Summary
Мы опишем пошаговое протокол для тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), который позволяет проводить анализ изменения определенного типа клеток геном wide гистонов.
Abstract
Эпигеномные регулирование играет центральную роль в экспрессии генов. Поскольку изменения гистона был обнаружен в 1960-х, его физиологических и патологических функции были широко изучены. Действительно появление глубоких секвенирование нового поколения и иммунопреципитации chromatin (чип) через конкретные гистона модификации антитела изменил наш взгляд эпигеномные регулирования через генома. И наоборот тканей, как правило, состоят из типов различных клеток, и их сложные смеси создает аналитические проблемы для расследования epigenome в конкретной ячейке тип. Для решения состояния конкретного типа хроматин клеток в геном всей манере, мы недавно разработали тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), которая основана на выборочной очистки хроматина тегами ядро гистоны из ячейки виды интересов, следуют чип-Seq. Целью настоящего Протокола является внедрение наилучшей практики tChIP-след Эта технология предоставляет универсальный инструмент для epigenome ткани конкретного расследования гистона различных модификаций и модельные организмы.
Introduction
Ткани животных состоят из клеток различных типов. Ген регулирование в каждой ячейке определяет тип ячейки. Chromatin изменения - ДНК метилирования и гистонов модификации - лежат в основе тип ячейки специфика экспрессии генов. Таким образом необходимости измерения эпигеномные регулирования в каждой ячейке тип, но это был технический вызов.
Расследовать эпигенетики в конкретной ячейке тип, секвенирование иммунопреципитации chromatin тандем (tChIP-Seq) был недавно разработанных ()Рисунок 1)1. В tChIP белка гистонов epitope тегами ядро H2B выражается от промоутера определенного типа клеток. Эта функция позволяет изоляции chromatins из клеток интерес, хотя материал начинается из смеси различных типов клеток. Следующие чип-Seq — хроматина очищение через изменение гистона Марк и глубокие секвенирование нового поколения изолированной ДНК — мы можем контролировать эпигеномные статус тип целевой ячейки в геном всей манере.
Используя эту технику, мы недавно исследовали нейрон конкретных trimethylation гистонов H3 белка на лизина 4 (H3K4me3) знаки. В этом исследовании мы разработали стук в мышь, в котором C-неизлечимо флаг тегами H2B белка была выражена при рекомбинации Cre опосредованной (Rosa26ЦАГ floxed ПА H2B-флаг). Путем скрещивания с помощью мыши, имеющих КРР эндоплазматического ретикулума (ER) гена под контролем промотора CamK2a, полученные мыши линии индуцированной H2B-флаг в активных нейронов на тамоксифен инъекций (Camk2aH2B-флаг)1. Начиная от мозга установленной мыши линии, мы провели tChIP-Seq с анти H3K4me3 антител. Так как H3K4me3 знаки часто соответствуют промоутер регионов, мы могли бы обнаружить сотни мРНК, конкретно выражена в нейроны1.
Здесь мы описываем метод типичный tChIP-Seq, который охватывает шаги от рассечение тканей для библиотеки строительных ()Рисунок 1). Конечная цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы поделиться своим передовым опытом для выполнения tChIP-Seq и будущее применение этого метода в другие типы клеток и изменения гистона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были утверждены отделом безопасности RIKEN (H27-EP071) и проведены с соответствующими руководящими принципами и правилами.
1. рассечение тканей
- Вскрыть тканях интерес на мелкие кусочки (примерно < 3 мм2) с помощью тонкой весной ножницы.
Примечание: Большие фрагменты тканей занять больше времени, чтобы заморозить, и более мелкие куски будут перенесены больший объем буфера, оба из которых могут повлиять на результаты. - Добавить фрагменты Иссеченную ткань в чистый контейнер с жидким азотом и собирать их в 2 мл пробирки (1 штука в трубку) заполнены с жидким азотом.
