Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للسل البشري النموذجي في الزرد الكبار استخدام به الممرض الطبيعية متفطره marinum. استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأجهزة الداخلية من الزرد المصابة يمكن أن تكشف عن مجموع المتفطرات الأحمال في الأسماك والاستجابات المناعية للمضيف مع قبكر.
Abstract
متفطره حاليا الممرض البشرية فتكاً مما تسبب في وفاة 1.7 مليون والتهابات 10.4 مليون سنوياً. يسبب التعرض لهذه البكتيريا طائفة واسعة من أمراض في البشر تتراوح بين عدوى معقمة مرض القاتل تتقدم بنشاط. الشكل الأكثر شيوعاً هو السل الكامنة، التي هي غير متناظرة، ولكن لديه القدرة على إعادة تنشيط في مرض مداهم. مؤخرا أثبتت الزرد الكبار والممرض الطبيعية بكتريا مارينوم تكون نموذجا ينطبق على دراسة الطيف واسعة من مرض السل. الأهم من ذلك، يمكن دراسة الكمون عفوية وإعادة تنشيط، فضلا عن الاستجابات المناعية التكيفية في سياق الإصابة المتفطرات في هذا النموذج. في هذه المقالة، نحن تصف طرق العدوى التجريبية للكبار الزرد، جمع الأجهزة الداخلية لاستخلاص الأحماض النووية لقياس الأحمال المتفطرات والاستجابات المناعية المضيف قبل PCR الكمي. في-منزل--وضعت، M. marinum-مقايسة qPCR محددة أكثر حساسية من الأساليب التقليدية والطلاء، كما يكشف أيضا الحمض النووي من المتفطرة غير تقسيم أو نائمة أو ميتة مؤخرا. كما يتم استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من نفس الشخص، فمن الممكن لدراسة العلاقات بين الدولة المريضة، والتعبير الجيني المضيف والممرض. النموذج الزرد الكبار للسل وهكذا تقدم نفسها على أنها نظام التطبيق عالية وغير الثدييات في فيفو لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية، ونموذج مقبولة لعلم الأحياء الفقارية شيوعاً. الزرد وقد تم تكييف العديد من مجالات البحوث نمذجة الأمراض البشرية واضطرابات تتراوح بين1 من السرطان وأمراض القلب2 العدوى والدراسات المناعية لعدة البكتيرية 3 و4 من العدوى الفيروسية , 5-وبالإضافة إلى ذلك، قد أحرزت التنمية السابقين الرحم الأجنة الزرد الزرد نموذج شعبية في علم الأحياء التنموي6 وعلم السموم7،8.
في العديد من مجالات البحوث، بما في ذلك الإصابة بالبيولوجيا، ويشيع استخدام اليرقات الزرد شفافة بصريا. تظهر الخلايا المناعية الأولى داخل ح 24 وظيفة التسميد (hpf)، عندما الضامة البدائية هي الكشف عن9. العَدلات هي الخلايا المناعية التالية تظهر حوالي 33 هبف10. وهكذا قابلة اليرقات الزرد للدراسة في المراحل المبكرة من العدوى، ودور الحصانة الفطرية في غياب الخلايا المناعية التكيفية11. ومع ذلك، يوفر الزرد الكبار مع نظامها المناعي التكيفي تعمل بكامل طاقتها طبقة إضافية من التعقيد لتجارب العدوى. يمكن كشف خلايا تي حول 3 أيام بعد الإخصاب12، وب الخلايا قادرة على إنتاج أجسام مضادة الوظيفية قبل 4 أسابيع بعد الإخصاب13. وقد الزرد الكبار جميع النظراء الرئيسيين لنظام المناعة الفطرية وتكيفية الثدييات. تم العثور على الاختلافات الرئيسية بين immune systems الأسماك والبشر في إيسوتيبيس جسم فضلا عن تشريح الأنسجة اللمفاوية. وقد الزرد جسم سوى ثلاثة فصول14، بينما البشر لديهم خمسة15. نظراً لغياب نخاع العظام والغدد الليمفاوية، الأجهزة اللمفاوية الأولية في الأسماك هي الكلي و الغدة الصعترية16 والطحال، والكلى والقناة الهضمية بمثابة أجهزة اللمفاوية الثانوية17. وعلى الرغم من هذه الاختلافات، مع ترسانتها حصانة كاملة من الخلايا الفطرية وقابلة للتكيف، الزرد الكبار نموذج العالية المطبقة، وسهلة الاستخدام، وغير الثدييات لدراسات التفاعل المضيف الممرض.
الزرد أنشئت في الآونة الأخيرة نموذجا عمليا لدراسة السل18،،من1920،،من2122. السل مرض الهواء الناجم عن بكتريا السل. ووفقا "منظمة الصحة العالمية"، السل تسبب1.7 مليون حالة وفاة في عام 2016، وهو السبب الرئيسي للوفاة ممرض واحد في جميع أنحاء العالم23. الفئران24،25، الأرانب26 و27 من المقدمات غير البشرية نماذج الحيوان الأكثر شهرة في بحوث السل لكن كل وجه قصورها. يشبه نموذج الرئيسيات غير البشرية من الإصابة السل م الأمراض البشرية الأكثر تطابقاً، ولكن استخدام هذا النموذج محدودة بسبب اعتبارات أخلاقية خطيرة. نماذج حيوانية أخرى تعيق المضيف-خصوصية السل م الذي يؤثر على باثولوجيا المرض. طائفة واسعة من نتائج الإصابة والمرض في الأمراض البشرية على الأرجح أكبر مشكلة في نمذجة السل: السل مرض متغايرة جداً تتراوح من تعقيم الحصانة للإصابة الكامنة والنشطة والمعاد تنشيطها28 ، التي يمكن أن يكون من الصعب استنساخها ونموذج تجريبيا.
