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Engineering

Rhéométrie force-pince pour caractériser les Hydrogels à base de protéines

Published: August 21, 2018 doi: 10.3791/58280
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physics, University of Wisconsin-Milwaukee

Summary

Une nouvelle technique de rhéométrie pince-force est utilisée pour étudier les propriétés mécaniques des échantillons d’hydrogel basées sur les protéines de faible volume attachés entre un moteur de la bobine et un capteur de force. Un analogique proportionnel-intégral-dérivé (PID) système permet le « serrage » de la force subie au protocole désiré.

Abstract

Nous décrivons ici une méthode de rhéométrie force-pince pour caractériser les propriétés biomécaniques des hydrogels à base de protéines. Cette méthode utilise un système analogique de (PID) proportionnel-intégral-dérivé pour appliquer des protocoles contrôlés-force sur des échantillons cylindriques hydrogel basées sur les protéines, qui sont attachés au maximum entre un moteur bobine linéaire et un capteur de force. Au cours de l’opération, le système PID ajuste l’extension de l’échantillon d’hydrogel à suivre un protocole prédéfini force en réduisant au minimum la différence entre les forces mesurées et consigne. Cette approche unique à base de protéines hydrogels permet l’attachement des échantillons de très faible volume hydrogel (< 5 µL) avec des concentrations de protéines différentes. En vertu de protocoles de force-rampe, où la contrainte appliquée augmente et diminue de façon linéaire avec le temps, le système permet l’étude des comportements élasticité et hystérésis associé le (dé) pliage des protéines et la mesure de l’élastique standard et paramètres de visco-élastique. En vertu de la force constante, où la pulsation a une étape-comme la forme, la réponse élastique, dû au changement de force, est découplé de la réponse viscoélastique, qui vient du domaine protéique déplier et replier. En raison de son faible volume échantillon et la polyvalence dans l’application de diverses perturbations mécaniques, pince-force rhéométrie est optimisé afin d’étudier la réponse mécanique des protéines sous la force à l’aide d’une approche en vrac.

Introduction

En dehors d’avoir des propriétés physiques uniques, basées sur les protéines hydrogels promettent de révolutionner la spectroscopie de force en permettant la mesure de plusieurs milliards de molécules dans un « pull », permettant ainsi à l’étude des protéines dans des environnements surpeuplés, similaires à celles rencontrées dans la peau et autres tissus. Domaines protéiques restent pliés à l’intérieur des hydrogels, permettant l’étude de leur réaction biomécanique pour forcer, contraignant les partenaires et les conditions chimiques. En outre, la réaction biomécanique des domaines protéiques à l’intérieur des hydrogels ressemble à la réponse vue avec force de molécules simples techniques de spectroscopie. Par exemple, la liste des dénaturants chimiques et agents oxydants diminuent la stabilité de l’état plié, la seule protéine domaine niveau1,2,3 tant le macroscopique niveau4,5 , 6 , 7. de même, osmolytes augmenter la stabilité des protéines simples8,9, conduisant à une diminution de la réponse viscoélastique d’hydrogels, pour la même force conditions7,10.

Plusieurs approches ont été appliquées pour synthétiser des hydrogels à base de protéines, soit à l’aide d’interactions physiques11,12 ou covalente réticulation4,13. Covalentes réactions permettent des emplacements fixes de réticulation et ces hydrogels peut récupérer l’état initial après une suppression des perturbations mécaniques ou chimiques. Une approche réussie de réticulation covalente s’appuie sur la formation de liaisons covalentes carbone-carbone entre des acides aminés tyrosine exposés en utilisant le persulfate d’ammonium (APS) comme un oxydant et un sel de ruthénium (II) comme un initiateur (Figure 1)14. Lors de l’exposition à la lumière blanche, une solution de protéines concentrées peut être transformée en un hydrogel. En contrôlant lorsque la réaction commence, le mélange de protéine-APS peut être injectée dans toute forme de coulée, comme le polytétrafluoroéthylène (PTFE) tubes (Figure 1 b et 1C), permettant l’utilisation d’une solution extrêmement petit volume15. En outre, l’utilisation de la lumière blanche pour déclencher la réaction de réticulation entraîne un blanchiment limitée de protéines fluorescentes et permet la formulation d’hydrogels composites avec des marqueurs fluorescents (Figure 1). Autres méthodes de formation axée sur les protéines hydrogel utilisent réticulation basé sur le SpyTag-SpyCatcher interaction covalente16, amine réticulation par glutaraldéhyde13ou streptavidine-biotine interactions17.

