Summary
在这里, 我们提出了一个在成年斑马鱼使用其天然致病菌分枝杆菌 marinum的人结核病模型的协议。从被感染的斑马鱼内脏中提取的 DNA 和 RNA 可以用来揭示鱼的总结核杆菌负荷和宿主对 qPCR 的免疫应答。
Abstract
结核分枝杆菌是目前最致命的人类病原体, 每年造成170万人死亡和1040万次感染。接触这种细菌会引起人类广泛的疾病谱, 从消毒感染到积极进步的致命疾病不等。最常见的形式是潜在的肺结核, 这是无症状的, 但有可能重新激活为暴发性疾病。成年斑马鱼及其天然病原体marinum 分枝杆菌最近被证明是研究结核病广泛疾病谱的适用模型。重要的是, 该模型可以研究结核杆菌感染背景下的自发潜伏期和重新激活以及适应性免疫反应。本文介绍了成年斑马鱼实验性感染的方法, 收集了用于提取核酸的结核杆菌负荷测定和宿主免疫应答的体内器官。在内部开发的, m. marinum特异性 qPCR 检测比传统的电镀方法更敏感, 因为它也检测非分裂, 休眠或最近死的分枝杆菌的 DNA。由于 DNA 和 RNA 都是从同一个体中提取出来的, 因此可以研究患病状态与寄主和病原体基因表达之间的关系。因此, 成年斑马鱼的结核病模型作为一种高度适用的非哺乳动物体内系统来研究寄主-病原体的相互作用。
Introduction
斑马鱼 (斑马斑马) 是生物医学研究中广泛使用的动物模型, 是常见脊椎动物生物学的公认模型。斑马鱼已经适应了许多领域的研究模拟人类疾病和疾病, 从癌症1和心脏病2到感染和免疫学研究的几个细菌3和病毒感染4,5. 此外, 斑马鱼胚胎的前子宫发育使斑马鱼成为发育生物学6和毒理学7,8的流行模式。
在许多研究领域, 包括感染生物学, 通常使用光学透明斑马鱼幼虫。第一个免疫细胞出现在 24 h 后受精 (hpf), 当原始巨噬细胞被检测到9。中性粒细胞是下一个免疫细胞, 出现在 33 hpf10左右。因此, 斑马鱼幼虫是可行的研究早期感染阶段和先天免疫的作用, 在缺乏自适应免疫细胞11。然而, 成年斑马鱼具有完全功能的适应性免疫系统, 为感染实验提供了额外的复杂性层。T 细胞可以检测到3天后受精12, B 细胞能够产生功能性抗体4周后受精13。成年斑马鱼拥有哺乳动物先天和适应性免疫系统的所有主要对应物。在抗体 isotypes 和淋巴组织解剖中发现了鱼类和人类免疫系统的主要区别。斑马鱼只有三抗体类14, 而人类有五15。在缺乏骨髓和淋巴结的情况下, 鱼的主要淋巴器官是肾脏和胸腺16和脾脏、肾脏和肠道作为次要淋巴器官17。尽管有这些差异, 其完全免疫武库的先天和自适应细胞, 成年斑马鱼是一个高度适用, 易于使用, 非哺乳动物模型的寄主-病原体相互作用的研究。
斑马鱼最近被建立了作为一个可行的模型研究结核病18,19,20,21,22。肺结核是由结核分枝杆菌引起的一种机载疾病。根据世界卫生组织的数据, 结核病在2016年造成1.7人死亡, 是全球23个单一病原体的主要死因。老鼠24、25、兔子26和非人类灵长类27是结核病研究中最著名的动物模型, 但它们都面临着局限性。结核菌感染的非人类灵长类模型最接近人类疾病, 但由于严重的伦理考虑, 使用这种模式是有限的。其他动物模型受到 m. 型结核病宿主特异性的阻碍, 影响到疾病病理学。结核病建模的最大问题可能是人类疾病中广泛的感染和疾病结果: 结核病是一种非常异构的疾病, 从杀菌免疫到潜在的、活跃的和重新激活的感染28, 这可能很难重现和实验模型。
marinum 分枝杆菌是 m.结核的近亲, 有3000同源蛋白, 85% 的氨基酸标识29。m. marinum自然感染斑马鱼生产肉芽肿, 肺结核的标志, 在其内脏 19,30。与其他用于结核病研究的动物模型不同, 斑马鱼生产许多后代, 它只需要有限的空间, 重要的是, 它是 neurophysiologically 最不发达的脊椎动物结核模型。此外, m marinum感染导致潜伏感染, 积极的疾病, 甚至杀菌的结核杆菌感染的成年斑马鱼密切模仿疾病的结果, 人类结核病19,31,32. 在这里, 我们描述了成人斑马鱼的实验性结核模型的方法, 注射m. marinum入腹腔, 并利用定量 PCR 测量斑马鱼的结核杆菌负荷和免疫应答组织样本。
