Summary
여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.
Abstract
그것은 구조 및 생화학 연구 재조합 분 비 진 핵 단백질을 표현 하는 과학자에 대 한 도전이 되었습니다. 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 일부 포스트 번역 상 수정 재조합 진 핵 세포 분 비 단백질을 표현 하는 데 사용 하는 시스템 중 하나입니다. 분 비 단백질 단백질 glycosylation, 이황화 결합 형성, 및 다른 포스트 번역 상 수정 분 비 경로 통해 라우팅할 필요가 있다. 를 개선 하기 위해 분 비 식물 단백질의 기존 곤충 세포 표현 잠재 식 벡터 중 하나는 GP67의 추가 또는 발기인 및 다중 복제 사이트 간에 hemolin 신호 펩 티 드 순서에 의해 수정 됩니다. 이 새롭게 설계 된 수정된 벡터 시스템은 성공적으로 애기 thaliana의 수용 성 재조합 분 비 식물 수용 체 단백질의 높은 수익률을 생산. 두 애기 TDR 및 PRK3 원형질 막 수용 체의 세포 외 도메인 표현된 식물 단백질의 x 선 결정학 연구 화 시키는 했다. 수정 된 벡터 시스템 뿐만 아니라 동물의 왕국에 있는 재조합 형 분 비 단백질의 표정을 위해 잠재적으로 이용 될 수 있는 향상 된 도구입니다.
Introduction
특히 x 선 결정학 연구에 대 한 생화학 및 생물 characterizations 위해 균질 재조합 단백질의 대량 생산의 수 연구 실험실을 위한 필수적입니다. 대장균, 효 모, 곤충 세포, 포유류 세포, 식물 세포, 등 그들의 사이에서 많은 확고 분리 식 시스템, 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템은 가장 중 일반적으로 구조적으로 접힌된 대형 재조합 진 핵 단백질의 단백질 결정 화1대량 생산 기법을 사용.
잠재 식 시스템의 식 벡터는 강한 polyhedrin 또는 재조합 세포내 단백질2,3의 높은 수익률을 생산 하는 P10 발기인을 포함 하도록 설계 되었습니다. 재조합 잠재 수 있도록, 관심사의 유전자 Autographa californica nucleopolyhedroviral 멀티 게놈의 polyhedrin (polh) 로커 스를 포함 하는 곤충 벡터에 복제 됩니다. 결과 구문 다음 시퀀스 및 올바른 열려있는 독서 프레임 (ORF) 확인. 올바른 구문 다음 transfection의 과정을 통해 호스트 곤충 세포에 도입 되었습니다. 관심사의 유전자는 상 동 재조합에 의해 바이러스 성 게놈에 삽입 됩니다. 이 이벤트는 재조합 생산 하는 후 복제 바이러스 입자1언약궤 재조합 형 바이러스 성 게놈의 생산에서 발생 합니다.
곤충 세포 표현 시스템에서 가장 일반적으로 사용 되는 Sf9 및 높은 5 (Hi5) 세포 이다. Sf9 세포는 Sf21, Spodoptera frugiperda의 번데기 난소 세포에서 파생 된의 클론 분리 되며 Hi5 세포 클론 분리는 부모의 Trichoplusia ni 난소 세포 선 테네시-3684,5에서 파생 된. Hi5 셀 일반적으로 재조합 단백질6의 더 높은 양을 생성을 선택 하는 동안 공동 transfections, 바이러스 증폭 및 상 패 분석 실험, Sf9 세포에 지휘 된다. Hi5 세포는 돌연변이 바이러스를 생산 하는 그들의 추세 때문에 세대 및 바이러스 progenies의 증폭에 적합 하지 않습니다 지적 가치가 있다. 전통적으로, 25-30 ° C의 온도 범위는 곤충 세포의 경작에 좋은 것으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 27-28 ° C 곤충 세포 성장과 감염7,8에 대 한 최적의 온도 보고 되었습니다.