Analyse mécanique dynamique (DMA) est actuellement une technique largement utilisée pour étudier à base de polymères hydrogels13,18. Tandis que DMA peut appliquer des protocoles de force constante aux biomatériaux, requiere modules de Young sur 10 kPa et volumes grand échantillon de plus de 200 µL19. En raison de ces limitations, hydrogels de protéine sont généralement trop faible pour être étudiés par cette technique. Car les polyprotéines machinés sont difficiles à synthétiser que polymères, car ils nécessitent un système vivant pour produire, ces grands volumes sont inefficaces, à meilleur4,15. En outre, la plupart des tissus biologiques sont plus douces que 10 kPa. Plusieurs approches ont été développées pour des échantillons biologiques, en particulier dans l’étude du muscle élasticité20,21. Ces techniques peuvent fonctionner également sous vos commentaires d’employer la force constante mais sont optimisés pour des échantillons de petit diamètre (de l’ordre du micron) exposés à la force pour des temps très courts (généralement inférieure à 1 s).

Hydrogels à base de protéines ont été étudiées avec succès avec des techniques modifiées rhéométrie. Par exemple, exprimer l’hydrogel dans une forme d’anneau permet l’utilisation de distension rhéométrie pour mesurer le changement dans l’équipe expérimenté en fonction de l’extension4,22. Autres approches pour étudier les propriétés rhéologiques des hydrogels à base de protéines utilisent rhéométrie contrôlé-la contrainte de cisaillement. Ces techniques peuvent également atteindre le volume de l’échantillon faible et tolérer les matériaux tendres. Cependant, ces méthodes manque la capacité à imiter le tirant force cette cause protéiques qui se déroule en vivoet module de Young est calculée en fonction des théories complexes qui nécessitent des hypothèses et corrections diverses23.

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche qui utilise une petite quantité de protéines, polymérisé à l’intérieur des tubes d’un diamètre < 1 mm. Notre première mise en œuvre de cette technique fonctionnait en mode collier en longueur, où le gel a été prolongé après le protocole désiré15. Dans cette méthode, les protéines éprouver un changement continu en extension et en force tandis que les domaines se déroulent, rendant l’interprétation des données encombrantes. Récemment, nous avons rapporté une nouvelle technique de rhéométrie pince-force, où une boucle de rétroaction peut exposer des hydrogels de protéine de faible volume à une force prédéfinies protocole no7 (Figure 2). Un système PID analogique compare la force mesurée par le capteur de force avec le point de consigne envoyé depuis l’ordinateur et permet d’ajuster l’extension du gel en déplaçant la bobine pour réduire au minimum la différence entre les deux entrées. Ce « bridage » de la force permet maintenant de nouveaux types d’expériences pour mesurer la biomécanique des hydrogels de protéine.

En mode force-rampe, un hydrogel de protéine captif connaît une augmentation constante et la diminution de la force avec le temps. Le PID compense toute déformation viscoélastique en changeant l’extension d’une manière non linéaire, selon le type de formulation de protéine et hydrogel. Le principal avantage de la rampe de la force, c’est qu’il permet la quantification des paramètres standards, tels que le module de Young et de dissipation de l’énergie, en raison d’un déploiement et le repliement de domaines protéiques.

En mode force constante, la force appliquée change dans une étape-comme la mode. Dans ce mode, le gel se prolonge et contrats élastiquement quand la force est augmentée ou diminuée, respectivement, suivie d’une déformation en fonction du temps. Cette déformation viscoélastique, qui aura lieu alors que le gel subit une force constante, est directement liée au domaine de dépliement/repliement. De façon simplifiée, cette extension peut être vu comme l’équivalent de plusieurs traces de molécules simples milliards en moyenne ensemble et mesurée à la fois. Force constante protocoles peuvent être utilisés pour étudier le fluage et relaxation des hydrogels de protéines en fonction de la force et l’heure. En fonction de la force, pour la protéine axée sur les BSA hydrogels, nous avons montré récemment qu’il y a une dépendance linéaire entre l’extension élastique et viscoélastique et recul avec la souche appliquée7.