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Protocol
所有斑马鱼实验都已获得芬兰动物实验委员会 (ESAVI/8245/04.10.07/2015) 的批准。方法是根据《法令》 (497/2013) 和政府关于保护在芬兰用于科学或教育目的的动物的法令 (564/2013) 执行的。
1. marinum 分枝杆菌的培养
注: 由于 marinum 分枝杆菌是一种能够引起人类表面感染的病原体, 在开始与这种细菌合作之前, 找出当地的人身安全和生物危害废物处置指南。
- 培养m marinum在7H10 板材补充与 10% OADC (油酸, 白蛋白, 葡萄糖, 过氧化氢酶) 丰富和 0.5% v/v 甘油在29°c 至少5天。每隔两周从冰箱中取出新鲜细菌, 每隔一周转移到一个新盘子中, 保持m marinum文化。
注: m. marinum是一种感染水生物种的天然鱼类病原体, 采取预防措施不污染斑马鱼种群与细菌是很重要的。感染的斑马鱼和被细菌污染的物品必须与繁殖设施分开。 - 使用无菌的 1-µL 接种循环灌装转移 loopful m marinum细菌质量到一个细胞培养瓶含有10毫升的7H9 培养基 10% ADC (白蛋白, 葡萄糖, 过氧化氢酶) 富集, 0.2% 伏/v 吐温80和 0.2% v/v甘油。文化为3–4天到大约 OD600 (光学密度) 0.7 在29°c 在黑暗中没有震动。离开盖子松动, 或使用过滤器帽, 以允许足够的气体交换。
注: 吐温80被添加到培养基中以防止细菌聚集。此外, 暴露于光照导致细菌菌落表型变化 (例如, 颜色由白色变为黄色)。为了避免这种情况, 在黑暗中保持文化。 - 用分光光度计测量 OD600值。稀释液体培养到600的 0.07–0.09, 并继续培养2天在29摄氏度在黑暗中不颤抖。把盖子松开。
注: 在这两天内, 细菌悬浮液将达到大约0.5 的 OD600, 相当于早期的测井阶段。
2. 细菌溶液的制备对成年斑马鱼的感染
- 将细菌悬浮液转移到一个大的无菌试管或15毫升管中, 并将其放在室温下的黑暗中15分钟, 以允许最大的团簇沉淀。
- 将悬浮液的顶5–7毫升转移到干净管或试管中, 测量外径600。使用这个顶部阶段的悬浮为感染。
- 收集1毫升的m marinum培养成一个新鲜的管和离心机3分钟 1万 x g。取出上清液, 并用重悬1毫升无菌 1x PBS 中的颗粒。
- 用0.3 毫克/毫升苯酚红色作为示踪剂, 稀释以达到所需的细菌浓度。将稀释后的悬浮液分成三整除数。
注: 使用预定的 OD600与 CFU (菌落形成单位)/µL 曲线, 估计在5µL 注射量34中获得所需细菌数量需要稀释。在开始实际感染实验之前, 需要验证600 OD 与细菌悬浮液浓度之间的相关性。为收集此验证数据预留两周时间。 - 使用1毫升注射器, 缓慢拉通过27克针3x 的悬浮。对于每个整除, 请在使用前执行此步骤。
注: 不要使用相同的细菌溶液超过2小时。
3. 腹腔注射marinum感染的实验研究
- 将稀释后的细菌溶液中的5µL 液滴移到一块 parafilm 膜上, 并将液滴拉入30克胰岛素针。
- 用5–8月老野生型鱼和 rag1−/−hu1999 突变鱼作实验。麻醉成年斑马鱼在水箱水中与 0.02% 3-苯甲酸酸乙酯 (pH 7.0)。将鱼腹侧放在湿发泡塑料上的狭缝上。
注:破布/突变鱼不能接受体细胞重组, 并产生功能性 T 和 B 细胞。 - 在骨盆鳍之间用大约45°角注射针头。保持针向上开, 观察整个开口在腹腔内。慢慢注射细菌悬浮液, 小心取出针头。
注: 万一红色示踪剂在注射时漏出鱼, 请将鱼从实验中排除。 - 注射后立即将鱼转移到回收箱中, 用新鲜的水箱水。