متفطره مارينوم قريب من السل م مع أورثولوجوس ~ 3,000 البروتينات بنسبة 85 في المائة من الأحماض الأمينية الهوية29. وبطبيعة الحال يصيب M. marinum الزرد المنتجة حبيبية، السمات المميزة لمرض السل، في19،الأجهزة الداخلية في30. خلافا لسائر النماذج الحيوانية المستخدمة في بحوث السل، الزرد تنتج ذرية كثيرة وأنه يتطلب مساحة محدودة فقط والأهم من ذلك، أنها نيوروفيسيولوجيكالي نموذج السل الفقاريات أقل البلدان نمواً المتاحة. بالإضافة إلى ذلك، تسبب العدوى M. marinum العدوى الكامنة، والمرض النشطة أو التعقيم حتى الإصابة المتفطرات في الزرد الكبار عن كثب محاكاة طيف نتائج مرض السل البشري19، 31 , 32-هنا، يمكننا وصف أساليب لنموذج تجريبي السل الزرد الكبار بحقن M. marinum في تجويف البطن واستخدام PCR الكمي لقياس الأحمال المتفطرات والاستجابات المناعية من الزرد عينات الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي الزرد أقرها "المجلس تجربة الحيوان" في فنلندا (ESAVI/8245/04.10.07/2015). أساليب تجري وفقا للقانون (497/2013) والمرسوم الحكومي (564/2013) المتعلق بحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية أو تعليمية في فنلندا.
1-استزراع بكتريا مارينوم
ملاحظة: نظراً لبكتريا مارينوم ممرض قادرة على التسبب في إصابات سطحية في البشر، معرفة المبادئ التوجيهية المحلية للسلامة الشخصية والتخلص من النفايات واقية قبل البدء في العمل مع هذه البكتيريا.
- الثقافة M. marinum على ح 7 10 لوحة تستكمل مع 10% أوادك (حمض الأولييك، الزلال، سكر العنب، الكاتلاز) الإثراء و 0.5% v/v من الجلسرين في 29 درجة مئوية لمدة 5 أيام على الأقل. الحفاظ على الثقافات M. marinum بأخذ البكتيريا الطازجة من الثلاجة كل أسبوعين ونقل إلى لوحة جديدة كل أسبوع.
ملاحظة: M. marinum ممرض أسماك طبيعية إصابة الأنواع المائية ومن المهم اتخاذ الاحتياطات اللازمة لعدم تلويث مخزون الزرد بالبكتيريا. يجب أن تبقى منفصلة عن مرافق تربية الزرد مصابة والعناصر الملوثة بالبكتيريا. - استخدم حلقة تلقيح معقمة 1-ميليلتر لنقل أسيبتيكالي لوبفول M. marinum البكتيرية الكتلة قارورة ثقافة خلية التي تحتوي على 10 مل ح 7 9 المتوسطة مع تخصيب ADC (الزلال، وسكر العنب، كاتالاز) 10%، 0.2% v/v بوليسوربيت 80 و 0.2% v/v من والغليسيرول. ثقافة 3 – 4 أيام تقريبا OD600 (الكثافة البصرية) من 0.7 في 29 درجة مئوية في الظلام دون المصافحة. ترك الغطاء فضفاض، أو استخدام قبعة عامل تصفية، للسماح بتبادل الغازات الكافية.
ملاحظة: يتم إضافة بولي سوربات 80 إلى وسيلة لمنع تراكم البكتيريا. وباﻹضافة إلى ذلك، والتعرض للضوء يؤدي إلى التغيرات المظهرية في المستعمرات البكتيرية (مثلاً، يتغير لون من الأبيض إلى اللون الأصفر). لتجنب هذا، تبقى الثقافات في الظلام. - قياس قيمة600OD مع جهاز المطياف الضوئي. تمييع ثقافة السائل ل التطوير التنظيمي600 من 0.07 – 0.09 ومواصلة استزراع لمدة يومين في 29 درجة مئوية في الظلام دون المصافحة. اترك الغطاء فضفاض.
ملاحظة: خلال هذين اليومين، سيصل إلى تعليق البكتيرية OD600للمقابلة حوالي 0.5 إلى سجل-مرحلة مبكرة.
2-إعداد الحل الجرثومي لإصابة البالغين الزرد
- نقل تعليق البكتيرية في ومبومو عقيمة كبيرة أو أنبوب 15 مل ووضعه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح بكتل أكبر لتسوية.
- نقل مل 5 – 7 أعلى من التعليق في أنبوب نظيف أو ومبومو وقياس OD600. استخدم هذه المرحلة العليا من التعليق للعدوى.
- جمع 1 مل ثقافة M. marinum إلى أنبوب الطازجة والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 10,000 س ز. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة.
- مخفف للوصول إلى تركيز البكتيرية المطلوب باستخدام 1 العقيمة x برنامج تلفزيوني مع 0.3 ملغ/مل الفينول الأحمر كتتبع. تقسيم تعليق المخفف إلى مختبرين الثلاثة.