Ici, nous détaillons le fonctionnement d’un rhéomètre de force-pince en utilisant des gels composites fabriqués à partir d’un mélange de protéines L (8 domaines24, dépeinte comme L8) et une construction de protéine L-eGFP (L-eGFP), ce qui rend l’hydrogel globale fluorescent et facile à démontrer.

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Protocol

1. préparation de la Solution réactifs

  1. Préparer une solution de protéine départ en dissolvant/diluant de la protéine d’intérêt de la concentration désirée, à l’aide d’un tampon Tris [tris (hydroxyméthyl) aminométhane de 20 mM et 150 mM NaCl, pH 7.4].
    NOTE : La plus petite concentration de protéines de réticulation menant à hydrogels dépend de la protéine utilisée et est généralement > 1 mM.
  2. Préparer des stocks de persulfate d’ammonium (APS) (1 M) et le chlorure de tris(bipyridine)ruthenium(II) ([Ru(bpy)3]2 +) des solutions en dissolvant APS (6,67 mM) et [Ru(bpy)3]2 + poudres dans le tampon Tris.

2. base de protéines de synthèse Hydrogel

  1. Fixer une aiguille 23 G sur une seringue de 1 mL avec un piston de pressée.
  2. Couper un tube de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 10 cm (avec un diamètre intérieur de 0,022 à et un diamètre extérieur de 0,044 dans) à l’aide d’une lame de rasoir. Fixer l’aiguille et la seringue à une extrémité du tube PTFE.
  3. Insérez la deuxième extrémité du tube dans une solution de silane et remplir le tube en rétractant le piston de la seringue. Maintenir le tube pendant environ 30 min.
  4. Enlever la solution de silane et sécher le tube d’air comprimé.
    Remarque : Assurez-vous que toute la solution de silane est séché et qu’aucun résidu ne reste dans le tube.
  5. Mélanger la solution de protéines avec APS et [Ru (bpy) 3]2 + dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’un ratio volume constant [par exemple, 15:1:1 ou 15:0.5:0.5 (v : v : v)].
  6. Vortex la solution photoactif jusqu'à ce qu’il se mélange complètement.
  7. Centrifuger le mélange à vitesse maximale (par exemple, 14 000 x g) pour supprimer toutes les bulles de la solution.
  8. Insérez l’extrémité ouverte du tube PTFE traité dans le mélange photoactif et dessiner la solution dans le tube en rétractant le piston de la seringue.
  9. Placer le tube chargé ~ 10 cm distance une lampe à mercure 100 W pour prévenir chauffant et y maintenir jusqu'à 30 min à température ambiante (Figure 1 b).
    Remarque : Dans certains cas, la durée d’exposition à la lumière peut être aussi faible que 30 s. temps de gélification plus courts sont utilisés ici pour les gels fluorescents, pour limiter le photoblanchiment.
  10. Retirer le tube de l’aiguille et couper les bords du tube près des extrémités de l’hydrogel avec une lame de rasoir.
  11. Utiliser une aiguille de 24 G atténuée pour extruder l’hydrogel dans la solution de Tris (Figure 1).
    NOTE : Blunted aiguilles servent à éviter des encoches ou endommagement de l’échantillon d’hydrogel.
  12. Inspecter visuellement les gels tous les défauts susceptibles de former pendant l’extrusion ou en raison de bulles et de jeter les gels présentant des défauts.