- 在使用的细菌整除中, 每隔15分钟就7H10 板上的细菌悬浮液进行取样, 5 天内将细菌孵化29摄氏度, 并通过计数在盘子上的菌落来验证感染剂量。
- 定期检查鱼的安康, 并弄死任何有感染症状的鱼, 超过0.02% 浓度 3-苯甲酸酸乙酯 (pH 7.0)。
注: 约7% 的成年斑马鱼感染 34 "15 CFU 和30% 斑马鱼感染 2029 @ 709 CFU 将有症状8周19。症状可能包括异常游泳, 缺乏对接触的反应, 喘息, 水肿或可观察的浪费。 - 根据共同标准维持斑马鱼35。
4. 内部机构的收集
- 弄死斑马鱼的过量 3-苯甲酸酸乙酯 (超过0.02% 浓度, pH 7.0) 在水箱水中。
- 插入一个针后, 鳃盖射线和另一个通过尾巴, 把鱼钉在平台上。
- 用手术刀打开整个腹腔, 用小勺和尖端镊子收集内脏。从心脏开始, 沿脊柱向尾部工作, 以分离出一个区块内的所有内脏。
注意: 一定要收集所有肾脏组织通过用勺子刮沿脊柱。 - 最后, 用镊子将肠道分离到泄殖腔旁边, 将器官转移到1.5 毫升均匀管中, 六2.8 毫米陶瓷珠。立即放置在干冰冻结样品。样品可以保存在-80 °c, 直到均匀。
- 在个人之间用70% 乙醇冲洗仪器。
5. 从器官块中均匀化和 RNA 提取。
注: 该方法由斯坦福大学36协议修改。
- 添加硫氰酸胍-苯酚溶液用于核酸萃取 (材料表) 在样品的顶端到总容量的1500µL. 确保样品的总容积的最大值为10%。
注意: 所收获组织的预期体积为100µL. 硫氰酸胍-苯酚溶液含有有毒和刺激性的化合物, 需要保护衣物, 丁腈橡胶手套和工作在通风罩。不要与漂白剂结合, 因为这会导致有毒气体的形成。使用前请阅读材料安全数据表 (MSDS)。 - 融汇样品使用3倍于四十年代在 3200 rpm 的珠殴打均质机。冷却在冰三十年代之间的周期。油脂实验在水浴中均匀地取样9分钟。
- 离心样品在 1.2万 x g 10 分钟在4°c 和移动1000µL 被清除的匀浆入一个新鲜离心管。
- 添加200µL 氯仿, 立即混合涡流十五年代和孵化2分钟室温。
注意: 氯仿是一种有毒和刺激性的化合物, 如果吸入, 吞咽或接触皮肤或眼睛。使用必要的安全设备进行个人防护, 并在通风罩中工作。使用前请阅读材料安全数据表 (MSDS)。 - 离心机在 1.2万 x g 15 分钟在4°c 分离水和有机阶段。
- 小心, 转移500µL 的顶部阶段到一个新的管, 以避免污染的 RNA。除去和丢弃水相的其余部分 (~ 100 µL), 并将界面和有机相存储在4摄氏度, 用于 DNA 提取。
注意: 顶部阶段包含 RNA。 - 添加500µL 2 丙醇, 并立即混合涡流十五年代. 室温孵育10分钟以沉淀 RNA。
- 离心机在 1.2万 x g 10 分钟在4°c 颗粒 RNA。用吹打移除上清液。
- 十年代加入1毫升75% 乙醇和涡流。
注意: 该协议可以暂停在这里, 和样品保持隔夜在4摄氏度。 - 离心机在 7500 x g 5 分钟在4摄氏度。用吹打移除上清液。
- 重复洗涤步骤5.9–5.10。吹打小心地取出上清, 让颗粒在通风罩中风干。
- 将 RNA 颗粒溶于500µL 的核酸酶水中, 并将样品保存在冰上。用 microvolume 分光光度计或同等设备测量浓度。将 RNA 储存在-80 摄氏度。
6. 共提取斑马鱼和结核杆菌 DNA 的纯化
- 在30.29 毫升的无核酸酶水中溶解118.2 克硫氰酸胍 (最终浓度4米), 3.68 克柠檬酸钠 (最终浓度50毫米) 和1克 (最终浓度120米) 的密布, 制备后萃取缓冲液 (这可能需要一夜之间搅拌)。添加核酸酶水到最终总容积250毫升和过滤器消毒解决方案。
注: 此缓冲器可储存在室温下长达6月。不要将密布与漂白剂相结合, 因为它们反应产生有毒气体, 如氯化氢和氰化氢。 - 利用样品的界面和有机相提取结核杆菌 DNA。添加 500 ul 的密布每管。在室温下进行反演, 广泛搅拌10分钟。