Примечание: Трубы с гидрофильной поверхностью рекомендуются для этого шага. - Место труб при температуре-80 ° C > 5 мин с крышкой, открытым для испарения оставшиеся жидкого азота.
Примечание: После закрытия крышки, фрагменты тканей может храниться при температуре-80 ° C на один месяц перед использованием.
2. ячейки фиксации
Примечание: Мы использовали удобный криогенных дробилка для этого шага. Альтернативные аппарат может быть использован.
- Место 2 мл белок низкой привязки пробирки, содержащие образцы тканей на шкаф металлический льда охлажденной в жидком азоте.
- Место металлическая пуля в 1,5 мл трубки и холод с жидким азотом. Поместите его на решетку металла льда.
- Откройте 2 мл и место prechilled металлическая пуля в трубу. Закройте крышку, установите 2 мл трубы в Трубодержатель удобный криогенных точильщика и сразу окунуть собрал Трубодержатель в жидком азоте за 1 мин.
- Вставьте держатель замороженные трубы в наружной кассеты удобный криогенных точильщика и встряхнуть 60 раз за 30 s.
- Разбирать держателя трубки, удалите металлические пули и место 2 мл на образец охладителя prechilled при-20 ° C.
- Поместите образец охладителя при-20 ° C на 15 минут предотвратить замораживание фиксатором на следующем шаге.
- Привести пример кулер на скамейке, откройте крышку трубки и сразу же капать 900 мкл 1% формальдегида в него. После закупорить несколько раз, перевести подвеска на новый 2 мл трубка, содержащая 900 мкл 1% формальдегида и исправления для 10 мин с нежным вращение в инкубаторе в 23 ° C.
Предупреждение: Формальдегид токсичных и вредных. - Чтобы остановить реакции фиксации, добавьте 100 мкл 2,5 метров глицина каждой трубки и центрифуги для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C. Выбросите супернатант.
- Добавьте 1 mL ледяной фосфат амортизированное saline (PBS), центрифуги для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и отбросить супернатант. Повторите этот шаг два раза (3 стирок в общей сложности).
Примечание: Фиксированная образцов может быть флэш заморожены жидким азотом и хранятся при температуре-80 ° C. - Добавьте 500 мкл буфера Lysis 1 (50 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES)-Кох (рН 7,5), 140 мм NaCl, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (рН 8,0), 10% w/v глицерина, 0,5% w/v NP-40, ингибитор протеазы X-100 и 0,1 x 0,25% w/v Тритон коктейль) Пелле, накапайте несколько раз и поворот на 10 мин при 4 ° C.
Примечание: Буфера Lysis 1 следует фильтровать и хранить при 4 ° C перед использованием. - Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
- Добавьте 1 mL 2 буфера Lysis (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 200 мм NaCl, 1 мм ЭДТА (рН 8,0), 0,5 мм EGTA и 0.1 x коктейль ингибитор протеазы) Пелле, вихрь и поворот на 10 мин при 4 ° C.
Примечание: Буфера Lysis 2 следует фильтровать и хранить при 4 ° C перед использованием. - Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
- Добавить 800 мкл аналитического (RIPA) буфера radioimmunoprecipitation с ингибитором протеазы 1 x коктейль гранулы и Ресуспензируйте гранулы, закупорить.
- Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
- 500 мкл буфера РИПА с 1 x ингибитор протеазы коктейль.
- Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
- Добавьте 1 mL Буфер RIPA с 1 x ингибитор протеазы коктейль. Сразу же переходите к следующему шагу.
3. chromatin стрижка
- Lysate передать трубку sonicator и затем поместите трубку на ultrasonicator.
- Наклонить хроматина со следующими параметрами: температура: 4 ° C; инцидент Пиковая мощность: 175 Вт; коэффициент: 10%; циклы/серия: 200; и время: 2400 s.