ملاحظة: استخدم OD سلفا600 مقابل زيمبابوي (الوحدات المكونة للمستعمرة)/ميليلتر منحنى لتقدير تمييع المطلوبة للحصول على عدد المطلوبين من البكتيريا في حجم حقن 5 ميليلتر34. الترابط بين OD600 وتركيز لتعليق البكتيرية تحتاج إلى التحقق من صحتها قبل بدء التجارب العدوى الفعلية. الاحتياطي مدة أسبوعين لجمع هذا التحقق من صحة البيانات. - استخدام المحاقن 1 مل، ببطء سحب تعليق عن طريق ز 27 إبرة 3 x. لكل قاسمة، القيام بهذه الخطوة فقط قبل الاستخدام.
ملاحظة: لا تستخدم نفس الحل الجرثومي لأكثر من 2 ح.
3-التجريبية العدوى M. marinum مع "حقن داخل"
- "الماصة؛" معالجة تجميعية 5 ميليلتر من الحل البكتيرية المخفف على قطعة من الفيلم بارافيلم وسحب الحبرية في إبرة الأنسولين 30 جرام.
- استخدام شهر 5 – 8-الأسماك البرية من نوع القديم ومتحولة rag1−/−hu1999 للتجربة. تخدير الزرد الكبار في خزان المياه مع 0.02% 3-امينوبنزويك إيثيل حمض إستر (pH 7.0). موقف الجانب البطني الأسماك يصل إلى فتحه على بلاستيك رغوة رطبة.
ملاحظة: خرقه-/- الأسماك متحولة ليست قادرة على الخضوع جزئ جسدية وإنتاج خلايا تي وب الوظيفية. - حقن الإبرة بين الزعانف الحوضية في زاوية 45 درجة تقريبا. تبقى فتح الإبرة صعودا ليلاحظ أن افتتاح كامل داخل تجويف البطن. حقن ببطء بتعليق البكتيرية وإزالة الإبرة بعناية.
ملاحظة: في حالة التتبع الحمراء هو تسرب من الأسماك عند الحقن، استبعاد الأسماك من التجربة. - فورا بعد الحقن، نقل الأسماك في خزان انتعاش بمياه خزان جديد.
- تأخذ عينات من تعليق البكتيرية في 7 ح 10 لوحات كل 15 دقيقة من البكتيريا اليكووت في الاستخدام واحتضان البكتيريا في 29 درجة مئوية لمدة 5 أيام والتحقق من جرعة العدوى عن طريق عد المستعمرات على اللوحات.
- تحقق الرفاه للأسماك بانتظام و euthanize أي سمكة مع أعراض الإصابة بنسبة 0.02 في المائة أكثر تركيز 3-امينوبنزويك إيثيل حمض إستر (pH 7.0).
ملاحظة: تقريبا، 7% الزرد الكبار المصابين 34 ± زيمبابوي 15 وإصابة 30 في المائة الزرد مع 2029 ± زيمبابوي 709 سوف يكون قد الأعراض قبل 8 أسابيع19. قد تتضمن الأعراض غير طبيعية للسباحة، وعدم الاستجابة للمس أو يلهث، وذمة أو إضاعة يمكن ملاحظتها. - الحفاظ على الزرد وفقا للمعايير المشتركة35.
4-مجموعة من الأجهزة الداخلية
- Euthanize الزرد مع جرعة زائدة من إستر إيثيل حمض 3-امينوبنزويك (ما يزيد عن 0.02% تركيز، درجة الحموضة 7.0) في خزان المياه.
- أدخل دبوس واحد الخلفي لأشعة برانتشيوستيجال، وآخر عن طريق الذيل تك الأسماك إلى ساحة.
- فتح تجويف البطن كله مع مشرط وجمع الأجهزة الداخلية باستخدام ملعقة صغيرة والملقط حادة انتهت. تبدأ من القلب والعمل على طول العمود الفقري نحو ذيل لفصل جميع الأجهزة الداخلية في كتلة واحدة.
ملاحظة: تأكد من جمع جميع أنسجة الكلي عن طريق إلغاء على طول العمود الفقري مع الملعقة. - وأخيراً، استخدام الملقط لفصل الأمعاء المجاور مجرور ونقل الأجهزة إلى أنبوب تجانس 1.5 مل مع ست حبات السيراميك مم 2.8. ضع فورا على الثلج الجاف لتجميد العينة. ويمكن تخزين العينة في-80 درجة مئوية حتى تجانس.
- شطف في الصكوك مع الإيثانول 70% بين الأفراد.
5. التجانس، والجيش الملكي النيبالي الاستخراج من كتلة جهاز.
ملاحظة: يتم تعديل الأسلوب من بروتوكولات جامعة ستانفورد36.
- إضافة حل ثيوسيانات الفينول غوانيدين المستخدمة لاستخراج الحمض النووي (جدول المواد) على رأس العينة إلى إجمالي حجم 1,500 ميليلتر. التأكد من أن العينة تغطي كحد أقصى 10% الحجم الإجمالي.
