मक नियंत्रण निष्कर्षण कदम से थे, २११,२१४ की कुल उपज पढ़ता (पिछली गिनती में शामिल) । इसके अलावा गुणवत्ता मेट्रिक्स चलाने के साथ प्रत्येक मीट्रिक के लिए इष्टतम मूल्यों तालिका 2में विस्तृत रहे हैं. Rarefaction घटता है, जो प्रति नमूना OTUs की संख्या करने के लिए sequencing प्रयास, संकेत दिया है कि एक अनुक्रमण गहराई, या अद्वितीय अनुक्रम की संख्या के प्रति नमूना पढ़ता, २,१२९ पुस्तकें पर्याप्त रूप से माइक्रोबियल समुदाय की विविधता पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त होगा ( चित्रा 2) । Rarefaction स्तर नमूना प्रकार के आधार पर भिन्न होगा और प्रत्येक sequencing चलाने के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए । इस गहराई के लिए rarefying के बाद, १,७१४ OTUs प्रति नमूना ९३.३ ± ४.३ OTUs के एक औसत के साथ सभी नमूनों की पहचान की गई । स्पार्स मैट्रिक्स से उत्पन्न होने वाली अनुप्रवाह विश्लेषण समस्याओं से बचने के लिए और संभावित दूषित पदार्थों को निकालने के लिए, सभी OTUs नहीं मिला कम से ≥ पर एक नमूना 1% बहुतायत एक दुर्लभ सामान्य श्रेणी में परित थे । इसके अलावा, आर में decontam पैकेज OTUs की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था पर नकारात्मक नियंत्रण में प्रतिनिधित्व असली नमूनों के सापेक्ष, और इन OTUs बहाव विश्लेषण से हटा दिया गया ।

समुदाय पारिस्थितिकी विश्लेषण QIIME विविधता विश्लेषण कार्यप्रवाह का उपयोग करने के लिए अल्फा विविधता, बीटा विविधता के प्रकार का प्रदर्शन किया गया, और वर्गीकरण संरचना विविधता उत्पादन एक सरल bioinformatics पाइपलाइन का उपयोग कर उत्पंन । उदाहरण के लिए, भारित और unweight Unifrac प्रिंसिपल निर्देशांक विश्लेषण "core_diversity_analyses. py" स्क्रिप्ट का उपयोग कर उत्पादित किया गया, और वे क्लच पहचान (चित्रा 3) के आधार पर लार्वा ticks के स्थानिक clustering का पता चला. ओटू के Boxplots पर्यावरण जोखिम बार बदलती पर मायने रखता भी इस स्क्रिप्ट के माध्यम से उत्पंन किया गया, microbiome प्रजातियों के समय के साथ समृद्धि में मतभेद (चित्रा 4) का प्रदर्शन । इन अल्फा और बीटा विविधता विश्लेषण उपयोगकर्ता परिभाषित मानचित्रण फ़ाइल में सूचीबद्ध श्रेणियों के आधार पर प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन आंकड़े और सामांय वर्गीकरण जानकारी पर आंकड़े भी सभी नमूनों (चित्रा 5) के लिए उत्पंन कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : Microbiome अनुक्रमण कार्यप्रवाह । microbiome sequencing वर्कफ़्लो के प्रमुख चरणों को लायब्रेरी तैयारी और sequencing विश्लेषण चरणों के लिए कॉल-आउट के साथ प्रदर्शित होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : अनुक्रम गणना सामांयीकरण के लिए Rarefaction घटता है । Rarefaction घटता, ticks के प्रत्येक पलटन के लिए दिखाया गया है, ओटू प्रयास नमूना करने के लिए मायने रखता है । त्रुटि पट्टियां प्रत्येक क्लच के भीतर उपस्थित नमूनों को दोहराने के कारण मौजूद हैं, और वे एक मानक विचलन निरूपित करते हैं । एक अनुक्रमण गहराई पर या बिंदु जहां वक्र पर्याप्त रूप से OTUs की पूर्ण विविधता को पकड़ने के लिए स्थिर हो जाता है परे चुना जाना चाहिए । यहाँ, २,००० पढ़ता की एक sequencing गहराई उपयुक्त दिखाई देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रधानाचार्य क्लच द्वारा विश्लेषण निर्देशांक। unweight Unifrac प्रिंसिपल निर्देशांक विश्लेषण (PCoA) विभिन्न चंगुल से लार्वा ticks के बीच microbiome संरचना में भिन्नता से पता चलता है, और वयस्कों से. प्रत्येक डेटा बिंदु एक व्यक्ति टिक नोट । यह आंकड़ा स्वचालित रूप से QIIME "core_diversity_analyses. py" स्क्रिप्ट के माध्यम से उत्पंन होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : अल्फा विविधता जोखिम समय द्वारा boxplots । Boxplots चित्रण ओटू पर्यावरण एक्सपोजर समूहों के लिए मायने रखता है समय के साथ माइक्रोबियल विविधता में भिंनता दिखाओ । यह आंकड़ा स्वचालित रूप से QIIME "core_diversity_analyses. py" स्क्रिप्ट के माध्यम से उत्पंन होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : एक क्लच के लिए जाति-स्तर माइक्रोबियल पहचान । एक क्लच से व्यक्तिगत टिक नमूनों के लिए Microbiome संरचना जाति स्तर पर दिखाया गया है । यह आंकड़ा, साथ ही साथ कम वर्गीकरण स्तर पर सारांश जानकारी, स्वचालित रूप से QIIME "core_diversity_analyses. py" स्क्रिप्ट के माध्यम से उत्पंन होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मीट्रिक परिभाषा हमारे परिणाम (MiSeq V3) MiSeq V3 के लिए इष्टतम HiSeq रैपिड मोड के लिए इष्टतम
पढ़ता कत अनुक्रमण की संख्या शुद्धता फिल्टर गुजर पढ़ता है । एक पढ़ने गुजरता फिल्टर से अधिक नहीं है, तो 1 आधार कॉल पहले 25 चक्र में ०.६ नीचे एक शुद्धता मूल्य है १२,८८५,७१३ 14-16 लाख ६००,०००,०००
त्रुटि दर आधार जोड़े का प्रतिशत गलत तरीके से एक चक्र के दौरान, PhiX नियंत्रण करने के लिए संरेखित पढ़ता के आधार पर कहा जाता है ३.२८ ± ०.१० * अन्य मीट्रिक के लिए मूल्यों पर निर्भर करता है * अन्य मीट्रिक के लिए मूल्यों पर निर्भर करता है
% ≥ Q30 एक Q स्कोर के साथ कुर्सियां का प्रतिशत 30 ≥, ९९.९% की एक आधार कॉल सटीकता का संकेत ६८.९४ > ७०% > ८०%
क्लस्टर पीएफ (%) शुद्धता फिल्टर गुजर समूहों का प्रतिशत । ८५.६१ ± ०.८१ ९०% ९०%
घनत्व flowcell पर समूहों का घनत्व-डेटा की गुणवत्ता और उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण मीट्रिक ५५२ ± ३५ क्लस्टर/ 1200-1400 क्लस्टर/mm ^ 2 850-1000 क्लस्टर/mm ^ 2