3. base de protéines Hydrogel attachement et Force-pince rhéomètre Set-up

  1. Démarrez le programme de contrôle d’instrument. Allumez le moteur de la bobine. Régler la position de la bobine sur une valeur vers la fin de la plage (par exemple, 7,5 mm).
    Remarque : La position de la bobine est recommandée d’être vers la fin de la gamme de mouvement maximale, afin de maximiser l’extension éventuelle de l’hydrogel.
  2. Déplacer les crochets dans la z-direction et alignez-les au détour de la x-direction (qui est la coordonnée de traction ; voir Figure 2 b). Enregistrez les valeurs des vis micrométrique pour le x-direction.
  3. Couper 2 sutures stériles en brins de longueur égale (2-3 cm ; voir les figures 3 a et B).
  4. Attachez un demi-nœud double lâche dans chacun des volets et placez les 2 boucles sur le crochet connecté le capteur de force (Figure 3 et 3D).
  5. Remplir la chambre expérimentale avec un tampon Tris et transférer l’échantillon de l’hydrogel dans la chambre remplie à l’aide de brucelles médicale.
  6. Placer la bobine de voix et forcer les crochets capteur près de la surface de la solution et alignez les crochets dans toutes les directions en utilisant le x/y/z-positionnement des manipulateurs.
  7. Utilisez des pinces médicales, accrocher les deux côtés de l’échantillon d’hydrogel de protéines sur les crochets reliés à la voix de bobine et force sensor (Figure 3).
  8. Serrer 1 boucle de suture autour de l’échantillon d’hydrogel sur le crochet de bobine de voix en tenant les deux extrémités de la boucle de suture avec des pincettes médicaux et en les tirant simultanément (Figure 3D).
  9. Répétez l’étape 3,8 pour la boucle reliée à la capteur de force (Figure 3D).
    NOTE : Éviter un resserrement extrême de la suture pour prévenir tout dommage structurel et coupe transversale de l’échantillon d’hydrogel.
  10. Serrer les boucles de suture dans les virages du chaque crochet afin d’éviter tout glissement ; utiliser ces virages comme référence pointe vers trouver nulle la séparation entre les crochets à l’étape 3.2. Couper la longueur excessive des sutures à l’aide de ciseaux médicaux (Figure 3D).
  11. Déplacer l’hydrogel attaché à l’aide de z-manipulateurs le long de la z-axe vers la chambre expérimentale de plonger l’hydrogel dans la solution expérimentale.
  12. Aligner l’échantillon hydrogel en y-z en utilisant les manipulateurs tels que le gel n’est pas sous tension.
  13. Zéro du capteur de force et de séparer les deux crochets en utilisant le x-micromètre met en scène jusqu'à ce que le gel commence à force d’expérience. Dès lors, légèrement demi-tour la vis micrométrique au x-direction.
  14. Enregistrer la position de deux manipulateurs pour le moteur à bobine et le capteur et la différence entre ces valeurs et celles mesurées à l’étape 3.2 permet de calculer la séparation exacte entre les crochets attacher au début de l’expérience.
  15. Définir l’amplitude de la courbe de mou à ~1.5 - 2 mm et mesurer le gel mou (Figure 4 a).
    Remarque : Pour chaque mesure mou, essayez de garder le début du régime lâche près de la position de bobine de voix initiale, permettant un nombre optimal de points de données pour adapter les 2 régimes (Figure 4 a). La longueur du gel peut être déterminée avec une résolution de microns à l’aide de la séparation entre les crochets et l’intersection entre les 2 régimes le mou de la courbe (voir aussi l’étape 5.1). Le capteur de force pourrait dériver avec le temps en raison des variations dans les conditions expérimentales, la partie de la courbe mou où le gel n’est pas sous force de rapports sur cette dérive possible. Le programme de contrôle de l’appareil compense automatiquement cette différence lors de l’envoi de la commande de point de consigne à la boucle de PID (encart de laFigure 4 a ).