تنبيه: هو الحجم المتوقع للأنسجة المقطوع 100 ميليلتر. غوانيدين الفينول ثيوسيانات الحل يحتوي على السامة وغضب المركبات، ويتطلب ملابس واقية وقفازات النتريل وتعمل في غطاء دخان. لا تجمع مع التبييض أن هذا سوف يسبب تشكيل غازات سامة. قراءة صحيفة بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل الاستخدام. - مجانسة العينات باستخدام الخالطون ضرب حبة 3 مرات ل 40 s 3,200 لفة في الدقيقة. بارد على الجليد لمدة 30 ثانية بين الدورات. Sonicate العينات المتجانس في حمام مائي لمدة 9 دقائق.
- الطرد المركزي هذه العينات في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل 1,000 ميليلتر من هوموجيناتي تم مسحها في أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة.
- إضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم، فورا مزيج من فورتيكسينج لمدة 15 ثانية، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: كلوروفورم سامة ومهيجة مجمع إذا استنشق، ابتلع أو اتصلت بالجلد أو العينين. استخدام معدات السلامة اللازمة للحماية الشخصية، والعمل في غطاء دخان. قراءة صحيفة بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل الاستخدام. - الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية لفصل مراحل مائي والعضوية.
- بعناية، بنقل 500 ميليلتر من مرحلة أعلى إلى أنبوب جديد لتجنب تلويث الجيش الملكي النيبالي. إزالة وتجاهل بقية المرحلة المائية (~ 100 ميليلتر) وتخزينها في الطور البيني والمرحلة العضوية عند 4 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي.
ملاحظة: تتضمن المرحلة الأعلى الجيش الملكي النيبالي. - إضافة 500 ميليلتر من 2-بروبانول والفور مزيج من فورتيكسينج إينكوباتي س. 15 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة يعجل بالجيش الملكي النيبالي.
- الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه الجيش الملكي النيبالي. إزالة المادة طافية بيبيتينج.
- أضف 1 مل من الإيثانول 75% ودوامه لمدة 10 ق.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا، والعينات التي تحفظ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. - أجهزة الطرد المركزي في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية بيبيتينج.
- كرر الخطوات يغسل 5.9 – 5.10. إزالة المادة طافية بعناية عن طريق بيبيتينج واسمحوا بيليه أيردري في غطاء دخان.
- حل بيليه الجيش الملكي النيبالي في 500 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس وتبقى العينات على الجليد. قياس التركيزات مع جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي أو بمعدات مماثلة. مخزن الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
6-تنقية الزرد شارك المستخرجة والحمض النووي المتفطرات
- إعداد المخزن مؤقت الخلفي-استخراج (باب) عن طريق تذويب 118.2 ز من غوانيدين ثيوسيانات (تركيز نهائي م 4)، ز 3.68 سترات الصوديوم (التركيز النهائي 50 مم) وز 30.29 قاعدة تريس الحرة (تركيز نهائي 1 م) في 120 مل مياه خالية من نوكلاس (أيار/مايو تتطلب إثارة بين عشية وضحاها). إضافة المياه خالية من نوكلياسي إلى نهائي إجمالي حجم 250 مل وتصفية لتعقيم الحل.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. لا تجمع بين باب التبييض كما أنها تتفاعل لإنتاج غازات سامة مثل سيانيد الهيدروجين وكلوريد الهيدروجين. - استخدام الطور البيني والمرحلة العضوية للعينة لاستخراج الحمض النووي المتفطرات. إضافة 500 ميكروليتر من باب لكل أنبوبة. ميكس على نطاق واسع لمدة 10 دقيقة بانعكاس في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 12,000 ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ونقل 500 ميليلتر المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي لأنبوب جديد بعناية.
- إضافة 400 ميكروليتر من 2-بروبانول. مزيج من عكس واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي هذه العينات في س 12,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. بيليه التي تحتوي على الحمض النووي يجب أن تكون مرئية في هذه المرحلة. بعناية إزالة المادة طافية بيبيتينج.
- إضافة 800 ميكروليتر من الإيثانول 70%. أغسل بيليه بانعكاس. دوامة لا العينات عند هذه النقطة، كما يفعل الحمض النووي ينهار بسهولة.
- الطرد المركزي هذه العينات في س 12,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية بيبيتينج. تكرار الغسيل الإيثانول (الخطوات 6، 6 و 6-7).
- إزالة الإيثانول بعناية بيبيتينج. العينات أيردري لحل 5 – 10 دقيقة بيليه في 200 ميكروليتر من المياه خالية من نوكلاس.
- قياس تركيزات الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي أو بمعدات مماثلة. ويمكن تخزين الحمض النووي في 4 درجات مئوية أو عند-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
7-الكمي PCR لقياس الأحمال المتفطرات
- إعداد qPCR رد فعل يمزج مع لا-روكس (كاربوكسي-س-والرودامين) ضد M. marinum الداخلية يدون مباعدة (البحث عن) بين 16S-23S لها وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع MMITS1 الإشعال (الجدول 1). "الماصة؛" مزيج رد فعل وعينه تخفيف كالتكرارات على لوحة 96-كذلك مناسبة قبكر. وتشمل سلسلة تمييع قياسية الحمض النووي كمية معروفة من البكتيريا في كل تشغيل.
ملاحظة: المتوقع تحميل M. marinum كل الأسماك يمكن أن تتراوح من 0 زيمبابوي إلى زيمبابوي 1,000,000 في 4 wpi. يمكن إجراء المقايسة qPCR أيضا مع مجموعات أخرى qPCR لكن درجة الحرارة انلينغ للإشعال يجب أن تكون إعادة الأمثل. - ختم اللوحة مع فيلم شفافة بصريا والطرد المركزي اللوحة في س 2,000 ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- قم بتشغيل برنامج قبكر هو مبين في الجدول 2.