- Передать образец 1,5 мл белок низкой привязка трубки и центрифуги для 5 минут на 20 000 x g при 4 ° C.
- Соберите супернатант в новой трубки низкого привязки белка.
Примечание: Образец может быть флэш замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C.
4. качество проверки ДНК (обратный сшивки)
- Микс 20 мкл lysate и 180 мкл буфера чип (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 300 мм NaCl, 5 мм ЭДТА (рН 8.0) и лаурилсульфат натрия 1% w/v (SDS)) в трубе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Инкубируйте образца при 65 ° C в тепловой cycler для 6 h с открытой крышкой тепловая велосипедист. Держите крышку открыть тепловая велосипедист, чтобы избежать чрезмерной денатурации.
Примечание: Чип Элюирующий буфер должен фильтруется и хранятся при комнатной температуре перед использованием. Этот инкубации может быть продлен на ночь. - 1 мкл 10 мг/мл РНКазы, вихрь и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
- 6,5 мкл 15 mg/ml протеиназы K, вихрь и Инкубируйте на 55 ° C для 60 мин.
- Перенесите реакция на трубу ДНК низкой привязки, 4 мкл гликогена 5 мг/мл и вихрь. Затем добавьте 200 мкл фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и центрифуги для 5 мин на 18,000 x g при комнатной температуре.
- Супернатант передать новой трубки низкого привязки ДНК. Добавить 200 мкл буфера Tris-ЭДТА-NaCl (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 1 мм ЭДТА (рН 8.0) и 200 мм NaCl) оставшийся раствор фенола/хлороформ/изоамилового спирта и центрифуги для 5 мин на 18,000 x g при комнатной температуре. Собирать супернатант и смешать с первого супернатант.
- 900 мкл ледяной этанола и инкубировать 1 час при температуре-20 ° C.
Примечание: Этот инкубации может продлеваться до 4 - 6 ч. - Центрифуги для 30 мин на 18,000 x g при 4 ° C.
- Выбросите супернатант. Добавьте 1 mL ледяной 75% этанола в гранулах и центрифуги для 30 мин на 18,000 x g при 4 ° C. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
- Тщательно удалить супернатант и просушите при комнатной температуре 1 мин.
- Добавьте 50 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE) и растворить ДНК путем инкубации его при комнатной температуре в течение 30 минут или при температуре 4 ° C на ночь. Избегайте vortexing или закупорить. Держите этот ДНК как «входной» и использовать его для приготовления библиотеки при необходимости.
- Измерить концентрации ДНК с флуориметр согласно инструкции производителя (см. таблицу материалы) и проверить распределение размеров с машиной microfluidic электрофореза (см. репрезентативных данных, показано в Рисунок 2a). Использование 10 нг или меньше ДНК для этот assay.
Примечание: Фрагменты 100 – 500 пар оснований (ВР) должен составлять 50% или больше из ДНК.
5. сродства очищения, антитела анти флаг
Примечание: Для tChIP нейрон-Seq, тканях мозга от 8 мышей обычно используются для один образец tChIP-Seq для подготовки 2 нг очищенная ДНК иммунной тандем-очищение (см. шаг 7.1). В наших руках 0.1 нг ДНК, по-прежнему предоставляет высококачественные ДНК библиотеки для чип-Seq (Kadota, неопубликованные). Таким образом в теории, одной мыши может быть достаточно для выполнения нейрон tChIP-Seq. Требуемая сумма должна быть оптимизирована для тканей и клеток типа интереса. Для отрицательного контроля imumuno очистка эксперимента мозговой ткани lysate от мышей без каких-либо H2B-флаг выражение следует подготовить и используется.
- Пипетка 200 мкл магнитные бусы, конъюгированных овец анти мыши иммуноглобулина G (IgG) в трубку низкой связывания белков.