तालिका 1: NGS आउटपुट के लिए कुंजी प्रदर्शन पैरामीटर । उपयोगकर्ता डेटा और लक्ष्य मान sequencing प्लेटफ़ॉर्म और एजेंट इस अध्ययन (सामग्री तालिका) और एक 25% sequencing नियंत्रण इसके अलावा में प्रयुक्त किट पर आधारित रिपोर्ट किया गया है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

16S rRNA के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण माइक्रोबियल पहचान के लिए एक मानक दृष्टिकोण बन गया है और कैसे वेक्टर microbiomes रोगज़नक़ संचरण को प्रभावित का अध्ययन सक्षम होना चाहिए । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल pacificus, लाइम रोग के लिए एक वेक्टर प्रजातियों में माइक्रोबियल समुदाय विधानसभा की जांच करने के लिए इस विधि का उपयोग विवरण; हालांकि, यह आसानी से अंय टिक प्रजातियों या सन्धिपाद वेक्टर प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

दरअसल, microbiome विश्लेषण के लिए 16S rRNA अनुक्रमण व्यापक रूप से मच्छरों, psyllids, और tsetse मक्खियों सहित वैक्टर के microbiomes का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है29,30,31। अंय वैक्टर के भीतर माइक्रोबियल पहचान के लिए उपलब्ध तरीकों माइक्रोस्कोपी, संवर्धन, और ऊतकवैज्ञानिक धुंधला शामिल हैं । इन विधियों sequencing से अधिक उपयुक्त हो सकता है यदि लक्ष्य को पहचानने और एक उपंयास सूक्ष्म जीव का वर्णन करने के लिए है (माइक्रोस्कोपी), रोगाणुरोधी दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन (संस्कृति), या विशिष्ट और ज्ञात रोगाणुओं वेक्टर के भीतर स्थानीयकरण (ऊतकवैज्ञानिक धुंधला). हालांकि, इन तरीकों कम विशिष्टता, पता लगाने, और दरिद्र से ग्रस्त हैं, और इस तरह एक सदिश के भीतर रोगाणुओं का पूरा समुदाय की पहचान करने के लिए कम उपयुक्त है या निस्र्पक के तहत वेक्टर microbiome पारिस्थितिकी और प्रायोगिक अलग शर्तों. इसके विपरीत, उच्च 16S rRNA जीन का प्रवाह अनुक्रमण कम बहुतायत और गैर culturable बैक्टीरिया की पहचान में सक्षम बनाता है, उच्च संकल्प और व्यापक संदर्भ डेटाबेस दिया पता लगाने प्रदान करता है, और उच्च प्रतिकृति के आधार पर प्रदान कर सकते है कवरेज की जरूरत है ।