- استخدام المنحنى القياسي، حساب العدد من البكتيريا في عينة كاملة من الأسماك.
8-الدناز معاملة عينات الحمض النووي الريبي
- لإزالة أي بقايا ممكن من الحمض النووي من الجيش الملكي النيبالي، الاضطلاع الدناز أنا العلاج. ذوبان الجليد عينات الحمض النووي الريبي على الجليد.
ملاحظة: تأكد من استخدام فقط خالية من رناسي المعدات والحلول ومسح السطح العامل والماصات مع كاشف إزالة تلوث القضاء على رناسيس (جدول المواد) قبل البدء في العمل. ارتداء معطف مختبر اكمام طويلة وقفازات لحماية العينات الخاصة بك. - إعداد 10 ميكروليتر الدناز أنا يمزج رد فعل على الجليد طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. ميكس 1 ميكروليتر من الدناز أنا، ميكروليتر 1 من 10 × الدناز المخزن المؤقت و 8 ميكروليتر من الحمض النووي الريبي العينة بما في ذلك كحد أقصى 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي.
- مزيج ردود فعل (لا فورتيكسينج) بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- قبل الحرارة-المنظمة، إضافة 1 ميليلتر من 50 مم أدتا إلى كل عينة 10 ميليلتر. إذا لم يتم إضافة يدتا، سيخضع الجيش الملكي النيبالي للتدهور الكيميائي عند تسخينها.
- احتضان لمدة 10 دقائق عند 65 درجة الحرارة--إلغاء تنشيط "الدناز أولاً مواصلة" مباشرة إلى توليف كدنا أو تخزين الدناز معاملة الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
9-كدنا التوليف
- إبقاء جميع الكواشف والعينات في الثلج وإعداد يمزج الرد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لمزيج رد فعل 5 ميكروليتر، تشمل 1 ميكروليتر من عكس ميكس ماجستير النسخ، ميكروليتر 3 من المياه خالية من نوكلياسي و 1 ميكروليتر من الدناز معاملة الجيش الملكي النيبالي.
- المزيج بلطف ردود فعل النسخ العكسي وإيجاز تدور الأنبوب، إذا لزم الأمر.
- وضع العينات في جهاز PCR واستخدام البرنامج المبين في الجدول 3.
- تمييع كدنا في المياه خالية من نوكلياسي قبكر بتركيز أقصى 2.5 نانوغرام/ميكروليتر، إذا لزم الأمر. ويمكن تخزين كدنا في-20 درجة مئوية.
10-قياس التعبير الجيني الزرد التي PCR الكمي
- إعداد مزيج رئيسي قبكر على الجليد طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة وحماية من الضوء. استخدام كبسولة تفجير أدخلت في الجدول 1.
ملاحظة: على حساب إضعاف التعريفي لكل الجينات، قياس التعبير أيضا من عينة أساس مجمعة المستخرجة من الزرد صحية 6. - إعداد replicates كل عينة و "الماصة؛" يمزج رد فعل على لوحة قبكر. ختم اللوحة مع فيلم شفافة بصريا والطرد المركزي اللوحة في 2,000 س ز 2 دقيقة عند 4 درجة مئوية قبل البدء في التشغيل.
- تشغيل قبكر استخدام البرنامج المبين في الجدول 4 مع درجة حرارة انلينغ اعتماداً على زوج التمهيدي (الجدول 1).
- تحليل نسبة التعبير الجيني جينات حفظ البيت (loopern437) بالمقارنة مع الأسلوب ΔCt باستخدام المعادلة:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الممرض الأسماك الطبيعية marinum متفطره يصيب الأجهزة الداخلية من الزرد وينتج من عدوى المجموعية مع حبيبية الأشيع مرئية19. الزرد البالغين المصابين M. marinum بحقنه داخل. يتم استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، وتحميل المتفطرات تقاس بكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر) باستخدام الحمض النووي كالقالب. الخطوط العريضة للأسلوب الذي يظهر في الشكل 1.
العدد الأولى للبكتيريا المستخدمة لإصابة الأسماك عامل حاسم لنتائج الإصابة. جرعة عالية من عدوى من M. marinum (~ 2,000 زيمبابوي) يؤدي إلى مرض تقدمية التي يواصل الأحمال المتفطرات زيادة حتى يصل متوسط الحمولة البكتيرية البكتيريا حوالي 5 مليون (الشكل 2A) في نهاية المطاف قتل الأسماك. جرعة منخفضة (~ 20 – 90 زيمبابوي) M. marinum يؤدي إلى تطوير طائفة المرض مماثلة للتي شهدتها البشرية السل (الشكل 2). وتواصل الحمولة البكتيرية زيادة حتى حوالي 4 – 7 أسابيع (الشكل 2A و الشكل 3 ألف)، بعد ذلك في معظم الأسماك يصل المرض إلى حالة من الثبات. الشكل 2B يبين مثال لتوزيع النتائج المرض مع مرض جرعة منخفضة: حوالي 7% الزرد المصابة كانت غير قادر على تقييد النمو الجرثومي. وضع هؤلاء الأفراد مرض تدريجي الأولية وأنهم لقوا مصرعهم خلال شهرين بعد الإصابة. حوالي 10% الأفراد مسح العدوى المتفطرات قبل 4 أسابيع. 65% المتبقية من السكان الأسماك نمواً عدوى المتفطرات كامنة بأعباء البكتيرية المطرد. ومع ذلك، بين 8 و 32 أسبوعا من الإصابة، بنسبة 18 في المائة، تنشيط العدوى الكامنة تلقائياً مما يؤدي إلى استفحال المرض.