- Установите трубу на магнитного стенд и подождите 1 мин для супернатант станет ясно. Отбросить супернатанта, добавьте 1 mL ледяной PBS, и вихрь. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
- 20 мкл антител анти флаг 1 мг/мл и вращаться в течение 5 ч при 4 ° C.
Примечание: Этот инкубации может быть продлен на ночь. - Мыть после шаг 5.2 бусины. Место шарики в 15 мл.
- Ресуспензируйте бисер в 1110 мкл Буфер RIPA и затем 900 мкл 10 x блокирование реагента, 180 мкл 50 x Денхардта в раствор, 10 µL 100 x ингибитор протеазы коктейль и 6,8 мл lysate подготовлен на шаге 3. Разделить смесь на 5 белок низкой привязки труб. Вращаться в течение 6 ч при 4 ° C.
Примечание: Этот инкубации может быть продлен на ночь. - Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отменить супернатанта, добавляют 1 мл Буфер RIPA и аккуратно перемешать. Повторите этот шаг 5 раз (6 моет в общей сложности). Объединить все бусины в один белок низкой привязки трубку.
- Добавить 200 мкл рабочего раствора микросхемы Элюирующий буфер и вращаться в течение 15 минут при комнатной температуре. Проверьте качество ДНК, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2B и C). Сразу же переходите к следующему шагу.
6. сродства очищения антитела анти H3K4me3 и обратного сшивания
Примечание: Следующие шарик подготовка выполненных шагов (6.1-6.4) до 5,7 шаг.
- Пипетка 40 мкл магнитной бусины, конъюгированных овец анти мыши IgG в трубку 2 мл белок низкой привязки.
- Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отбросить супернатанта, добавляют 1 мл ледяной PBS и осторожно перемешать. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
- 4 мкл антител анти H3K4me3 1 мг/мл и вращаться в течение 6 ч при 4 ° C.
- Мыть после шаг 6.2 бусины. Место шарики в трубку 2 мл белок низкой привязки.
- Ресуспензируйте бисер в 1558 мкл RIPA буфера, а затем добавить 200 мкл 10 x блокирование реагента, 40 мкл 50 x Денхардта в раствор, 2 мкл, 100 x ингибитор протеазы коктейль и 200 мкл элюата, подготовлено в 5.7 шаг. Поворот на ночь при 4 ° C.
Примечание: SDS в чип Элюирующий буфер был разбавлен более чем 10 раз в этом инкубации. - Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отменить супернатанта, добавляют 1 мл Буфер RIPA и аккуратно перемешать. Повторите этот шаг 4 раза (5 стирок в общей сложности). После последнего мыть передача бисер в ДНК низкой привязки трубку и удалить супернатант.
- Добавить 200 мкл рабочего раствора микросхемы Элюирующий буфер и вращаться в течение 15 минут при комнатной температуре. Передача элюата в новой низким bindingTube ДНК.
Примечание: Элюата может храниться при температуре-80 ° C. - Выполните шаг 4 для decrosslinking ДНК. Ресуспензируйте очищенная ДНК в 20 мкл буфера TE.
- Проверьте качество ДНК, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2D). (необязательно) Выполнить анализ обогащения путем количественного PCR как описано выше2. Десятикратное или большего обогащения должны соблюдаться.
7. Библиотека строительство
- Для каждого входа и образец ДНК чип рассчитайте долю ДНК в регионе 100 – 500-bp, используя функцию анализа мазка программного обеспечения для машины microfluidic электрофореза. Оценить объем пробы, необходимые для получения 2 нг 100 – 500 bp ДНК. Используйте 20 нг ДНК в диапазоне 100 – 500-bp образцом «вход».
- Пипетка образцы ДНК в пробирки 8-газа ПЦР и добавьте H2O довести объем до 10 мкл. (необязательно) Если объем ДНК превышает 10 мкл, пропорционально шкале вверх следующие реакции конец ремонт и выбор размера.