- 在室温下离心管在 1.2万 x g处30分钟, 并小心地将含有 DNA 的上水相的500µL 转移到新管上。
- 添加 400 ul 2-丙醇。在室温下通过反转和孵育10分钟进行混合。
- 离心样品在 1.2万 x g 15 分钟在4°c。在这一点上, 含有 DNA 的颗粒应该是可见的。小心地清除上清的吹打。
- 添加 800 ul 70% 乙醇。通过反转来清洗颗粒。不要在这个时候涡旋样本, 因为基因组 DNA 容易分解。
- 以 1.2万 x g为15分钟, 在4°c 上离心样品, 用吹打去除上清液。重复乙醇洗涤 (步骤6.6 和 6.7)。
- 小心吹打, 除去乙醇。让样品风干5–10分钟, 在 200 ul 的核酸酶水中溶解颗粒。
- 用 microvolume 分光光度计或同等设备测量 DNA 浓度。DNA 可以储存在摄氏4摄氏度或-20 摄氏度, 用于长期贮存。
7. 定量 PCR 测量结核杆菌负荷
- 准备 qPCR 反应混合与无火箭 (羧基 x 罗丹明) 反对m. marinum内部转录间隔 (它) 在十六年代-二十三年代之间它根据制造商的指示与 MMITS1 底漆 (表 1)。在适合 qPCR 的96井板上, 将反应混合物和样品稀释作为重复的吸管。包括 DNA 标准稀释系列的已知数量的细菌在每一个运行。
注: 每条鱼的预期m marinum负荷可从 0 CFU 到 100万 CFU 4。qPCR 试验也可以与其他 qPCR 套件进行, 但对底漆的退火温度必须重新优化。 - 用光学透明薄膜密封板, 将板材在 2000 x g处以2分钟为4摄氏度离心。
- 运行表 2中显示的 qPCR 程序。
- 使用标准曲线, 计算整个鱼样中细菌的数量。
8. RNA 样品的 DNase 处理
- 为了去除 RNA 中任何可能残留的基因组 DNA 痕迹, 进行 DNase 治疗。在冰上解冻 RNA 样品。
注: 请务必使用 RNase 设备和解决方案, 并在开始工作前, 用净化剂消除 RNases (材料表) 擦拭工作表面和吸管。穿上长袖的实验室大衣和手套来保护你的样品。 - 准备 10 ul DNase 我的反应混合在冰根据制造商的指示。混合 1 ul 的 DNase I, 1 ul 10x DNase 缓冲器和 8 ul 的 rna 样本包括最多1微克的 rna。
- 轻轻地混合反应 (没有涡流) 和孵化30分钟在37摄氏度。
- 在热失活之前, 增加1µL 50 毫米 EDTA 到每10µL 样品。如果不添加 EDTA, 则在加热时 RNA 会发生化学降解。
- 孵育10分钟在65°c 到热停用 DNase i. 继续直接到 cDNA 合成或存储 DNase 处理的 RNA 在-80 °c。
9. cDNA 合成
- 将所有试剂和样品放在冰上, 根据制造商的指示准备反应混合物。对于 5 ul 反应组合, 包括 1 ul 的反向转录主混合, 3 ul 的核酸酶水和 1 ul 的 DNase 处理 RNA。
- 如果需要, 轻轻地混合反向转录反应和简单旋转管。
- 将样品放在 PCR 机中, 并使用表 3所示的程序。
- 如果需要, 稀释核酸酶水中 qPCR 的 cDNA, 以达到2.5 的最大浓度。cDNA 可以储存在-20 摄氏度。
10. 定量 PCR 法测定斑马鱼基因表达
- 根据制造商的指示, 在冰上准备一个 qPCR 的主混合, 并保护光线。使用表 1中介绍的引物。
注: 要计算每种基因的诱导褶皱, 也可以从6只健康的斑马鱼中提取的一个汇总基线样本来测量表达式。 - 准备复制的每个样品和吸管的反应混合到一个 qPCR 板。在开始运行前, 用光学透明薄膜密封板, 并将板材在 2000 x g的2分钟内离心到4摄氏度。
- 运行表 4中显示的 qPCR 程序, 其退火温度取决于所使用的底漆对 (表 1)。
- 用ΔCt 方法分析了基因表达比与一家保持基因 (loopern437) 的关系:
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Representative Results
天然鱼类病原杆菌 marinum感染斑马鱼的内脏, 并产生全身性感染, 组织学可见肉芽肿19。成年斑马鱼通过腹腔注射感染m marinum 。用 dna 作为模板, 提取 dna 和 RNA, 用定量聚合酶链反应 (qPCR) 测定结核杆菌负荷。方法的轮廓如图 1所示。
最初用于感染鱼的分枝杆菌数量是感染结果的决定性决定因素。高感染剂量 m. marinum (~ 2000 CFU) 导致一种渐进性疾病, 其中结核杆菌负荷持续增加, 直到平均细菌负荷达到约500万细菌 (图 2A) 最终杀死鱼。m marinum的低剂量 (~ 20–90 CFU) 导致了类似于人类结核病的疾病频谱的发展 (图 2B)。细菌装载继续增加直到大约第4-7 星期 (图 2A和图 3A), 在之后在多数鱼疾病到达一个稳定状态。图 2B显示了一个小剂量感染疾病结局分布的例子: 约7% 的被感染的斑马鱼无法限制细菌的生长。这些人发展了一种初级进步疾病, 他们在感染后两个月内死亡。大约10% 的人清除了结核杆菌感染4周。剩余的65% 的鱼人口发展了潜在的结核杆菌感染与稳定的细菌负担。然而, 在8至32周的感染, 在 18%, 潜伏感染自发恢复导致疾病的进展。
利用破布/突变鱼, 可以研究自适应免疫应答在成年鱼中的作用。破布/突变鱼不能充分限制分枝杆菌的生长, 导致更高的细菌负荷 (图 3A) 和发病率的增加 (图 3B), 清楚地表明自适应免疫的重要性控制结核杆菌感染。此外, 该模型还可以研究自适应反应在唤起某些细胞因子反应结核杆菌感染中的重要性。在这里, 我们表明, 自适应响应是需要有效诱导白细胞介素 4 (IL4) (图 3C), 但是不可缺少的诱导干扰素γ (IFNγ) 在 4 (图 3D)。干扰素是一种细胞因子, 驱动反应的细胞内病原体, 而白细胞介素4是一个常见的调停人的适应性免疫反应的细胞外病原体。野生型组il4的表达水平明显高于破布/突变鱼, 是指结核杆菌感染中重要的适应体液反应 (图 3C)。
图 1: 研究在成年斑马鱼结核杆菌负荷发展的工作流程.成年斑马鱼感染了腹腔注射 m. marinum。用定量聚合酶链反应 (qPCR), 从鱼体内提取 DNA 和 RNA, 并对marinum负荷和寄主免疫应答进行分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 将m marinum注射到成年斑马鱼中会导致一系列疾病状态.(A) 斑马鱼注射了低 (34 ±15 CFU) 或高剂量 (2029 ±709 CFU) m marinum。平均负荷为5条鱼 (除了32周高剂量, n = 2) 显示与 SD. 低剂量统计: * p < 0.05 与1周相比, ** p < 0.05 与1和2周比较。高剂量统计: ** p < 0.05 相比, 1, 2, 8, 11 和20周. ¤低剂量与高剂量 p < 0.05。从 Parikka等。201219。(B) 在野生型斑马鱼人群中, 疾病结局的典型分布受低剂量m. marinum的感染。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 自适应免疫对成年斑马鱼结核杆菌感染过程的影响.成年野生型 (野生) 和 rag1 (−/−) 斑马鱼感染了低剂量 (n = 30) 的 m. marinum。(A) 平均结核杆菌负荷是由 qPCR 在2、4和7周后感染 () (10) * P < 0.05 测量的。(B) 在疾病症状的发展和生存地块被建立后, 这些鱼被安乐死。(C) il4的表达水平测定为4。(D) IFNγ的表达水平测定为4。(A 和 B) 从 Parikka等201219修改。(C 和 D)从 Hammarén等201438修改。请单击此处查看此图的较大版本.