باستخدام خرقه-/- الأسماك متحولة، فمن الممكن لدراسة دور الاستجابات المناعية التكيفية في الأسماك الكبار. خرقه-/- الأسماك متحولة لا بما فيه الكفاية تحد من نمو البكتيريا مما يؤدي إلى ارتفاع الأحمال البكتيرية (الشكل 3A) ، وازدياد معدلات المراضة (الشكل 3B)، يدل بوضوح أهمية مناعة التكيفية في السيطرة على العدوى المتفطرات. أيضا، يمكن دراسة أهمية الاستجابات التكيفية في استحضار بعض الردود سيتوكين في الإصابة المتفطرات في هذا النموذج. هنا، نحن تبين أن الاستجابة التكيفية مطلوب لكفاءة استحثاث انترلوكين 4 (IL4) (الشكل 3) ولكن هل يمكن الاستغناء عنها لتحريض الانترفيرون γ (IFNγ) في wpi 4 (الشكل 3D). الانترفيرون γ سيتوكين قيادة الاستجابة ضد العوامل الممرضة داخل الخلايا بينما انترلوكين 4 وسيط مشترك في الاستجابة المناعية التكيفية ضد العوامل الممرضة خارج الخلية. مستويات التعبير أعلى بكثير من il4 في البرية من نوع المجموعة مقارنة مع خرقه-/- الأسماك متحولة يشير إلى أهمية الاستجابات التكيفية خلطيه في العدوى المتفطرات (الشكل 3).
رقم 1: سير العمل لدراسة وضع الأحمال المتفطرات في الزرد الكبار- الزرد البالغين مصابون بحقنه داخل من M. marinum. يتم استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأجهزة الداخلية للأسماك ويتم تحليل الحمل M. marinum والاستجابات المناعية للمضيف مع الكمية البلمرة المتسلسل (قبكر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: ضخ M. marinum في الزرد الكبار يسبب طائفة دول المرض. تم حقن الزرد (A) مع مستوى منخفض (34 تردداتها زيمبابوي) أو جرعة عالية من M. marinum(±709 2029 زيمبابوي). متوسط الأحمال للأسماك 5 (باستثناء جرعة عالية 32 أسبوعا، ن = 2) تظهر مع الإحصاءات جرعة منخفضة التنمية المستدامة.: * ف < 0.05 مقارنة مع الأسبوع 1، * * ف < 0.05 بالمقارنة مع 1 و 2 في الأسبوع. إحصائيات جرعة عالية: * * * ف < 0.05 بالمقارنة مع 1، 2، 8 و 11 و 20 wk. ¤ جرعة منخفضة مقابل جرعة عالية ف < 0.05. تعديل من بركة et al. 19سبتمبر 2012. (ب) توزيع نموذجي من نتائج المرض داخل الزرد البرية من نوع سكان المصابين بجرعة منخفضة من M. marinum. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مناعة التكيفية يؤثر على مسار العدوى المتفطرات في الزرد الكبار- الكبار البرية من نوع (wt) و rag1 (−/−) الزرد كانوا مصابين بجرعة منخفضة (ن = 30) من M. marinum. (أ) متوسط المتفطرات الأحمال كانت تقاس qPCR في 2 و 4 و 7 أسابيع بعد الإصابة (wpi) (n = 10) * ف < 0.05. (ب) كانت euthanized الأسماك على تطوير أعراض المرض وتم إنشاؤها المؤامرات البقاء على قيد الحياة. (ج)-تم قياس مستويات التعبير من il4 في 4 wpi. تم قياس مستويات (د) التعبير من IFNγ في 4 wpi. تعديل (A و B) من بركة et al. عام 201219. (C و D) تعديل من Hammarén et al. عام 201438. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الجينات | تسلسل التمهيدي | درجة حرارة انلينغ |
| MMITS1 | F: كاككاكجاجااكاكتككا | 65 |
| 16-23SITS موضع AB548718 للقياس الكمي M. marinum | R: أكاتكككجااككاكاجاج | |
| loopern4 | F: تجاجكتجااكتتاكاجاكاكات | 61 |
| وأعرب عن العناصر المتكررة | R: أجاكتتجتجتكتككاجاتج | |
| il4 | جكاجاتجكتتجاجج | 59.5 |
| زدب--جين--100204-1 | جكاجتتككاجتكككجتات | |
| ifnγ1-2 | F: ججكجاتكاجاااكجاككك، | 61 |
| زدب--جين-040629-1 | R: تاجككتجككجتكتكتجكجت |
الجدول 1: تسلسل التمهيدي ودرجات الحرارة انلينغ. ترتيب الإشعال المستخدمة وعلى درجات حرارة انلينغ الأمثل. يكون قد تم تحسين الإشعال لنسخة الرنا الريباسي 16S-23S M. marinum لمجموعة قبكر لا--رواكس والإشعال الأخرى في روكس بما في ذلك عدة قبكر.