- Подготовьте конец ремонт Мастер микс (см. Таблицу материалы). 4 мкл конец ремонт мастер смеси ДНК и Инкубируйте 30 мин при 20 ° C.
- 36 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 и объем 0,6 x (30 мкл) твердых этапа реверсивные иммобилизации (ОСПР) магнитные бусы и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
- Супернатант передать новой трубки, добавьте 1.2 x тома (60 мкл) Спри магнитные бусы и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
- Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
- Вымойте бусины дважды с 200 мкл 80% EtOH, держа трубку до сих пор на магните.
- Кратко центрифуга трубка для сбора остаточной EtOH внизу и поместить его обратно на магните. Тщательно удалите остаточную EtOH.
- Не закрывайте крышку трубки, для 1-2 мин позволить EtOH испаряться.
- Закройте крышкой и держать трубку на льду.
Примечание: Теперь вы получили выбран размер ДНК 100 – 500 bp на бисер. Более подробная информация о двойной размер выделения можно найти на сайте производителя (www.beckman.com). - Подготовка мастер A-хвостохранилища смесь (см. Таблицу материалы).
- Ресуспензируйте бусины (от шаг 7.10) с 10 мкл мастер смесь A-хвостохранилища и Инкубируйте 30 мин при температуре 30 ° C.
- Добавить объем 1.8 x (18 мкл) от полиэтиленгликоля (PEG) / раствор NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Выполните шаги 7,7-7.11 очистить ДНК.
- Подготовить лигирование буферной смеси (см. Таблицу материалы).
- Пипетка 8 мкл лигирование буферной смеси на бусины (от шаг 7.14), 1 мкл адаптер 1 мкм и Ресуспензируйте бисер. Используйте 1 мкл 5 мкм адаптер для ввода образца. Рассмотрите различные адаптеры для каждого образца для мультиплексирования.
- 1 мкл ДНК лигаза и Инкубируйте 15 мин при 20 ° C.
- Добавить 1.0 x тома (10 мкл) раствора ПЭГ/NaCl, Ресуспензируйте бисер и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
- Пипетка 25 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
- Добавьте 1.0 x объем (25 мкл) раствора ПЭГ/NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
- Пипетка 11 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
- Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
- Соберите супернатант в новой 8-газа ПЦР-пробирку.
- Подготовка в реальном времени PCR главный микс (см. материалы для подробной информации).
- Пипетка 8.5 мкл в реальном масштабе времени PCR мастер смеси в 384-ну количественного PCR (ПЦР) плита и добавить 1,5 мкл адаптера лигируют ДНК (от шаг 7.26).
- Пипетка 10 мкл каждого флуоресцентные стандарта в пустой скважин.
- Выполнять ПЦР в реальном времени с следующие программы: (98 ° C на 45 s) x 1 цикл, (98 ° C 15 сек, 60 ° C за 30 s, 72 ° C для 30 s) x 20 циклов, и (72 ° C для 60 s) x 1 цикл.
- Определите количество циклов PCR, необходимых для достижения интенсивности флуоресценции флуоресцентные стандарт 2.
- Подготовка мастер ПЦР смесь (см. Таблицу материалы).
- Пипетка 11,5 мкл мастер смесь ПЦР в оставшихся лигируют адаптер ДНК (шаг 7.26) и выполнять ПЦР, как указано в шаге 7.30 с циклами PCR определены в шаге 7.31.
- Добавьте 1.0 x объем (20 мкл) раствора ПЭГ/NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
- Пипетка 20 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
- Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
- Соберите супернатант в новой трубки 1,5 мл ДНК низкой привязки.
- Проверьте качество библиотеки, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2E и F). Используйте 1 мкл пример библиотеки ДНК. (необязательно) Выполните анализ обогащения, ПЦР, как описано выше 2. Десятикратное или большего обогащения должны соблюдаться.
8. секвенирование
- Последовательность библиотек в секвенсор следующего поколения (см. репрезентативных данных, показанный на рисунке 3).