| 基因 | 底漆序列 | 退火温度 |
| MMITS1 | F: CACCACGAGAAACACTCCAA | 65 |
| marinum量化16S–23SITS 轨迹 AB548718 | R: ACATCCCGAAACCAACAGAG | |
| loopern4 | F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT | 61 |
| 表达重复元素 | R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG | |
| il4 | GCAGGAATGGCTTTGAAGGG | 59。5 |
| ZDB-GENE-100204-1 | GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT | |
| ifnγ1-2 | F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, | 61 |
| ZDB-GENE-040629-1 | R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT |
表 1: 底漆序列和退火温度.所用引物的序列及其优化退火温度。m. marinum十六年代-二十三年代 rRNA 抄本的引物被优化了为一个无火箭 qPCR 套件和其他引物为火箭包括 qPCR 套件。
| 步 | 时间 | 温度 |
| 1 | 3分钟 | 95°c |
| 2 | 5 s | 95°c |
| 3 | 十年代 | 65°c |
| 4 | 5 s | 72°c (荧光检测) |
| 5 | 转到步骤2。39倍 | |
| 6 | 0.5°C 区间的熔融曲线分析55-95°C | |
| 7 | 永远 | 4°c |
表 2: 测量m marinum DNA 的 qPCR 程序.根据制造商的指示设计的 qPCR 协议, 并对斑马鱼样品中的m marinum DNA 进行了优化。
| 时间 | 温度 |
| 5分钟 | 25°c |
| 30分钟 | 42°c |
| 5分钟 | 85°c |
| 永远 | 4°c |
表 3: cDNA 合成方案.根据制造商的指示, 从被感染的斑马鱼的 RNA 中合成 cDNA 的协议。
| 步 | 时间 | 温度 |
| 1 | 三十年代 | 95°c |
| 2 | 十二年代 | 95°c |
| 3 | 三十年代 | 退火°c |
| 4 | 转到步骤2。39次 | |
| 5 | 0.5 °c 间隔65–95°c 的熔融曲线分析 | |
| 6 | 永远 | 4°c |
表 4: qPCR 测量宿主基因表达的程序.根据制造商的指示设计的 qPCR 协议, 并对不同斑马鱼基因的表达进行了优化。
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Discussion
这里我们描述了一个基于 qPCR 的应用来测量从实验感染的成年斑马鱼组织中提取的 DNA 结核杆菌负载。这个应用是基于引物设计围绕十六年代-二十三年代 rRNA 内部转录间隔序列40。用从已知数量的培养的分枝杆菌中提取的 DNA 制备的标准曲线估计鱼类样品中的总结核杆菌负荷, 并假设某一细菌在任何特定时刻都有一份其基因组副本。m. marinum-qPCR 的检测限为约100个菌落形成单元18。与传统电镀相比, 这种方法的明显优点是可以检测到活性和非分裂的休眠细菌。此外, 这种方法规避了在斑马鱼组织培养皿中污染生长的共同问题。然而, 由于 dna 被用作模板, 因此可以从最近死亡的细菌 dna 中提取出一些测量的拷贝。核酸协议的一个重要优点是, 由于 DNA 和 RNA (以及这里没有描述的蛋白质) 都可以从同一个人中提取, 个体的结核杆菌负载可以与基因表达数据结合在一起。宿主和细菌。