강한 신호 순서 선행 하는 유전자의 소개 secreted 단백질의 높은 식이 필요 합니다. 신호 순서 효율적으로 단백질 분 비와 포스트 번역 상 수정 적절 한 접는 및 안정화3에 필요한에 대 한 바인딩과 그물에 번역 된 재조합 단백질을 안내 것입니다. 신호 펩 티 드 순서는 잠재 봉투 단백질 GP64/67, 꿀벌 melittin, 그리고 다른 사람, 같이 잠재 중재 식 시스템3분 비 재조합 형 단백질의 표정을 촉진 하기 위해 선택 되었습니다. GP67의 신호 펩 티 드의 도입 대상 유전자9의 내장 신호 펩 티 드를 사용 하 여 비교 secreted 재조합 단백질의 식 수율을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. Hemolin는 거 대 한 실크 나 방 Hyalophora cecropia, 박테리아 감염10시 유도의 hemolymph 단백질 이다. 유도 식의 상대적으로 높은 수준으로 인해 유전자의 신호 펩 티 드 순서 잠재 곤충 세포 시스템에서 재조합 단백질의 분 비 식 중재에 사용할 수 있습니다.
A. thaliana Tracheary 요소 차별화 금지 요인 수용 체 (TDR)와 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 둘 다 단백질11,12의 식물 신 부유한 반복 같은 수용 체 키 니 아 제 (LRR-RLK) 가족에 속하는 . 구조와 공장 수용 체 단백질의, 뿐만 아니라 다른 식물 분 비 단백질의 구조 및 생 화 확 적인 특성 있을이 가족의 기능을 공부 하기 위하여 잠재 곤충 세포 표현 시스템 수정 되었습니다. 단백질의 품질 및 생산 수율을 향상 시킵니다. TDR 및 PRK3의 세포 외 도메인 성공적으로 두 개의 수정된 식 벡터를 사용 하 여 잠재 곤충 세포 표현 시스템에서 표현 되었습니다. TDR 및 PRK3 단백질의 extracellular 도메인 모두 화 시키는 되는. 이 문서는 GP67 또는 발기인 및 여러 복제 사이 hemolin 신호 순서를 통합 하 여 표현과 많은 양의 두 수정된 잠재 식 벡터와 재조합 분 비 식물 단백질의 정화를 보고 사이트입니다.
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Protocol
참고: 분 비 식물 단백질 표정 및 결정 화에 대 한 수정 된 식 벡터와 곤충 셀/잠재 시스템 사용 됩니다.
1. 식물 단백질 분 비 식 GP67 신호 펩 티 드와 잠재 식 벡터의 수정
- 5' BglII 절단 사이트13, GP67 분 비 신호 순서, 노트, BamHI, EcoRI, StuI, 사리, SpeI, XbaI, PstI, 및 XhoI (그림 1A)의 다중 복제 사이트를 포함 하는 DNA 파편을 음성 합성.
참고: BglII와 BamHI 소화 이후 같은 접착제 끝 귀착되 었 다 DNA, 선형화 벡터 단련된 결 찰 순서에 BglII 및 BamHI 사이트 여 쪼갤은 시퀀스를 변경 될 것입니다 하는 동안 소화 DNA 단편에 선 수 있습니다. BglII 또는 BamHI14. - BglII와 XhoI, DNA의 다이제스트 4 µ g 그리고 BamHI 및 XhoI14는 식 벡터 DNA의 4 µ g. Dna 농도 반응 버퍼 (50mm 칼륨 아세테이트, 20 mM 트리 아세테이트, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 25 ° C에서) x 1에 각 제한 효소의 10 단위를 혼합 하 고 37 ° C 4 h에서 혼합물을 품 어.
- 삭제 DNA 파편 및 선형화 벡터 DNA는 DNA 젤 추출 키트15정화.
- 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 x T4 DNA 리가 반응 버퍼 (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1 ATP, 그리고 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° C에서)와 T4 DNA의 5 대 1을 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서 조각 리가입니다. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. 5-10 식민지를 선택 하 고 220 rpm 및 16 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 파운드 매체의 2 mL에 각 식민지를 성장.
- DNA miniprep 키트17 각 플라스 미드 DNA를 추출 하 고 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG 뇌관 DNA 연속 클론을 확인.