Примечание: Глубина последовательности, достаточно для анализа данных будет отличаться в зависимости от размера геном организма3. Для человека и мыши, мы рекомендуем получить по крайней мере 20-40 миллионов сингл конце читает. По мнению урожайности гласит мультиплексирование может быть экономически эффективным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы описываем рассечение тканей, фиксации, лизис клеток, тандем очистки хроматина, и подготовка библиотеки ДНК для следующего поколения секвенсорами. Во время процедур один можно проверить качество ДНК, которая является ключом к успешной виртуализации, на несколько шагов (рис. 2). Поскольку один нуклеосома обычно окружена 147 bp ДНК 4, стриженый ДНК не должно быть короче, чем размер. Сразу же после ultrasonication ДНК был изолирован и запустить на компьютере электрофорез microfluidic (рис. 2A). Несмотря на наши усилия, чтобы оптимизировать размер диапазона мы по-прежнему имел население ДНК (примерно 2 kbp), которые остались unsheared. На этом шаге доля ДНК, начиная от 100-500 bp должна быть 50% или более населения. После очищения сродства антитела анти флаг (рис. 2B), а затем антитела анти H3K4me3 (Рисунок 2D) качество изолированной ДНК проверялось снова, используя microfluidic электрофорез машина и количество ДНК, начиная от по оценкам, 100-500 bp. Хотя мы часто наблюдается сильный уклон в сторону 2 kbp фрагментов на этот шаг, двойной размер выделения Спри магнитные бусы удалены этой фракции.
Специфика иммунной очистка ДНК на H2B-флаг был подтвержден с отрицательных контрольных образцов, в которых мозг lysate от мышей без H2B-флага было использовано выражение (рис. 2 c). Мы обычно обнаружено незначительное количество ДНК от отрицательных контрольных образцов.
После A-хвостов, лигирование адаптер и ПЦР, проверялось качество библиотека последовательности (рис. 2е). Как правило 250-600 ВР ДНК был получен. Успешное регулярные чипа и tChIP были свидетельствует анализ обогащения с ПЦР2 с праймерами, ориентация региона промоутер гена GAPDH (Рисунок 2F).
Представитель читать дистрибутивов вдоль нейрон генов (Camk2a, Slc17a7 и Gria1) генома-браузером показанный на рисунке 3. Было отмечено, в обогащение читает в конце 5′ генов нейрон tChIP-Seq над весь мозг tChIP-Seq.
Рисунок 1: Схематическое изображение tChIP след Эта цифра была изменена от Mito, м. и др. 1. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Проверка качества ДНК. (A, B, Dи E) Electropherogram, полученных с помощью microfluidic электрофорез машина для стриженый хроматина ДНК (A), ДНК, очищенная с анти флаг антитела (B) и затем антитела анти H3K4me3 (C) и окончательный библиотека (D). Пики, с зеленым и фиолетовым чисел представляют собой внутренний размер стандартов. Синие пунктирные линии указывают размер регионов ДНК, считается течению анализа. Фу: флуоресценции единицы.
(C) количество ДНК, восстановленные анти флаг иммунной очистки. Каждая точка представляет собой независимый реплицировать. (F) обогащения анализ ПЦР ориентации GAPDH. Каждая точка представляет собой независимый реплицировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: читать распределений в нейрон tChIP след (A-C) Дистрибутивы чтения вдоль гены представителя нейрон в нейрон tChIP-Seq и управления весь мозг tChIP-Seq показываются. Скорость вращения: читает за миллион читает. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш протокол был оптимизирован для нейронов мозга мыши, в котором выражение с тегами Флаг H2B индуцируется тамоксифен инъекции. Промоутеры, используемые для выражения H2B, исходных материалов ткани и количество тканей являются ключевой параметрами для успешной tChIP след Таким образом оптимизация этих факторов следует рассматривать для каждого типа клеток интереса.