marinum m的剂量是感染结果的决定性决定因素。低m marinum (~ 20–90 CFU) 感染剂量产生的疾病状态与潜伏期作为最常见的形式。如果感染剂量是以数以千计的顺序, 一个更进步的疾病发展在大多数的个人。由于天然感染剂量已知低的人结核病41, 使用低剂量m. marinum在斑马鱼模型可能会产生更自然的感染。为了达到正确的剂量, 在开始任何实验之前, 一定要验证 OD600 和集落单元之间的关系。镀层感染剂量的正常变化约为 30%, 不被认为是问题。然而, 重要的是要核实, 整个5µL 量的细菌悬浮在鱼体内仍然存在。注射液的泄漏会引起感染剂量的额外变化。除了感染剂量外, 细菌的应变也会影响疾病的进展。结果表明, 不同marinum株的毒力可以在菌株之间改变。两种最常用的菌株是 ATCC927 (这些实验中使用的鱼类分离菌株) 和 M 菌株。然而, 这些菌株的毒力差异很大。人孤立的 M 菌株发展一个更进步的疾病, 而鱼分离菌株产生一种较温和的疾病, 适合研究结核杆菌感染的潜在形式33。细菌在菌株中的毒力也可能改变, 如果细菌序列地从一种文化转移到另一种, 可以通过从冷藏库中取出新鲜的分枝杆菌来防止。
在体外培养中缓慢分裂的m. marinum无抗生素易受污染。因此, 细菌的处理需要严格的无菌方法在层流罩进行。可能的污染在文化可以被发现作为太高 OD600价值, 奇怪的细菌悬浮物或殖民地。m. marinum殖民地通常是模糊边缘, 平和哑光白色在颜色。m. marinum文化对光敏感, 当暴露于光中时, 它们开始产生黄色颜料。这种黄色色素可用于区分m marinum菌落与其他细菌感染后。污染物会导致鱼在感染后很快死亡。通常, 低剂量感染的第一症状不出现在3周后感染和任何死亡率之前, 这一时间点可能是由于污染的细菌悬浮或外伤引起的注射。
成年斑马鱼对 3-苯甲酸酸乙酯非常敏感, 如果暴露时间过长或麻醉药浓度过高, 则不能存活。因此, 在感染时, 斑马鱼只应暴露在麻醉剂的最低时间, 以达到良好的麻醉 (~)。感染后, 成年斑马鱼被保存在26–28°c 的水温组。如果温度高于或低于此, 它可能会影响m. marinum的生长速率和动力学的感染。此外, 水箱水质 (微生物质量、盐浓度、pH 值、氧饱和度) 是保证实验成功的重要环节。需要每天对鱼类进行健康监测, 并将感染症状的鱼从小组中移除并实施安乐死。如果鱼死在坦克, 其他鱼可能会再次感染通过肠道, 这将影响到感染的进展。
常用的斑马鱼幼虫模型可用于研究先天免疫, 将实验引向有限的寄主-微生物相互作用的子集。使用成年斑马鱼可以研究先天和自适应免疫反应在一个多才多艺的模型18,32,39。成年斑马鱼作为一种方便的脊椎动物模型来研究整个结核病谱。由于m. marinum的低剂量暴露, 7% 的鱼类人口发展为初级进展性疾病, 10% 能够消毒感染, 65% 发展潜伏性疾病和18% 自发重新激活发生 (图 2)。疾病谱与人类结核病相似, 其中绝大多数发育潜伏性疾病, 大约4–14% 在感染42后的头五年内产生初级主动感染, 10–20% 严重暴露的人似乎能消毒传染43并且潜在的传染的5–10% 重新激活44。寄主遗传学上的差异影响到结核病的易感性和疾病进展45。这也见于斑马鱼的人口, 这是基因非常异构不同于许多其他实验室动物46,47。自然遗传变异使它成为一种高度适用的模型, 在寻找最佳免疫反应的多因素疾病。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到芬兰文化基金会、坦佩雷结核病基金会 (M.V.、M.M.H.、宪兵)、芬兰抗结核协会 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen säätiö) 基金会的支持。M.M.H.、宪兵)、西格丽德 jusélius 基金会 (mp)、埃米尔 Aaltonen 基金会 (M.M.H.)、简和 Aatos Erkko 基金会 (mp) 和芬兰科学院 (mp)。琳娜 mäkinen, 汉娜-琳娜卡里和珍娜 ilomäki 被承认为他们的技术援助。作者承认坦佩雷斑马鱼实验室为他们的服务。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 mL homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
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