| الخطوة | الوقت | درجة الحرارة |
| 1 | 3 دقيقة | 95 درجة مئوية |
| 2 | 5 s | 95 درجة مئوية |
| 3 | 10 s | 65 درجة مئوية |
| 4 | 5 s | 72 درجة مئوية (الأسفار الكشف) |
| 5 | انتقل إلى الخطوة 2. 39 مرات | |
| 6 | انصهار منحنى التحليل 55-95 درجة مئوية مع فواصل 0.5 درجة مئوية | |
| 7 | إلى الأبد | 4 درجة مئوية |
الجدول 2: برنامج قبكر لقياس M. marinum الحمض النووي- بروتوكول qPCR المصممة طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة والأمثل لقياس M. marinum الحمض النووي من عينات الزرد.
| الوقت | درجة الحرارة |
| 5 دقيقة | 25 درجة مئوية |
| 30 دقيقة | 42 درجة مئوية |
| 5 دقيقة | 85 درجة مئوية |
| إلى الأبد | 4 درجة مئوية |
الجدول 3: برنامج توليف كدنا. البروتوكول المتعلق بتوليف كدنا من الجيش الملكي النيبالي المستخرجة من الزرد المصابة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
| الخطوة | الوقت | درجة الحرارة |
| 1 | 30 s | 95 درجة مئوية |
| 2 | 12 s | 95 درجة مئوية |
| 3 | 30 s | الصلب درجة مئوية |
| 4 | انتقل إلى الخطوة 2. 39 مرات | |
| 5 | انصهار منحنى التحليل 65-95 درجة مئوية مع فواصل 0.5 درجة مئوية | |
| 6 | إلى الأبد | 4 درجة مئوية |
الجدول 4: برنامج قبكر لقياس التعبير الجيني للمضيف. بروتوكول qPCR المصممة طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة والأمثل لقياس التعبير عن الجينات الزرد مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا تطبيق يستند إلى qPCR لقياس الأحمال المتفطرات من الحمض النووي المستخرج من الأنسجة المصابة تجريبيا الزرد الكبار. يستند هذا التطبيق على كبسولة تفجير تصميم حول تسلسل الداخلية يدون مباعدة الرنا الريباسي 16S-23S40. ويقدر مجموع الحمل المتفطرات في عينة أسماك استخدام منحنى قياسي وأعد من الحمض النووي المستخرج من عدد معروف من البكتيريا المستزرعة وافتراض أن بكتيريا واحد لديه نسخة واحدة من الجينوم، في أي وقت من الأوقات. حد الكشف عن قبكر م. مارينوم--هو ما يقرب من 100 مستعمرة تشكيل وحدات18. ميزة واضحة للأسلوب التقليدي والطلاء بالمقارنة مع أن البكتيريا النشطة وعدم تقسيم نائمة يمكن الكشف عنها. وبالإضافة إلى ذلك، هو الالتفاف حول مشكلة شائعة تلويث النمو على لوحات الثقافة من الأنسجة الزرد بهذا النهج. ومع ذلك، كما يتم استخدام الحمض النووي كالقالب، من الممكن أن بعض النسخ قياس يمكن أن يستمد من الحمض النووي للبكتيريا التي قد توفي مؤخرا جداً. ميزة كبيرة من البروتوكول على أساس الحمض النووي أن كما يمكن استخراج كل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي (كذلك البروتينات، ولا هو موضح هنا) من نفس الشخص، تحميل المتفطرات الفرد يمكن دمجها مع البيانات التعبير الجيني على حد سواء المضيف والبكتيريا.
الجرعات M. marinum عامل حاسم في نتائج الإصابة. انخفاض M. marinum (~ 20 – 90 زيمبابوي) جرعة العدوى ينتج طائفة الحالات المرضية مع الكمون كالشكل الأكثر شيوعاً. إذا كانت جرعة العدوى حسب ترتيب الآلاف، يتطور مرض أكثر تقدمية في غالبية الأفراد. وكما هو معروف أن الجرعة المعدية الطبيعية منخفضة في السل البشري41، باستخدام جرعة منخفضة من M. marinum في نموذج الزرد من المرجح أن ينتج عدوى أكثر طبيعية. للوصول إلى الجرعة الصحيحة، تأكد من التحقق من صحة العلاقة بين OD600 والوحدات المكونة للمستعمرة قبل البدء بأي تجارب. الاختلاف الطبيعي جرعة العدوى مطلي حوالي 30% ولا يعتبر مشكلة. ومع ذلك، من المهم للتحقق من أن حجم كامل 5 ميليلتر من تعليق الجرثومي لا يزال داخل السمك. تسرب من الحل الحقن يؤدي تباين إضافي في جرعة العدوى. بالإضافة إلى جرعة العدوى، سلالة البكتيريا يمكن أن يؤثر على تطور المرض. قد بينت ضراوة من مختلف M. marinum يمكن أن يغير سلالات بين السلالات. سلالات الأكثر شيوعاً اثنين من ATCC927 (الأسماك المعزولة السلالة المستخدمة في هذه التجارب) وسلالة م. بيد أن هذه السلالات تختلف اختلافاً كبيرا في ضراوة. سلالة م عزل الإنسان يتطور مرض أكثر تقدمية بينما سلالة عزل الأسماك ينتج مرض أكثر اعتدالا كذلك مناسبة لدراسة أشكال العدوى المتفطرات33الكامنة. أيضا قد تغير ضراوة البكتيريا داخل سلالة إذا البكتيريا متسلسل منقولا من ثقافة إلى أخرى، التي يمكن الوقاية منها عن طريق اتخاذ mycobacteria الطازجة من ثلاجة مخزون يكفي في كثير من الأحيان.