4. base de protéines Hydrogel caractérisation à l’aide de la Force-rampe contrôlée et les mesures de Force constante

  1. Expériences de force-rampe
    1. Pour effectuer un cycle de force-rampe en augmentant la force à la vitesse de chargement désirée (par exemple, 0,01 mN/s), l’entrée les forces départ et finales et la durée du protocole comme un « V » inversé. Puis, maintenez le gel à 0 mN (ou force faible) > 200 s permettre les domaines protéiques de repli et de l’élasticité de gel pour récupérer.
    2. Enregistrer la trace.
  2. Expériences de force constante
    1. Effectuer un protocole force constante en appliquant une force faible (p. ex., 0,1 mN) pour 30 s et puis augmenter la force à une force constante (par exemple, 1 mN) pendant un temps défini (par exemple, 120 s), suivie de la trempe de la force vers le même faible valeur (p. ex., 0,1 mN) > 300 s permettre les domaines protéiques de repli et de l’élasticité de gel pour récupérer.
    2. Suite à la première impulsion, régler les paramètres de PID pour maximiser le temps de réponse de la rétroaction en boucle (voir Figure 2D).
      Remarque : Pour les gels rigides et de petits changements en vigueur, le temps de réponse de la boucle est limité par l’électronique du capteur de force et le temps de réponse de la bobine et peut être aussi faible que 5 ms7. Pour les gels plus douces et des changements importants en vigueur, le temps de réponse est dicté par l’élasticité de l’hydrogel (Figure 2D).
    3. Enregistrer la trace.

5. analyse

  1. Utilisant la séparation mesurée entre les crochets et la position de la bobine calculée, quand le gel commence à éprouver la force (Δx dans l’encart de la Figure 4 a ), calculer la longueur de gel de L à l’aide de l’équation :
    L = L0 + ∆x
    Ici, L0 est la séparation entre les crochets, mesurée à partir de la position des vis micrométrique avant l’expérience (étape 3.14).
    Remarque : Pour les gels avec des concentrations de faible teneur en protéines qui n’aboutissent pas à une réticulation complète, la longueur mesurée passe de trace-de-trace. Aussi, sur de longues périodes de temps, les protéines à l’intérieur des hydrogels peuvent rencontrer des effets de vieillissement25, qui résultent en un allongement global du gel.
  2. Normaliser l’extension mesurée à la longueur du gel afin d’obtenir de la souche.
  3. Normaliser la force mesurée à la surface transversale en utilisant le diamètre intérieur du tube utilisé pour la polymérisation.

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Representative Results

Figure 1 a montre le schéma de la réaction photoactif utilisée pour synthétiser l’hydrogel de8 L-EGP/L. Figure 1 b montre le mélange hydrogel dans le tube PTFE, avant et après la photoactivation. La figure 1 présente l’hydrogel de8 L-eGFP-l extrudé à l’intérieur d’une solution de Tris. L’exemple de l’hydrogel n’a aucun défauts structuraux tels que les encoches. Hydrogels montrant clairement visibles de dommages doivent être jetés.

Le rendu de l’assemblé et les vues éclatées du rhéomètre pince-force sont présentés dans la Figure 2 a et 2 b. Figure 2 montre le schéma de rhéomètre pince-force, où l’échantillon d’hydrogel est attaché entre les crochets reliés à la bobine linéaire et le capteur de force et immergé dans une solution tampon. Le système PID analogique permet d’ajuster l’extension hydrogel en contrôlant la position linéaire-bobine mobile pour suivre la consigne de force. Figure 2D montre le réglage du PID en utilisant des incréments différents pour le gain intégral.

La figure 3 montre un processus de fixation typique d’un échantillon d’hydrogel. Après attacher l’hydrogel entre les crochets alignés, les boucles de suture sont serrées autour de l’hydrogel près les coudes pour que l’échantillon ne glisse pas et afin de permettre la détermination précise de la longueur de l’hydrogel.