- PCR 증폭 A. thaliana TDR 유전자 조각 인코딩 잔류물 구성 합성 TDR 유전자에서 30-642 (뇌관을 앞으로: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, 반전 뇌관: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). 0.5 m m dNTP 믹스, 0.2 µ M 뇌관, 템플릿 DNA의 0.1 µ g, 0.4 m m MgCl2및 DNA 중 합 효소의 1 반응 단위를 포함 하는 DNA 중 합 효소 반응 버퍼에 30 사이클에 대 한 DNA를 증폭.
- 95 ° c 30에 대 한 초기 변성 PCR 주기 단계에 대 한 설정 들, 그리고 다음 30 주기 변성 95 ° C에서 30 s, 30 s 및 1 분에 72 ° C에서 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 확장에 대 한 55 ° C에 어 닐 링.
- PCR 파편 및 노트와 BamHI 제한 endonuclease 효소 수정된 벡터 다이제스트. 선형화 벡터와 유전자 단편 선 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 조각 T4 DNA 리가 반응 버퍼 및 T4 DNA 리가의 5 단위를 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. DNA 시퀀싱에 의해 정확한 복제를 확인 합니다.
2. 식물 단백질 분 비 식 곤충 Hemolin 신호 펩 티 드와 잠재 식 벡터의 수정
- 5' BglII 절단 사이트13, 곤충 hemolin 분 비 신호 순서, 노트, BamHI, EcoRI, StuI, 사리, SpeI, XbaI, PstI, 및 XhoI (그림 1B)의 다중 복제 사이트를 포함 하는 DNA 파편을 음성 합성.
- BglII와 XhoI, DNA의 다이제스트 4 µ g 그리고 BamHI 및 XhoI14는 식 벡터 DNA의 4 µ g. Dna 농도 반응 버퍼 (50mm 칼륨 아세테이트, 20 mM 트리 아세테이트, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 25 ° C에서) x 1에 각 제한 효소의 10 단위를 혼합 하 고 37 ° C 4 h에서 혼합물을 품 어.
- 삭제 DNA 파편 및 선형화 벡터 DNA는 DNA 젤 추출 키트15정화.
- 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 x T4 DNA 리가 반응 버퍼 (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1 ATP, 그리고 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° C에서)와 T4 DNA의 5 대 1을 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서 조각 리가입니다. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시에 식민지를 선택 합니다. 5-10 식민지를 선택 하 고 포함 하는 100 µ g/mL 암 피 실린 220 rpm 및 16 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서의 2 mL 파운드 매체에 각 식민지를 성장.
- DNA miniprep 키트17 플라스 미드 DNA를 추출 하 고 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG 뇌관 DNA 연속 클론을 확인 합니다.
- PCR 증폭를 A. thaliana 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 유전자 조각 잔류물 20-237 합성 PRK3 유전자 구성에서 인코딩 (뇌관을 앞으로: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, 반전 뇌관: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC)입니다. 0.5 m m dNTP 믹스, 0.2 µ M 뇌관, 템플릿 DNA의 0.1 µ g, 0.4 m m MgCl2및 DNA 중 합 효소의 1 반응 단위를 포함 하는 DNA 중 합 효소 반응 버퍼에 30 사이클에 대 한 DNA를 증폭.
- 초기 변성 95 ° C 30에 대 한 설정에 대 한 PCR 주기 단계 s, 그리고 다음 30 주기 변성 95 ° C에서 30 s, 30 s 및 30에 대 한 72 ° C에서 확장 하는 55 ° C에서 어 닐 링 각 주기 및 5 분 동안 72 ° C에서 마지막 확장 내에서 s.
- PCR 파편 및 노트와 BamHI 제한 endonuclease 효소 수정된 벡터 다이제스트. 선형화 벡터와 유전자 단편 선 400 선형화 벡터 DNA의 믹스 100 ng ng 소화 DNA의 조각 T4 DNA 리가 반응 버퍼 및 T4 DNA 리가의 5 단위를 포함 하는 10 µ L 결 찰 반응 혼합물에서. 16 h 16 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- 100 µ L DH5α 유능한 세포 표준 변환 프로토콜을 다음의 결 찰 혼합물의 5 µ L를 변환 하 고 암 피 실린-파운드 한 접시16에 결과 식민지를 선택 합니다. DNA 시퀀싱에 의해 정확한 복제를 확인 합니다.