في المختبر استزراع ببطء تقسيم M. marinum دون المضادات الحيوية معرضة للتلوث. ولذلك، يتطلب معالجة البكتيريا النهج العقيم صارمة في غطاء الاندفاق الصفحي. ويمكن الكشف عن التلوث المحتمل في الثقافة كعاليه جداً600 OD قيمة، تعليق البكتيرية الفردية أو المستعمرات. هي المستعمرات M. marinum الأبيض عادة غامض ذو حدين ومسطحة ومات في اللون. M. marinum الثقافات حساسة للضوء وتبدأ في إنتاج الصباغ الأصفر عند التعرض للضوء. يمكن استخدام هذا الصباغ الأصفر لتمييز M. marinum مستعمرات من البكتيريا الأخرى بعد العدوى. يمكن أن تسبب الملوثات السمك يموت قريبا بعد الإصابة. عادة، لا تظهر الأعراض الأولى للإصابة بجرعة منخفضة قبل 3 أسابيع بعد الإصابة ويرجح أي نفوق قبل هذه النقطة الزمنية بسبب التلوث في تعليق البكتيرية أو الصدمات النفسية التي يسببها أثناء الحقن.
حساسة جداً لاستر إيثيل حمض 3-امينوبنزويك الزرد الكبار وعدم البقاء على قيد الحياة إذا كان زمن التعرض طويل جداً أو تركيز المخدر مرتفع جداً. ولذلك، عندما إصابة، الزرد ينبغي أن يتعرض لمخدر فقط للحد أدنى الوقت لتحقيق التخدير جيدة (~ 1 – 2 دقيقة). بعد الإصابة، يتم الاحتفاظ الزرد الكبار في مجموعات في درجة حرارة المياه من 26-28 درجة مئوية. إذا كانت درجة الحرارة أعلى أو أقل من ذلك، أنها قد تؤثر على معدل النمو M. marinum وحركية من العدوى. كما أن جودة المياه في خزان (النوعية الميكروبيولوجية، تركيز الملح، درجة الحموضة، وتشبع الأكسجين) جزء مهم ضمان تجربة ناجحة. المراقبة الصحية للأسماك يجب أن تنفذ يوميا والأسماك التي تظهر أعراض الإصابة بحاجة إلى إزالة من المجموعة و euthanized. إذا كان السمك يموت في الدبابة، قد تصبح الأسماك الأخرى إعادة المصابين من خلال القناة الهضمية، مما سيؤثر على تطور الإصابة.
النموذج الزرد استخداماً اليرقات من السل المنطبق على الحصانة الفطرية الدراسة، التي توجه هذه التجارب إلى مجموعة فرعية محدودة من التفاعلات بين الميكروبات والمضيف. استخدام الزرد الكبار يجعل من الممكن لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية والتكيف على السواء في32،18،نموذجي تنوعاً39. الزرد الكبار تقدم نفسها كنموذج فقاريات مريحة لدراسة طائفة كاملة من السل. مع تعرض لجرعة منخفضة من M. marinum، 7 في المائة من السكان الأسماك وضع مرض التدريجي الابتدائي، 10% قادرون على تعقيم العدوى، 65% وضع المرض الكامنة ويحدث تنشيط عفوية في 18% (الشكل 2). طيف مرض يشبه التي ينظر في السل البشري، الذي وضع الغالبية العظمى من أمراض كامنة، 4 – 14 في المائة تقريبا تنتج العدوى النشطة الرئيسية خلال السنوات الخمس الأولى بعد الإصابة42، 10 – 20% من شدة يبدو الأشخاص المعرضين لتكون قادرة على تعقيم العدوى43 وتنشيط 5-10% الإصابات الكامنة44. الاختلافات في علم الوراثة للمضيفين يؤثر على قابلية للسل و تطور المرض45. ويتضح ذلك أيضا في السكان الزرد وراثيا متباينة للغاية على عكس العديد من غيرها مختبر الحيوانات46،47. التنوع الوراثي الطبيعي يجعلها نموذجا عاليا المطبقة في البحث عن الاستجابات المناعية الأمثل في هذه الأمراض المتعددة العوامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل قبل الفنلندي الثقافية مؤسسة (H.L.)، "تامبيري السل مؤسسة" (H.L.، ل. م. ف. M.M.H.، عضو البرلمان)، مؤسسة "الرابطة الفنلندية" لمكافحة السل (سومن توبيركولوسين فاستوستاميسيهديستيكسين Säätiö) (H.L.، M.M.H.، عضو البرلمان)، سيغريد Jusélius مؤسسة (عضو البرلمان)، إميل ألتونن مؤسسة (M.M.H.)، وجين ومؤسسة أركو آتوس (عضو البرلمان) وأكاديمية فنلندا (عضو البرلمان). لينا ماكينن، بيبو لينا حنا وجينا Ilomäki معترف بها للمساعدة التقنية. يعترف الكتاب المختبر الزرد تامبيري لخدمتهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 mL homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
References
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A.
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L.
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
- Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S.
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al.
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