Force-rampe mesure et analyse des Hydrogels à base de protéines :
Des mesures représentatives du protocole force-rampe sont indiquées dans la Figure 4 a - 4C. Chaque appui sur la nouvelle commence par une mesure de mou, comme illustré à la Figure 4 a. Ensuite, la courbe force est obtenue en appliquant un protocole de « V » inversé, que la charge augmente et diminue de façon linéaire avec le temps. Par la suite, l’hydrogel est tenue à une force 0 mN pour 200 s, afin de permettre les domaines protéiques à l’intérieur de l’échantillon d’hydrogel à replier (Figure 4 b). Au cours du stress, le système PID modifie l’extension hydrogel représentée par la position de la bobine à suivre la consigne de force prédéfinies. Pour chaque courbe mou, nous nous situons à 2 lignes (Figure 4). La ligne bleue est utilisée pour s’adapter au premier régime lorsque l’hydrogel recule et la ligne orange est utilisé pour adapter le régime lorsque l’hydrogel devient mou. L’intersection entre les deux lignes est utilisée pour calculer la longueur de vrai gel avec une résolution de micromètre (Figure 4 a). Par la suite, l’extension de l’échantillon d’hydrogel est calculée en soustrayant la position initiale de bobine de la trace de position bobine (Figure 4). Figure 4F présente la courbe contrainte-déformation. Le stress est calculé en divisant la force appliquée par la section transversale de l’échantillon d’hydrogel et la souche est calculée en divisant l’extension (Figure 4E) par la longueur de vrai gel calculée à partir de la courbe de mou tel que présenté dans Figure 4 a .