3. 생산 및 잠재의 증폭 재조합 형 단백질 표정 카세트를 품고 생성
- DH10Bac 유능한 세포 잠재 식 시스템1의 프로토콜을 다음의 40 µ L 변환 구문 플라스 미드의 사용 100 ng. 48 h에 대 한 37 ° C에서 변환 접시를 품 어.
- 각 변환 플레이트에서 두 개의 백색 식민지를, 각 식민지 파운드 매체 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin, 그리고 10 µ g/mL 항생물질의 2 mL에 접종. 추출 하 고 bacmid DNA 확인 잠재 식 시스템1 의 프로토콜을 따릅니다. Aliquot 20 µ L 각와 함께 두 개의 튜브에서 각 DNA-20 ° c.에 튜브를 저장
참고: 다음 단계는 무 균 작업이 필요합니다. - 27 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 µ g/mL (또는 100 I.U./mL) 문화 미디어 스 페니실린 항생제에 Sf9 세포의 단층 6 잘 플레이트 합류 점 80% 성장. 합류의 조직 문화 접시에 덮여 영역 비율에 따라 백분율을 예상 하고있다.
- 2 살 균 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
- 1 관: 각 transfection에 대 한 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 100 µ L로 bacmid DNA의 20 µ L 희석. 튜브의 측면을 터치 하 여 희석을 부드럽게 혼합.
- 2 관: 각 transfection에 대 한 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 100 µ L로 지질 transfection 시 약의 8 µ L를 희석. 6 x를 위아래로 pipetting으로 희석을 철저 하 게 혼합.
- 두 솔루션을 결합, 3 x를 위아래로 천천히 pipetting으로 그들을 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 20-40 분 동안 그들을 품 어.
- 각 잘 Sf9 단층의 세포 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 3 mL 2 x 세척. 각 transfection 지질-DNA 혼합물을 포함 하는 각 관에 항생제 없이 unsupplemented Sf9 세포 배양 매체의 0.8 mL를 추가 합니다. 3 x를 위아래로 천천히 pipetting으로 튜브의 내용의 부드럽게 혼합. Transfection 혼합 샘플을 오버레이 및 격판덮개에서 세척 미디어 발음.
- Transfection 혼합물의 추가 후에 품 어 27 ° c.에 5 h transfected 플레이트 10 %FBS 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 포함 된 완전 한 Sf9 세포 배양 매체 transfection 미디어 바꿉니다 항생제 페니실린 스. 4 d 27 ° C에서 transfected 접시를 품 어.
- 수확 하 고 재조합 잠재 증폭.
- 외피의 4 d 후 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 1010 x g 세포 파편을 제거 하 5 분에 상쾌한 스핀. 펠 릿을 삭제 하 고 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 4 ° C에서 최대 1 년 동안 그것을 저장.
참고: 이것은 P0 바이러스입니다. 그것은 시간이 더 긴 기간 aliquoted 및-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. - 각 재조합 바이러스를 증폭, 80% 합류 150 mm 접시에 Sf9 세포의 단층 성장. 접시에서 미디어를 발음 접시에 세포 부착에 P0 바이러스의 2 개 mL를 추가 하 고 품 어 27 ° C 배양 기에서 1 시간에 대 한 접시. 셀으로 매체를 혼합 판 매 15 분 바위.
- 10 %FBS 100 µ g/mL (100 I.U./mL)를 포함 하는 완전 한 그레이스의 미디어의 25 mL를 추가 항생제 페니실린 스. P1 통행 바이러스를 27 ° C 인큐베이터에서 3 d 격판덮개를 품 어.
- 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 세포 파편을 제거 하 5 분에 대 한 1010 x g 에서 스핀 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 고 최대 1 년 동안 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.
참고: P1 바이러스 수 있습니다 aliquoted-80 ° C에서 저장 시간이 더 긴 기간에 대 한. - P1에서 P2 통행 바이러스를 증폭, 90% 합류를 150 mm 접시에 Sf9 세포의 단층을 성장 하 고, 접시의 미디어를 발음 하 고, 접시, P1 바이러스의 2 개 mL를 추가 한 27 ° C 배양 기에서 1 시간을 위해 그것을 품 어.