जबकि 16S rRNA अनुक्रमण अब व्यापक रूप से माइक्रोबियल पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है, इस तकनीक सीमाओं के बिना नहीं है । मुख्य रूप से, माइक्रोबियल संक्रमण अनुक्रमण परिणाम की व्याख्या अस्पष्ट और जैविक अर्थ३२पाया कर सकते हैं । इसके अलावा, सार्वभौमिक बैक्टीरियल प्राइमरों और कम शुरू करने के लिए संवेदनशीलता के उपयोग को देखते हुए सांद्रता कि 16S rRNA अनुक्रमण करने के लिए अंतर्निहित हैं, माइक्रोबियल संक्रमण३२आम है । संदूषण के सूत्रों पीसीआर रिएजेंट, डीएनए निष्कर्षण किट, प्रयोगशाला सतहों, और त्वचा और शोधकर्ताओं के कपड़े३३,३४,३५शामिल हैं । माइक्रोबियल दूषित प्रभाव एक बाँझ प्रयोगशाला वातावरण में काम कर, नकारात्मक नियंत्रण और तकनीकी प्रतिकृति का उपयोग कर, और सभी किट और रिएजेंट का एक रिकॉर्ड रखने के द्वारा कम किया जा सकता३६इस्तेमाल किया ।

माइक्रोबियल संक्रमण के अलावा, कम गुणवत्ता अनुक्रमण उत्पादन बहुत microbiome अनुक्रमण डेटा की प्रयोज्य में बाधा डाल सकते हैं । डेटा की गुणवत्ता की संख्या सहित रन मेट्रिक्स के एक नंबर से मूल्यांकन किया जा सकता है फ़िल्टर पासिंग, एक Q-स्कोर के ऊपर पढ़ता का प्रतिशत (बेस में त्रुटि की भविष्यवाणी की संभावना के एक उपाय कॉलिंग) 30, और क्लस्टर घनत्व । इन मैट्रिक्स के लिए मान चलाएँ नमूनों की संख्या के आधार पर भिन्न होगा, sequencing सिस्टम, एजेंट कारतूस, और प्रतिशत sequencing नियंत्रण का उपयोग किया, लेकिन रन शर्तों पर आधारित इष्टतम मान ऑनलाइन उपलब्ध हैं. विशेष रूप से, क्लस्टर घनत्व, अनुक्रमण करने से पहले प्रवाह कक्ष के किसी दिए गए विमान पर पुस्तकालय समूहों की संख्या, डेटा की गुणवत्ता और उपज के अनुकूलन के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । दोनों पर और के तहत clustering डेटा उत्पादन कम कर सकते है और नमूनों में परिणाम अपर्याप्त कवरेज के कारण विश्लेषण से बाहर रखा जा रहा है । गरीब क्लस्टर घनत्व अक्सर गलत पुस्तकालय ठहराव को दर्शाता है; इस प्रकार, देखभाल के लिए उचित डीएनए साफ-अप, व्यक्तिगत नमूना ठहराव, और पूरे पुस्तकालय ठहराव प्रदर्शन लिया जाना चाहिए ।