Mesure de force constante et d’analyse des Hydrogels à base de protéines :
Des mesures représentatives d’un protocole de force constante sont affichés dans Figure 5 a - 5 D. Une force constante du 0,1 mN est appliquée à l’échantillon d’hydrogel pour 30 s, la force est ensuite remplacé 1 mN pour 120 s et enfin, la force est piégée à 0,1 mN pour 300 s pour permettre les domaines protéiques à replier (Figure 5 a). Pendant les 30 premiers s à faible vigueur, il n’y a aucun changement notable dans l’extension du gel. Lors de l’augmentation de la force à 1 mN, l’hydrogel montre une extension rapide élastique. Après cette extension initiale, l’hydrogel continue qui s’étend au fil du temps, tout en gardant la constante de force (1 mN). Par la suite, la force est trempée à la valeur initiale faible (0,1 mN) et l’hydrogel reprend sa longueur initiale (Figure 5 b). L’extension de l’échantillon de hydrogel (Figure 5) et la force sont utilisés pour calculer la souche (en haut) et le stress (en bas) de la même façon que dans la mesure de la rampe force (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : L-eGFP/(L)8-base synthèse hydrogel. (A), ce panneau montre les schémas d’une L-eGFP/(L)8 hydrogel la synthèse des protéines à l’aide d’une réaction de photoactivation. La protéine est mélangée avec APS et [Ru(bpy)3]2 + et exposé à la lumière blanche, qui favorise la formation de liaisons covalentes entre des acides aminés tyrosine adjacent (en médaillon). (B) Ce panneau montre un L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +- et APS-mélange de charger dans un tube PTFE à l’aide d’une aiguille 23 G avant l’exposition à la lumière blanche (en haut) et après (en bas). (C) Ce panneau montre un extrudé L-eGFP/(L)8-base hydrogel dans une solution de Tris. L’encart montre une image agrandie de L-eGFP/(L)8-base d’hydrogel. La distribution des diamètres est de 552 ± 8 μm, en accord avec le diamètre intérieur du tube PTFE utilisé au cours de la polymérisation (558 μm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Force-pince rhéomètre conception et mise en place. (A) affichage du rhéomètre de hydrogel assemblé-pince à force. L’encart montre un exemple d’hydrogel à base de protéines jointe à la voix en rouleaux et force les crochets du capteur à l’intérieur de la chambre de la solution. (B) rendu de la vue éclatée du rhéomètre de hydrogel-pince à force : (a - c) x-y-z manipulateurs permettant d’ajuster la bobine crochet position, moteur (d) la bobine linéaire, transducteur (e) la force, (f) la force porte-transducteur, chambre (g) la solution, et (h - je) le x-y manipulateurs pour ajuster la position de capteur de force. (C) schéma de l’installation de rhéomètre hydrogel-pince à force. Le schéma montre un échantillon d’hydrogel à base de protéines attaché à un capteur de force et bobine de crochets à l’aide de sutures médicales. Le système PID analogique modifie la longueur d’hydrogel en ajustant la position de la bobine pour suivre la consigne de force. Réponse du système (D), PID utilisant différentes valeurs d’integral-gain (j’ai) pour atteindre la force la valeur point (ligne pointillée). Les traces de couleurs représentent la force mesurée (en bas) et la souche (en haut) dérivée de la réponse du système PID. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L-eGFP/(L)8-selon le processus d’attachement hydrogel. Gros plan (A) Découvre d’une boucle de suture, à égalité avec un double nœud lâche utilisé pour fixer l’échantillon hydrogel aux crochets. (B) les deux boucles de suture sont placés sur le crochet de capteur de force utilisé dans l’attachement d’hydrogel à base de protéines. (C), un L-eGFP/(L)8-échantillon de base hydrogel est accrochée entre les crochets (indiquées par les flèches). (D) la suture effectue une boucle sur le côté de la bobine (à gauche) et le crochet de capteur de force (à droite) sont serrées autour de l’échantillon d’hydrogel au détour de chaque crochet pour que l’échantillon ne glisse pas pendant les mesures. Par la suite, les sutures excédentaires sont taillés à l’aide de ciseaux médicaux (indiqué par les flèches rouges). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Force représentative-rampe mesure et données analyse courbes pour un L-eGFP/(L)8-base hydrogel échantillon. (A) courbe typique mesure mou (rouge) permise de déterminer la zéro force du capteur de force et la longueur réelle de l’hydrogel. Deux courbes linéaires (le bleu et les lignes orange) sont utilisés pour adapter les deux régimes : Premièrement, quand le gel est en vigueur (ligne bleue) et d’autre part, lorsque le gel devient mou (ligne de plateau - orange). L’intersection entre les deux lignes est utilisée pour calculer la longueur de vrai hydrogel à zéro force. La flèche indique le sens de la motion. L’encart montre l’emplacement de la force de zéro et la correction de la longueur de l’hydrogel. Courbe de force-rampe représentatif (B) appliquée à l’échantillon de l’hydrogel. (C) Trace correspondant au déplacement de la position bobine en fonction du temps. La spirale commence à partir de la position initiale définie dans le protocole à l’étape 3.1 (7,5 mm). (D) courbe représentative de l’extension de l’échantillon d’hydrogel en fonction du temps. L’extension est calculée comme le déplacement entre la position de bobine mesurée et sa position initiale. (E) représentant la souche -versus-courbe de temps. La souche est calculée en divisant l’extension par la longueur de vrai gel calculée à partir de la mesure de mou. (F) les courbe de contrainte-déformation représentatif d’un échantillon d’hydrogel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : analyse de données et de mesure de force constante. (A) trace représentative du protocole force constante appliqué à un hydrogel. L’hydrogel est exposé à 0,1 mN pendant 30 s, puis la force est augmentée à 1 mN pour 120 s et enfin, la force est piégée à 0,1 mN pour 300 s. (B), ce panneau affiche un enroulement position trace par rapport à la fois représentant le changement dans la longueur de l’h ydrogel échantillon en suivant le protocole de force. (C) ce panneau montre l’extension gel mesurée du déplacement de la bobine. (D) la figure représentative du stress (en bas) et des traces de souche (en haut) après l’analyse des données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ici, nous décrivons une technique de rhéométrie force-clamp pour étudier la réaction biomécanique des hydrogels basées sur les protéines de faible volume. De plus, un protocole est fourni pour synthétiser un échantillon d’hydrogel de protéine de faible volume cylindrique uniforme. Un protocole est également présenté qui décrit comment attacher les différents types d’hydrogels base de protéines avec des élasticités différentes sans provoquer des déformations mécaniques ou des dommages pour les échantillons d’hydrogel à base de protéines ou le glissement du gel sur les crochets. Le système PID analogique, ainsi que la bobine linéaire et le capteur de force, permettre à l’application de protocoles de force contrôlée comme rampe de force et de la force constante. Récemment, cette technique a été utilisée pour étudier la réaction biomécanique des différentes concentrations réticulées d’hydrogels axée sur les BSA dans différentes solutions expérimentales7.