Важнейшим шагом среди процедуры, используемые в настоящем Протоколе является стрижка для достижения хроматина длиной 100-500 bp5ДНК. В общем стандартизации ultrasonication шаг сложной задачей, поскольку она сильно зависит от целого ряда факторов; фиксации условий, используемых тканей, оборудование, используемое для ультра sonication и оборудование, установки, среди других. Таким образом проб и ошибок оптимизация этот шаг сдвига ДНК потребуется для отдельных экспериментов. Вместо того чтобы ультра sonication Микрококковая Нуклеаза лечение должно быть вариант для изоляции одного размера нуклеосома ДНК, используется в наивной чип метод6. Хотя Однородный гранулометрический ДНК является идеальным, стриженый DNAs может показать несколько популяций, как показано на рисунке 2А. Двойной размер выбор Спри магнитные шарики, как описано выше, помогает снять более размера фрагментов ДНК.
Как правило, Библиотека подготовка требует 1 нг 100-500 bp ДНК. Основываясь на это требование, мы расширить первоначальный материал ткани мозга для нейронов. Однако эта процедура может быть сложным для чрезвычайно малых выборок из типов редких клеток. В таких случаях чип документации, которая основана на Tn5 Транспозаза вместо лигаза и требует меньше материала7, может быть лучшей альтернативой.
Тем не менее этот текущий протокол ограничивается типов основных клеток в материале. В наших руках 10% заполненности целевых ячеек в оригинальной популяции клеток представлена ярмарка очистки хроматина из целевой ячейки1. Однако если даже более редких ячейка типы предназначены, тонкие оптимизации иммунопреципитации по тегу epitope будет оправданным отличить изолированной ДНК от загрязненных дна от клеток, не являющихся объектом. Для наилучшей практики, анализа данных мы настоятельно рекомендуем, сравнение данных для анализа управления tChIP-Seq из цельной ткани, используется для начать эксперимент. Поскольку мы нашли значительных отклонений от экзогенно выраженной H2B-флаг белка, анализ следует сравнить и проанализированы обогащения (или истощения) на фоне1. Для этого элемента управления мы действительно создал линию мыши с повсеместно выраженной H2B-флаг (розаH2B-флаг) и осуществляется tChIP-Seq1. Более подробное толкование данных был ранее обсуждались1.
На основе нашего анализа, H3K4me3 tChIP-Seq от нейронов предусмотрено сопоставимых и/или лучшего обнаружения известных нейрон специфических генов, чем РНК-Seq от СУИМ сортировка нейронов очищение сродства рибосома8 и перевода (ловушка)-Seq9. Например известный аксона/дендритов локализованы гены были эффективно восстановить с помощью нейрон tChIP-Seq1. Удивительно наши tChIP-Seq не ограничен для Марк промоутер связанные гистонов, но распространяется также на другие различные изменения гистона10 если антитела доступны. Кроме того стратегия изоляции хроматина с тегами ядро гистоны может использоваться в других модельных организмов. Хотя здесь мы использовали epitope флага пометить белка гистонов ядра, могут применяться другие теги. Так как формальдегид фиксации ДНК наиболее часто встречается в лизине остатки белка11, тег с много лизина следует избегать по ликвидации предубеждения epitope пометки. Таким образом tChIP-Seq подход должен быть универсальным в различных тканях вдоль многие виды контекстов в эпигеномные исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим всех членов Ивасаки лаборатории для критических чтении рукописи. Эта работа была частично поддерживается за счет целевых субсидий для научных исследований в инновационных областях (#26113005 с.н. и JP17H05679 с.и.); субсидий для молодых ученых () (JP17H04998 для с.и.) от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии (МПКСНТ); и новаторские проекты всех RIKEN проект «Заболевания и Epigenome «от RIKEN (чтобы с.н. и с.и.) и «Сотовой эволюция».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
- Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
- Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L.
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