उच्च डेटा की गुणवत्ता और उपज मान हासिल कर रहे हैं, डेटा विश्लेषण में अलग दृष्टिकोण बड़े डेटासेट की सांख्यिकीय चुनौतियों को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया इस दृष्टिकोण की एक और सीमा मुद्रा । उदाहरण के लिए, एकाधिक विधियों के नमूने के बीच पठन गणना में भिन्नता पता करने के लिए मौजूद है । सभी नमूनों भर में एक समान अनुक्रमण गहराई को प्राप्त करने के लिए उप नमूना पढ़ता है जो Rarefaction, अक्सर उपयोग किया जाता है, लेकिन हाल ही में डेटा की बड़ी मात्रा में बर्बाद कर रहा है और न्यूनतम अनुक्रमण गहराई ३७ के व्यक्तिपरक चयन के लिए आलोचना के अधीन किया गया है ,३८,३९. संचयी योग स्केलिंग (CSS), जो सभी अनुक्रम पढ़ता रहता है, लेकिन उन्हें किसी दिए गए शतमक के भीतर गणना के संचयी योग के आधार पर वज़न होता है, एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में विकसित किया गया है । हालांकि, सीएसएस व्यापक रूप से अपने रिश्तेदार नवीनता के कारण नहीं अपनाया गया है और सामांय के लिए rarefaction की पुष्टि की उपयोगिता उपस्थिति से पहले/

मानक डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं में भी कमी कर रहे है अनुक्रम से निपटने के लिए नकारात्मक नियंत्रण में पढ़ता है और कम बहुतायत से इन भेद पढ़ता है । के रूप में उल्लेख किया है, अनुक्रमण नकारात्मक नियंत्रण डीएनए निष्कर्षण कदम से उत्पंन विश्लेषण के दौरान माइक्रोबियल संदूषणों से सच वेक्टर microbiome निवासियों अंतर मदद करने के लिए सिफारिश की है । फिर भी, एक मानक और सांख्यिकीय कठोर दृष्टिकोण की पहचान करने और संदिग्ध पदार्थों को छानने के लिए कमी है । एक आम तरीका सभी नमूनों से नकारात्मक नियंत्रण में मौजूद OTUs को दूर करने के लिए है । हालांकि, इस विधि पीढ़ी रूढ़िवादी इन रोगाणुओं की संभावना के बाद से कई असली नमूनों से उत्पंन हो सकता है बजाय किट reagent४०। एक अन्य सामान्य तकनीक में < 1% में मौजूद समूहन रोगाणु शामिल हैं जो इस धारणा के तहत एक "दुर्लभ" श्रेणी में है कि माइक्रोबियल संदूषण8,४१असली नमूनों में दुर्लभ हैं । हालांकि, इस विधि को दूर कर सकते है यह सच है वेक्टर रोगाणुओं कि कम बहुतायत पर मौजूद हैं, विशेष रूप से जब microbiome एक endosymbiont द्वारा प्रभुत्व है के रूप में देखा pacificus और मैं holocyclus7,४२। इन मामलों में, दुर्लभ रोगाणुओं का पता लगाने गहरी अनुक्रमण की आवश्यकता होती है, प्राइमरों के विकास कि amplicon पीसीआर४२के दौरान endosymbiont के प्रवर्धन को बाधित, या गणना अनुक्रम विश्लेषण के दौरान endosymbiont को हटाने 7. दुर्लभ और contaminant OTUs पता करने के लिए विभिन्न तरीकों के बीच का चयन microbiome डेटा विश्लेषण में मनोवाद और पूर्वाग्रह के लिए अवसर पैदा करता है, जो अध्ययन में परिणामों की तुलना करने की क्षमता को सीमित कर सकते हैं.

संदर्भ डाटाबेस के विकल्प, वर्गीकरण और वंशावली जानकारी के अनुक्रम के लिए आवंटित करने के लिए आवश्यक पढ़ता है, विचलन और मनोवाद के लिए एक और अवसर प्रस्तुत करता है । जबकि संबंधित अनुक्रम का कार्य एक चर जीन क्षेत्र से एक की पहचान के जनक जीनोम के लिए पढ़ता स्वाभाविक चुनौतीपूर्ण है, एक विश्वसनीय संदर्भ डाटाबेस सटीक वंशावली काम के लिए महत्वपूर्ण है । कई डेटाबेस इस तरह के सिल्वा४३, Greengenes४४, RDP४५, और NCBI४६के रूप में इस चुनौती को पूरा करने के लिए उभरा है । सिल्वा 16S के सबसे बड़े आधारित वर्गीकरण है, लेकिन सिल्वा, साथ ही RDP, केवल वर्गीकरण जानकारी प्रदान करता है नीचे जीनस स्तर के लिए । Greengenes प्रजातियों के स्तर की जानकारी प्रदान करता है और QIIME तरह metagenomic विश्लेषण संकुल में शामिल है, लेकिन यह चार साल से अधिक में अद्यतन नहीं किया गया है । NCBI, वर्गीकरण जानकारी के लिए एक प्राथमिक स्रोत नहीं है, जबकि उपयोगकर्ता द्वारा प्रस्तुत अनुक्रम से दैनिक अद्यतन वर्गीकरण प्रदान करता है, लेकिन यह है । जबकि डेटाबेस के बीच चयन आम तौर पर प्रयोक्ताओं की जरूरत पर निर्भर करता है संकल्प, कवरेज, और मुद्रा के बारे में, यह वंशावली असाइनमेंट और बहाव विश्लेषण४७,४८पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । जांचकर्ताओं के बीच जो संदर्भ डेटाबेस का उपयोग करने के लिए आम सहमति विश्लेषण में अतिरिक्त पूर्वाग्रह से बचने के लिए इस प्रकार आवश्यक है ।