Un aspect important lorsqu’il formulera et travaillant avec les hydrogels de protéines est la reproductibilité des mesures. Si les gels sont formulés avec une concentration de protéines trop faible ou réticulation incomplète, des déformations plastiques permanentes apparaît pendant l’extension7. Ces déformations plastiques limiterait considérablement l’interprétation de données, comme les effets de viscoélastique venaient à la fois le déroulement du domaine et le réarrangement moléculaire à l’intérieur du gel. Un test simple pour voir si ya complète réticulation est d’immerger l’hydrogel en dénaturants chimiques, par exemple de chlorure guanidinium 6 M1. Dans ce cas, il faut éviter tout effet viscoélastique dans le stress -versus-souche courbes, comme tous les domaines sont dépliés chimiquement, et les molécules sont comportent désormais comme des polymères simple4,7,26. Par ailleurs, le gel devrait récupérer son élasticité initiale lorsqu’immergé dans le tampon initiale7.

S’il y a des variations dans la réponse mesurée entre les traces obtenues avec différents gels, plusieurs aspects devraient considérer pour dépannage : l’agrégation de protéines en solution, un mélange non homogène de la protéine avec la mise en réseau produits chimiques, la présence de bulles, la liaison de l’hydrogel basées sur les protéines dans le tube PTFE en raison de silanisation incorrect. Résidus de silane sur les parois du tube peuvent contaminer l’hydrogel et conduire à des défauts structurels. Pour éviter cette erreur, plus d’air comprimé est nécessaire pour assurer un retrait total du silane du tube. En outre, bulles peuvent se former lors de l’aspiration du mélange dans le tube PTFE photoactifs hydrogel. Ces bulles peuvent conduire à échantillonner les dégâts et affecter la réponse biomécanique de l’hydrogel. Pour éviter toute formation de bulles, l’extrémité du tube PTFE doit être à l’intérieur du mélange de la solution pendant le processus de chargement et le piston de la seringue doit être rétracté lentement. Une autre erreur typique est un serrage excessif des boucles de suture autour de l’hydrogel des échantillons pendant le processus d’attachement, qui peut conduire à une formation de l’encoche et la coupe de l’hydrogel. La gamme de mouvement de la bobine de voix limite l’extension maximale de l’échantillon d’hydrogel ci-joint. Cette limitation doit être pris en compte lors de la mesure des gels qui s’étendent à plusieurs centaines pour cent de leur longueur initiale. Par exemple, pour étendre un hydrogel pour plus de 200 %, une longueur initiale de moins de 4 mm est nécessaire.

Hydrogels à base de protéines sont une classe unique de biomatériaux en raison de leur biocompatibilité et extensibilité élevée provenant de protéines, leurs unités de bâtiment principal et la transition de pliage inhérente qui est caractéristique pour les protéines. En outre, ces hydrogels ont un excellent potentiel pour l’ingénierie tissulaire et systèmes de livraison de médicaments biologiques d’encre (bioink) pour l' impression 3D27. Le rhéomètre de hydrogel-pince à force peut être utilisé pour enquêter sur une grande variété de protéines. En outre, le rhéomètre de force-pince permet à l’application de protocoles de force constante sur des échantillons de faible volume hydrogel. Ces expériences permettent le découplage des comportements élastique et viscoélastique et étudient la mécanique pliable (ONU) dans une approche en vrac.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons l’appui financier de recherche Initiative de croissance (prix no 101 X 340), National Science Foundation, programme d’Instrumentation de recherche majeurs (Grant No. PHY-1626450), Greater Milwaukee Foundation (Prix Shaw) et le système de l’Université du Wisconsin (subvention de recherche appliquée).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SI-KG4A force transducer World Precision Instruments (WPI) SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor Equipement Solutions LFA2010
Bovine serum albumin Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma Sigma-Aldrich T1503-1KG
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653-1KG
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride Sigma-Aldrich 544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK Fisher Scientific NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip BD 309628
Silane, Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge Healthcare Supply Pros 305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge KIMCO JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp ALB USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.

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References

  1. Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
  2. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  3. Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
  4. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  5. Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
  6. Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
  7. Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
  8. Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
  9. Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
  10. Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
  11. Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
  12. Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
  13. Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
  14. Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
  15. Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
  16. Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
  17. Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
  18. Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
  19. Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
  20. Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
  21. McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
  22. Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
  23. Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
  24. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
  25. Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
  26. Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
  27. Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).

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Rhéométrie force-pince pour caractériser les Hydrogels à base de protéines
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