- 3.8.2 및 3.8.3 바이러스의 P2 및 P3 구절을 단계를 반복 합니다. 2 개월 이상 P3 바이러스를 저장 하지 마십시오.
- 외피의 4 d 후 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 감염 된 접시의 상쾌한을 수집 합니다. 1010 x g 세포 파편을 제거 하 5 분에 상쾌한 스핀. 펠 릿을 삭제 하 고 깨끗 한 튜브에 상쾌한 가만히 따르다 4 ° C에서 최대 1 년 동안 그것을 저장.
4. 단백질 식, NiNTA, 및 결정 화 정화
- 27 ° C 배양 기 통에 100 rpm에서 2 x 106 의 밀도 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 문화 미디어 페니실린 스 항생제에 Hi5 곤충 세포의 1 L 문화. 570 x g 5 분에 셀 아래로 회전 시키십시오, 가만히 따르다는 상쾌한, 갓 생산된 P3 바이러스의 20 mL에 셀 resuspend 그리고 1 헤 부드럽게 흔들어 각 15 분 x 1 셀 resuspend 스핀 병에 대 한 실내 온도에서 보관.
- 와 100 µ g/mL (100 I.U./mL) 문화 미디어 스 페니실린 항생제의 1 l 셀을 전송 하 고 72 h. 스핀 1,010 x g 5 분에 셀 아래에 27 ° C 배양 기 통에 100 rpm에서 셀 문화는 상쾌한을 수집 합니다.
- 사용 pH 지시자 0.1 M HCl 또는 0.1 M NaOH 추가 하 여 상쾌한 8.0의 pH를 조정 하 고 최종 농도, pH 8.0, 100 mM NaCl, 20 mM Tris 버퍼 및 5mm 이미에 바인딩 버퍼를 추가를 제거 합니다. 표현된 그의 태그 재조합 단백질의 예상된 수익률에 따라 NiNTA 수 지 (10-40 mL)의 일정 금액을 추가 합니다.
- 수 지 1 h. 워시 4 ° C에서 낮은 속도와 자기 파문에 솔루션을 혼합 하 고 표준 NiNTA 정화 프로토콜18다음 바인딩된 단백질을 elute.
- 이온 교환 정제 단백질 주제와 젤 여과 착 색 인쇄기, 뿐만 아니라 다른 단백질 정화 방법, 균질 샘플을 얻을.
참고: TDR ectodomain, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl 젤 여과 버퍼로 사용 했다. PRK3 ectodomain, 20 m m 두번째-트리 스에 대 한 pH 6, 100 mM NaCl 선호 젤 여과 버퍼로 사용 되었다.
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Representative Results
그림 1에서 보듯이 두 수정된 pFastBac1 잠재 식 벡터는 GP67 또는 hemolin 신호 순서 대상 유전자의 본질적인 신호 순서를 대체 하는 secreted 단백질을 표현 하기 위해 사용 되었다. 바이러스 성 GP67와 곤충 hemolin 유전자 세포에 있는 높은 분 비 식 수준 입증 되었습니다. 융해 단백질이 두 신호 시퀀스 중 하나가 크게 분 비 식 수준 향상으로 예상 된다. 동일한 다 수 클로닝 위치 (MCS) 이러한 두 수정된 벡터에서 설계 했다. 노트 사이트 노트 8-뉴클레오티드 순서 보다는 가장 일반적인 6 뉴클레오티드 순서 다른 많은 금지 사이트에 있기 때문에 가장 5'-측면에 있는 MCS의 신중 하 게 배치 했다. 따라서, 노트 사이트는 대부분의 다른 제한 사이트, 제한 소화를 만들고 사용 하 여 다른 제한 사이트에 비해 더 실현 가능한 대부분 대상 유전자의 클로닝 보다 덜 대상 유전자에 존재. 대상 유전자는 노트와 다운스트림 제한 사이트 간의 복제 3 아미노산 잔류물, GGR, 이전 대상 유전자를 소개 합니다.
PBac1-GP67 및 pBac1 헴 성공적으로 이용 되었습니다 TDR 및 PRK3, A. thaliana 수용 체의 세포 외 도메인을 각각 표현 하 (그림 2). 재조합 단백질 공학 C 터미널 6 히스티딘 태그를 사용 하 여 NiNTA에 의해 순화 했다, 후 평균 단백질 수확량 20 mg/L Hi5 셀 주위 일관 했다. 각 단백질의 순도 가까이 또는 SDS 페이지와 Coomassie 얼룩 검사 50% 보다 높은.
TDR 및 PRK3의 세포 외 도메인의 재조합 단백질 크기 배제 크로마토그래피 (그림 2)에 의해 더 순화 했다. 순화 된 단백질 5 mg/mL에 집중 되었고 결정 심사를 받게. 20 µ m 보다 더 큰 크기와 함께 단백질 결정 (그림 3) 관찰 되었다 때까지 각 단백질의 예비 결정 나왔고, 조건 최적화 했다. 두 단백질의 크리스탈 구조 보고11,12되었습니다.
그림 1: 수정된 pFastBac1 벡터 지도. 이 패널에 표시 된 DNA 시퀀스 삽입 된 신호 펩 티 드 순서 및 대상 유전자에 대 한 여러 복제 사이트 (MCS)를 소유 하는 pFastBac1 벡터의 polyhedrin 발기인의 하류. 두 벡터는 동일한 MCS를 포함 되어 있습니다. (A)이이 패널 pBac1 GP67 벡터에 polyhedrin 발기인의 하류 복제 사이트의 시퀀스를 표시 합니다. 번역 된 GP67 신호 펩 티 드 아미노산 시퀀스는 빨간색으로 채색 된다. MCS에서 각 고유 제한 사이트 밑줄이, 위에 표시 된 사이트의 이름으로. (B)이이 패널 pBac1 헴 벡터 polyhedrin 발기인의 하류 복제 사이트의 시퀀스를 보여 줍니다. 번역 된 hemolin 신호 펩 티 드 아미노산 시퀀스는 빨간색으로 채색 된다. MCS에서 각 고유 제한 사이트 밑줄이, 위에 표시 된 사이트의 이름으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 잠재 곤충 세포 시스템에서 수정 된 pFastBac1 벡터와 단백질 표정. (A) TDR의 ectodomain Hi5 곤충 세포, 니켈 친 화력과 크기 배제 크로마토그래피 (S)에 의해 순화 표현 되었고 SDS 페이지 젤에 해결. 니켈 수 지 5mm 이미 (1), 세척 및 20 m m 이미 (2 세)와 두 번째 시간을 포함 하는 버퍼와 한번 세척 했다. (B)이 PRK3 ectodomain의 크기 배제 크로마토그래피 뿐만 아니라 식 니켈 친 화력 정화 (NiNTA)을 보여주는 SDS 페이지 분석 이다. 해당 크기와 분자량 (MW) 마커 표시 되어 있습니다. 각 패널에 빨간색 화살표는 식 및 재조합 TDR의 예상된 크기와 PRK3 ectodomain 단백질을 나타냅니다. 표현한 단백질의 멀티 밴드 본성 때문에 이기종 glycosylation 높습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 단백질 결정의 애기 thaliana TDR 및 PRK3의 세포 외 도메인. (A)이이 패널 A. thaliana TDR의 세포 외 도메인의 단백질 결정을 보여 줍니다. (B)이이 패널 A. thaliana PRK3의 세포 외 도메인의 단백질 결정을 보여줍니다. 눈금 막대는 각 사진 아래 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
크기 및 생물 학적 시스템에 단백질의 수천의 안정성에 다양성을 감안할 때, 그것은 종종 경험적 연구에 대 한 실험실을 분리 표현 시스템을 결정 하는 특정 단백질의 표현에 대 한 선택. 대장균 식 시스템은 종종19최대 규모 박테리아, 문화 미디어, 그리고 상대적으로 완화의 저렴 한 비용의 짧은 라이프 사이클에 따른 단백질 표정에 대 한 첫 번째 선택. 그러나 60 kDa,, 대장균 을 사용 하 여 보다는 더 크기와 큰 진 핵 단백질의 표현에 대 한 시스템은 종종 포함 본문 또는 집계20에서 불용 성 단백질에 결과. 그 어려운 단백질의 표정을 위해, 그리고 다른 secreted 단백질에 대 한 잠재-곤충 세포 표현 시스템 전자 대장균보다 더 유리한 수 있습니다. 진 핵 단백질 분 비를 표현 하는 경우에 특히이 수정된 잠재 곤충 세포 표현 시스템 선호 하는 선택 일 수 있었다.
많은 secreted 진 핵 단백질, 분 비 하는 식물 단백질을 포함 하 여 복잡 한 glycosylation, 이황화 형성, 및 다른 포스트 번역 상 수정 단백질 폴딩과 분 비21동안 필요 합니다. 대장균 시스템 진 핵 단백질22의 많은에 필요한 복잡 한 수정 처리 세포질 기계 장치는 없습니다. 효 모는 대장균23보다 상대적으로 더 고급 glycosylation 시스템. 그러나, 더 높은 핵 종 및 식물에서 secreted 단백질의 표현에 대 한 잠재-곤충 세포 시스템 상당한 이점을 제공합니다. 이후 glycosylation 단백질 폴딩에 영향을 미치는 안정성24, secreted 재조합 단백질의 많은 표현에 대장균 과 효 모 시스템 낮은 수율 있고 집계 하는, 아마도 잘못 된 단백질 접기 때문에 하는 경향이 있다. 잠재 곤충 시스템 단백질 glycosylation, 그것에 게 진 핵 단백질 분 비25의 표현에 대 한 이상적인 시스템을 개선 하기 위해 수정 되었습니다. 이 연구에는 GP67와 hemolin는 펩 티 드 단백질 결정 화에 대 한 두 개의 공장 수용 체 단백질의 분 비 식 안내 하는 성공적으로 이용 되었다 신호. 마음에 이러한 연구와 함께 하지만, 어느 신호 펩 티 드의 선택은 중요 한 단계, 그리고 그것은 다른 유기 체에서 대상 유전자의 세트와 함께 더 체계적인 비교 연구 필요.
GP67와 hemolin 신호 펩 티 드 단백질 분 비 식 향상을 사용 하는 아이디어는 두 유전자의 높은 식 수율에 의해 주도 되었다. 그러나, 단백질 분 비와 식 호스트의 posttranslational 수정 기계를 표현 재조합 단백질 오버 로드, secreted 재조합 단백질 없을 수 충분 한 수정, glycosylation 특히. 두 수정된 벡터 성공적으로 수많은 공장 분 비 단백질11,,1226는 많은 잘못 된 또는 부적절 한 glycosylation 때문에 아마 이다 집계 하는 경향이 익스프레스에 사용 되었습니다. 따라서, 그 어려운 단백질의 표정을 위해 모두 강하고 약한 신호 펩 티 드 순서 테스트 해야 하 고 표현된 재조합 단백질의 품질 비교 해야 키를 누릅니다. 약한 신호 펩 티 드 순서 단백질;의 전체 수익률을 낮출 것 이다 명심 하십시오 그러나, 그것은 단백질 분 비와 수정 처리 하는 데 충분 한 용량 식 호스트의 분 비 기계 줄 수 있습니다.
곤충 세포에서 분리 분 비 단백질의 표현 뿐만 아니라 포유류 세포 및 식물 세포 식 시스템에 사용 되었습니다 성공적으로 재조합 포유류의 overexpression 및 식물 단백질, 각각27, , 2829. 분리 시스템, 근처 생 식에 비해 상태는 포유류 나 분 비 하는 식물 단백질의 잘 접힌된 단백질을 호스트 세포에 거의 네이티브 수정 기계를 해야한다. 근처-네이티브 식 시스템을 사용 하 여 경고는 표현된 재조합 단백질 잠재적으로 단백질의 최종 식 수익률에 악영향을 미칠 수 있습니다 세포의 생리 기능 방해할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 Guozhou Xu에 대 한 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 새로운 교수 시작 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 - 14 |
References
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