इन डेटा संसाधन चुनौतियों के लिए मानक दृष्टिकोण की संभावना 16S rRNA अनुक्रमण एक तेजी से आम तकनीक बन जाता है के रूप में उभरने होगा । अनुक्रमण लागत और समय में निरंतर कटौती आगे इस विधि को लोकप्रिय बनाने होगा । इस प्रौद्योगिकी का बढ़ता उपयोग विविध स्थितियों के अंतर्गत वेक्टर microbiomes की संरचना और पारिस्थितिकी में गहन जांच कर सकेगा । वेक्टर microbiome जीव विज्ञान के ज्ञान के रूप में अपनी प्रारंभिक अवस्था में अभी भी है, वर्णनात्मक अध्ययन के इन प्रकार के एक महत्वपूर्ण पहले कदम के लिए वेक्टर नियंत्रण का एक साधन के रूप में microbiome का लाभ उठाने का प्रयास कर रहे हैं । हालांकि, वास्तव में रोगज़नक़ संचरण में microbiome की भूमिका को समझने के लिए, माइक्रोबियल पहचान इन रोगाणुओं के कार्यात्मक भूमिका के ज्ञान के साथ युग्मित किया जाना चाहिए । आरएनए अनुक्रमण और transcriptomic दृष्टिकोण है, जो मानचित्रण शामिल है और जीन अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, रोगाणुओं की कार्यात्मक भूमिका में निष्कर्ष सक्षम लेकिन गहरी अनुक्रमण की आवश्यकता होती है और पूरी तरह से लक्ष्य प्रजातियों के जीनोम इकट्ठे । इन चुनौतियों को दरकिनार, अभिकलनी उपकरण 16S rRNA अनुक्रमण डेटा से कार्यात्मक संरचना की भविष्यवाणी करने के लिए हाल ही में विकसित किया गया है, लेकिन व्यापक रूप से अभी तक४९नहीं अपनाया गया है । इस तरह के उपकरणों के विकास, साथ ही पारिस्थितिक सिद्धांत, माइक्रोबियल पहचान को जोड़ने और वैक्टर के भीतर कार्यात्मक भूमिका वेक्टर microbiome अध्ययन में 16S rRNA अनुक्रमण डेटा की उपयोगिता में वृद्धि होगी ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था एएस (देब #1427772, १७४५४११, १७५००३७) के लिए अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Item Name of Material/Equipment Company Catalog #
1 DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
2 Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Scientific Q3326
3 NanoDrop 8000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-8000-GL
4 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems KK2501
5 AMPure XP beads Agen Court A63880 
6 Magnetic Rack ThermoFisher Scientific MR02
6 TE buffer Teknova T0223
7 Nextera Index Kit Illumina FC-121-1011
8 KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824
9 MiSeq System Illumina SY-410-1003
10 MiSeq Reagent Kit v3  Illumina MS-102-3001
11 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 Teknova T7724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
  2. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
  3. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  4. Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
  5. Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
  6. van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
  7. Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
  8. Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
  9. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  10. Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
  11. Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
  12. Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
  13. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
  14. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  15. Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
  16. Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
  17. Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
  18. Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
  19. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  20. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
  21. Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
  22. Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
  23. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  24. TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
  25. Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
  26. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
  27. Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  28. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
  29. Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
  30. Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
  31. Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
  33. Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
  34. Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
  35. Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
  36. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
  37. Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
  38. Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
  39. McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
  40. Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
  41. Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
  42. Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
  43. Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
  44. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  45. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
  46. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
  47. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
  48. Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
  49. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).

Tags

जीव विज्ञान अंक १३८ टिक वेक्टर microbiome 16S rRNA amplicon अगली पीढ़ी के अनुक्रमण Ixodes
टिक अगली पीढ़ी 16S rRNA Amplicon अनुक्रमण द्वारा Microbiome लक्षण वर्णन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Couper, L., Swei, A. Tick Microbiome … More

Couper, L., Swei, A. Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (138), e58239, doi:10.3791/58239 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter