Summary
その自然の病原体菌 marinumを使用して大人のゼブラフィッシュ モデルひと結核にプロトコルを紹介します。抽出された DNA と感染したゼブラフィッシュの内臓からの RNA は、抗酸菌の合計負荷魚と qPCR で宿主の免疫反応を明らかにする使用できます。
Abstract
結核は現在毎年 170 万の死と 1040 万感染症を引き起こして最悪人間の病原体であります。この細菌への露出は、滅菌感染から積極的に進んで致命的な病気に至るまで人間の広い疾患のスペクトルを発生します。最も一般的な形式は、無症候性ですが、劇症疾患に再アクティブ化する可能性がある潜在的な結核です。アダルト ゼブラフィッシュとその自然の病原体菌 marinum結核の幅広い疾患のスペクトルを研究に該当するモデルであると証明した最近。重要なは、自発的な待機時間再活性化と抗酸菌感染症の適応の免疫反応はこのモデルで学ぶことができます。この記事で大人ゼブラフィッシュ、内臓抗酸菌荷重および量的な PCR によるホストの免疫反応の測定のための核酸の抽出のためのコレクションの実験的感染症法について述べる。社内の開発、 M. marinum -特定の qPCR の試金は非分裂、休止状態または最近死んだ抗酸菌から DNA が検出されるも、伝統的なめっきより敏感。DNA と RNA の両方は同じ個体から抽出した、病気の状態とホストと病原体の遺伝子発現との関係を研究することが可能です。結核成人ゼブラフィッシュ モデルはこうしてホスト病原体の相互作用を研究する、応用性・非哺乳類体内システムとしてそれ自身を示します。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布) は生物医学研究で広く使用されている動物モデル、一般的な脊椎動物の生物学のための受け入れられたモデルです。ゼブラフィッシュひと疾患モデル研究の多くの分野で採用され、感染症や免疫学的いくつか細菌3のウイルス感染4癌1から心疾患2までの障害,5します。 さらに、ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex開発したゼブラフィッシュ人気モデル発生生物学6および毒物学7,8。
感染生物学分野を含む研究の多くの分野で光学的に透明なゼブラフィッシュ幼虫はよく使用されます。最初の免疫細胞は、原始マクロファージが検出された9と 24 h ポスト受精 (hpf) 内で表示されます。好中球は、約 33 hpf10を表示する次の免疫細胞です。ゼブラフィッシュ幼虫は感染症の初期段階と適応免疫細胞11の不在で自然免疫の役割を研究するため可能。ただし、アダルト ゼブラフィッシュ機能的適応免疫システムは感染実験のため複雑さの追加レイヤーを提供します。T 細胞は、3 日後に受精12、および B 細胞の機能性抗体を生成することが 4 週間ポスト受精13周り検出できます。大人のゼブラフィッシュは哺乳類の自然免疫と適応免疫のすべての主要なカウンター パートです。魚の immune systems と人間の主な違いは、リンパ組織の解剖学のように同様の抗体アイソタイプで発見されます。ゼブラフィッシュの人間が 5153 つしか抗体クラス14があります。骨髄とリンパ節のない場合は、魚の第一次リンパ器官は脾臓と胸腺16腎臓、腎臓と腸の二次リンパ器官17としています。自然免疫と適応セルその完全免疫の武器とのこれらの相違にもかかわらず大人のゼブラフィッシュは宿主-病原体相互作用の研究のための非常に適用可能な簡単に使用できる、非哺乳類モデルです。
ゼブラフィッシュは、結核18,19,20,21,22を勉強する実行可能なモデルとして確立されている最近。結核は、結核菌によって引き起こされる空気中の病気です。世界保健機関によると、結核は 2016 年に1.7の百万の死を引き起こしたし、単一の病原体世界23死の主要な原因は。マウス24,25、ウサギ26ヒト以外の霊長類27が最も有名な動物モデル各面しますが、結核研究の制限。人間の病気が最も酷似の結核感染症非ひと霊長類モデルがこのモデルを使用して、重大な倫理的配慮のため限定。他の動物モデルは、結核病の病理に影響を与えるの宿主特異性によって妨げられます。おそらく結核をモデリングで最大の問題は人間の病気で感染や病気の結果の広いスペクトル: 結核は潜在的なアクティブ、再アクティブ化された感染症28 への耐性を滅菌に至る非常に異質病気、ハードを再現し、模型実験できます。
結核菌 marinumは、85% のアミノ酸のアイデンティティの29〜 3,000 相同タンパク質と結核の近親です。M. marinumは、ゼブラフィッシュ肉芽腫、その内臓19、30での結核の特徴を作り出す自然感染します。結核の研究で使用される他の動物モデルとは異なりゼブラフィッシュは多くの子孫を作り出す、限られたスペースのみ必要で、重要なは、後発の脊椎結核モデルでは neurophysiologically。M. marinum感染はひと結核19,の病気の結果のスペクトルを密接に模倣した大人のゼブラフィッシュの潜伏感染、アクティブな病や抗酸菌症のも殺菌を引き起こすまた、31,32しますここでは、 M. marinumを腹腔内に注入し、抗酸菌の負荷とゼブラフィッシュから免疫を測定する定量的 PCR を使用して大人のゼブラフィッシュの実験的結核症モデル法について述べる。組織サンプル。
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Protocol
すべてのゼブラフィッシュ実験は、動物実験委員会フィンランド (ESAVI/8245/04.10.07/2015) によって承認されています。メソッドは、行為 (497/2013) とフィンランドの科学又は教育のために使用される動物の保護に関する政府令 (564/2013) に従って実行されます。
1. 培養菌 marinumの
注: 結核菌 marinum は、人間の表面的な感染症を引き起こす可能性のある病原体は、のこの菌に作業を開始する前にバイオハザード廃棄物処分の安全と地域のガイドラインをご覧ください。
- 文化 7 h 10 M. marinumプレートを添加した 10 %oadc (オレイン酸、アルブミン、デキスト ロース、カタラーゼ) 濃縮及び 0.5 %v/v 29 ° C でグリセリンの少なくとも 5 日間。2 週間ごとに冷凍庫から新鮮な細菌を取り、1 週間おきに新しいプレートに転送によってM. marinum文化を維持します。
注: M. marinumは水生生物に感染する天然魚の病原体や細菌とゼブラフィッシュ株式を汚染しないための予防策を講じることが重要です。感染したゼブラフィッシュと細菌で汚染された項目が繁殖施設から分離することにあります。 - 滅菌 1 μ L 接種ループを使用して無菌 7 H 9 の 10 mL を含む細胞培養用フラスコにM. marinum細菌大量の loopful を転送中 10 %adc (アルブミン、デキスト ロース、カタラーゼ) 濃縮、0.2 %v/ポリソルベート 80 と 0.2 %v/v のグリセロール。およそ、OD に600 (光密度) を振ることがなく暗闇の中で 29 の ° C で 0.7 の 3-4 日間の文化。キャップを野放しかフィルター キャップを使用して十分なガス交換を可能にします。
注: ポリソルベート 80 は、細菌の凝集を予防する媒体に追加されます。さらに、光への暴露は、細菌のコロニー (例えば、白から黄色への色の変更) の表現型の変化に します。これを回避するには、暗闇の中、文化を保持します。 - 分光光度計と OD600の値を測定します。0.07-0.09 の OD600液体培養を希釈し、振ることがなく暗闇の中で 29 の ° C で 2 日間培養を続けます。ルーズ キャップを残します。
注: これらの 2 日間細菌懸濁液が約 0.5 初期ログ相に対応する外径600に到達しますで。
2. アダルト ゼブラフィッシュを感染させる細菌溶液の調製
- 大きな滅菌キュベットまたは 15 mL チューブに細菌懸濁液を転送し、解決する最大の塊を許可するように 15 分間室温で暗闇の中でそれを配置します。
- クリーン チューブまたはキュベットに懸濁液のトップ 5-7 mL を転送し、OD600を測定します。感染症の懸濁液のこの上のフェーズを使用します。
- 新鮮なチューブと 10,000 x gで 3 分間遠心にM. marinum文化の 1 mL を収集します。上澄みを除去し、1 mL の滅菌 1x PBS でペレットを再懸濁します。
- 希釈滅菌 1 を使用して、目的の細菌濃度に到達するトレーサーとして 0.3 mg/mL フェノールレッドの PBS x。3 つの因数に希釈懸濁液を分割します。
注: 使用して CFU (コロニー形成単位) 対所定の外径600 /μ L 希釈を推定する曲線が 5 μ L 注入ボリューム34内細菌の募集数を取得する必要です。外径600と細菌懸濁液の濃度との相関は、実際の感染実験を開始する前に検証する必要があります。この検証データを収集するため 2 週間をぜひご予約ください。 - 1 mL の注射器を使用して、ゆっくりとプル濁液 27 G の針 3 倍です。各因数のちょうど使用する前にこの手順を実行します。
注: は、2 時間以上同じ細菌のソリューションを使用しないでください。
3 実験的腹腔内注入・ m ・ marinum感染症
- パラフィルム フィルムの部分に希釈した細菌溶液 5 μ L 液滴のピペット、30 G インスリン針に液滴を引き出します。
- 5-8 月に使用-古い野生型魚と実験用 rag1−/−hu1999 突然変異体の魚。0.02 %3-アミノ安息香酸エチル (pH 7.0) を水槽の水で大人のゼブラフィッシュを麻酔します。湿った発泡プラスチックのスリットを魚の腹側を配置します。
注:ぼろ-/-突然変異体の魚はない体性組み変えを経るし、T および B 細胞を生成することができます。 - 骨盤のフィン間針を注入、約 45 ° の角度。腹腔内全体の開口部である観察する上向き針開口部を維持します。細菌懸濁液をゆっくりと注入し、慎重に針を削除します。
注: 赤いトレースが射出時に魚から漏れている場合に、実験から魚を除外します。 - 注入後すぐに新鮮な水槽の水に回収タンクに魚を転送します。
- 7 h 10 細菌懸濁液のかかるサンプル プレート使用で分注の細菌から 15 分毎 5 日間インキュベート 29 ° C で細菌と版のコロニーを数えることによって伝染の線量を確認します。
- 魚の幸福を定期的にチェックし、0.02% 以上の感染症の症状を持つ任意の魚を安楽死させる 3-アミノ安息香酸エチル (pH 7.0) の濃度。
注: 約、大人のゼブラフィッシュの 7% に感染 34 ± 15 CFU ゼブラフィッシュの 30% 感染 2029年 ± 709 CFU と 8 週間19によって症状が持ってされます。症状は、異常な水泳、タッチ、あえぎ、浮腫または観察可能な無駄への応答の欠如を含めることができます。 - 一般的な基準35によるとゼブラフィッシュを維持します。
4. 臓器のコレクション
- 水槽の水の 3-アミノ安息香酸エチル エステル (以上 0.02% の濃度、pH 7.0) の過剰摂取にゼブラフィッシュを安楽死させます。
- Branchiostegal 光線と別のプラットフォームに魚をタックに尻尾の後方の 1 つのピンを挿入します。
- メスと腹腔全体を開き、小さいスプーンとシャープ エンド ピンセットを使用して内部の臓器を収集します。心の底から始まり、1 つのブロックのすべての臓器をデタッチする尾に向かって背骨に沿って動きます。
注: は必ずスプーンで背骨に沿って削ってすべての腎臓組織を収集してください。 - 最後に、ピンセットを使用して、排泄腔の横に腸をデタッチし、1.5 mL 均質化管 6 2.8 mm セラミック ビーズに臓器を移します。すぐにサンプルを固定するのにはドライアイスに配置します。サンプルは、均質になるまで-80 ° C で保存できます。
- 個人間の 70% エタノールで楽器をすすいでください。
5. オルガン ブロックから均質化と RNA を抽出。
メモ: メソッドは、スタンフォード大学のプロトコル36から変更されます。
- サンプルの上に核酸の抽出 (材料表) の使用グアニジン チオシアン酸フェノール ソリューションを 1,500 μ L の総ボリュームに追加サンプルが最大総量の 10% をカバーすることを確認します。
注意: 予想される収穫された組織量はグアニジン チオシアン酸, フェノール溶液 100 μ L. を含む毒性と刺激性化合物、防護服、ニトリル手袋、ヒューム フードでの作業が必要です。これは有毒ガスの形成を引き起こすが、漂白剤と組み合わせない。使用前に製品安全データシート (MSDS) を読みます。 - 40 の 3 回ビーズ ホモジナイザーを用いた試料をホモジナイズしてください 3,200 rpm で s。30 の氷のクールなサイクル間の秒。9 分間水浴の均質化試料の超音波照射します。
- 4 ° C で 10 分間、12,000 × gでサンプルを遠心し、新鮮な遠心管にクリアされた乳剤の 1,000 μ L を移動します。
- 200 μ L のクロロホルムを追加、15 のボルテックスによってすぐにミックス s 室温で 2 分間インキュベートし、。
注意: クロロホルムは有毒、刺激化合物吸入した場合、飲み込んだや皮膚や目に接触します。個人的な保護のために必要な安全装置を使用、発煙のフードで働きます。使用前に製品安全データシート (MSDS) を読みます。 - 水溶液と有機相を分離する 4 ° C で 15 分間 12,000 × gで遠心分離機します。
- 慎重に、RNA が汚れないように新鮮なチューブに上のフェーズの 500 μ L を転送します。削除し水相 (~ 100 μ L) の残りの部分を破棄し、中間期および DNA の抽出のための 4 ° C で有機相を格納します。
注: 上のフェーズには、RNA が含まれています。 - 2-プロパノールを 500 μ l 添加し、RNA を沈殿させ、室温で 10 分間 15 s. 加温のボルテックスによってすぐにミックスします。
- RNA のペレットへの 4 ° C で 10 分間の 12,000 × gで遠心分離機します。ピペットで上澄みを削除します。
- エタノール 75% と 10 の渦の 1 つの mL を追加 s。
注: プロトコルがここでは、一時停止にも、サンプルは 4 ° C で一晩保管 - 7,500 × gで 4 ° C で 5 分間遠心します。ピペットで上澄みを削除します。
- 5.9-5.10 洗浄手順を繰り返します。ピペットで上澄みを慎重に削除し、ヒューム フードの空気乾燥させるペレットです。
- ヌクレアーゼ フリー水の 500 μ L の RNA のペレットを溶かし、氷のサンプルを保ちます。微量分光光度計または同等の設備では、濃度を測定します。-80 ° C で RNA を保存します。
6. 共同抽出されたゼブラフィッシュと抗酸菌 DNA の精製
- チオシアン酸グアニジン (最終濃度 4 M) の 118.2 g クエン酸ナトリウムの 3.68 g を溶解することにより逆抽出バッファー (BEB) を準備 (最終濃度 50 mM) と 120 mL のヌクレアーゼ フリー水 (5 月にトリス遊離塩基 (最終濃度 1 M) の 30.29 g必要と一晩攪拌)。ヌクレアーゼ フリー水を 250 mL とソリューションを殺菌するフィルターの最終的な容量に追加します。
注: このバッファーは、最大 6 ヶ月間室温で格納することができます。塩化水素やシアン化水素などの有毒ガスが発生する反応するので、漂白剤と BEB を組み合わせないでください。 - 抗酸菌 DNA を抽出するため、中間期およびサンプルの有機相を使用します。各チューブに BEB の 500 μ L を追加します。部屋の温度の逆転によって広範囲で 10 分間混ぜます。
- 室温で 30 分間 12,000 × gでチューブを遠心し、慎重に新しい管へ DNA を含む上部の水相の 500 μ L を転送します。
- 2-プロパノールの 400 μ L を追加します。ミックスを反転し、室温で 10 分間インキュベートします。
- 遠心分離機の 4 ° C で 15 分間、12,000 × gでサンプルDNA を含むペレットがこの時点で表示されます。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。
- 70% のエタノールの 800 μ L を追加します。逆解析によるペレットを洗浄します。ボルテックスにかけないでくださいサンプルこの時点でゲノム DNA が壊れるようです。
- 4 ° C で 15 分間、12,000 × gでサンプルを遠心分離、ピペットで上澄みを除去します。エタノール洗浄 (手順 6.6 と 6.7) を繰り返します。
- 丁寧にピペッティングしてエタノールを削除します。サンプルは、5-10 分はヌクレアーゼ フリー水の 200 μ L でペレットを溶解用空気乾燥させてください。
- 微量分光光度計または同等の設備では、DNA 濃度を測定します。DNA は、4 ° c または長期保管のための-20 ° C で保存できます。
7 抗酸菌の負荷を測定するため量的な PCR
- いいえ-ロックス (カルボキシ-X-ローダミン) に対する 16S 23S MMITS1 プライマー (表 1) の製造元の指示に従ってその間M. marinum内部転写スペーサー (ITS) と qPCR 反応混合物を準備します。反応混合物をピペットし、qPCR に適した 96 ウェル プレートに重複として希釈液をサンプルします。各走行の細菌の量は、既知の DNA 標準希釈系列が含まれます。
注: 予想される 4 wpi で 1,000,000 CFU 0 CFU から魚ごとM. marinum負荷の範囲します。QPCR 法は他の qPCR のキットでも実行できるが、プライマーのアニーリングの温度が再最適化されました。 - 光学的に透明なフィルムとプレートを封印し、4 ° C で 2 分間 2,000 x gでプレートを遠心分離
- 表 2に示す qPCR プログラムを実行します。
- 標準曲線を使用して、全体の魚のサンプル中の細菌の数を計算します。
8 RNA サンプルの DNase 処理
- RNA からゲノム DNA のすべての可能な残りのトレースを削除するには、遂行 DNase 私治療。氷の上の RNA のサンプルを解凍します。
注: を必ず RNase フリーの機器とソリューションのみを使用し、作業を開始する前に RNases (資材表) を除去する除染試薬で作業面とピペットを拭いてください。長袖の白衣とあなたのサンプルを保護するために手袋を着用します。 - 10 μ L を準備 DNase 私反応ミックス製造元の指示に従って氷の上。私、DNase バッファー x 10 の 1 μ L、8 μ L の RNA サンプル RNA の 1 μ g の最大を含む DNase のミックス 1 μ L。
- 優しく反応 (ボルテックスなし) を混合し、37 ° C で 30 分間インキュベート
- 熱不活性化前に 50 ミリメートルの EDTA の 1 μ L を各 10 μ L のサンプルに追加します。EDTA は追加されません、RNA は加熱すると化学的な劣化を受けることになります。
- 熱-不活化する DNase I. 継続 cDNA 合成に直接-80 ° C で DNase 処理 RNA を保存 65 ° C で 10 分間インキュベートします。
9. cDNA 合成
- 試薬および氷のサンプルをすべて保持し、製造元の指示に従って反応混合物を準備します。ほか逆転写マスター ミックスの 1 μ L、5 μ L 反応混合物のヌクレアーゼ フリー水の 3 μ、1 μ L の DNase 処理 RNA。
- 軽く逆転写反応を混合し、必要な場合、チューブを簡単にスピンします。
- PCR マシンでサンプルを置き、表 3に示すプログラムを使用します。
- 必要な場合は、最大濃度 2.5 ng/μ L、qPCR のヌクレアーゼ フリー水の cDNA を薄くしなさい。cDNA は-20 ° C で保存することができます。
10. 量的な PCR によるゼブラフィッシュ遺伝子発現を測定
- 製造元の指示に従って氷の qPCR マスター ミックスを調製し、光から保護します。表 1で紹介したプライマーを使用します。
注: 各遺伝子の誘導の倍を計算するには、6 健康ゼブラフィッシュから抽出されるプールされたベースライン サンプルからも式を測定します。 - 各サンプルの複製を準備し、qPCR プレート上に反応混合物をピペットします。光学的に透明なフィルムとプレートを密封し、実行を開始する前に 4 ° C で 2 分間 2,000 x gでプレートを遠心分離機します。
- QPCR を実行に応じてプライマーのアニーリングの温度を表 4に示すプログラムは、(表 1) を使用します。
- 家は維持遺伝子 (loopern437) と比較して遺伝子発現比の方程式を用いた ΔCt 法による分析します。
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Representative Results
天然魚の病原体菌 marinumゼブラフィッシュの臓器に感染し、組織学的肉芽腫19全身性感染症を生成します。大人のゼブラフィッシュは、腹腔内注入によるm. marinumに感染しています。DNA や RNA を抽出、およびテンプレートとして DNA を使用して量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) による抗酸菌の負荷を測定します。法の概要を図 1に示します。
抗酸菌感染魚の使用の最初の数は、感染症の結果の重要な決定要因です。M. marinum (~ 2,000 CFU) の高い伝染の線量は、抗酸菌の負荷は、細菌負荷を平均約 500 万細菌 (図 2 a) 最終的に魚を殺すに到達するまでを増やし続ける進歩的な病気につながります。低用量 (~ 20-90 CFU) M. marinumリード (図 2 b) 人間の結核に見られるとよく似た病気スペクトルの開発するの。細菌負荷は約 4-7 週間 (図 2 aおよび図 3 a)、魚の大半でその後病気は定常状態に達するまで増加し続けます。図 2 bの低用量感染症疾患の転帰の分布の例を示しています: 感染したゼブラフィッシュの約 7% が細菌の増殖を制限することができませんでした。これらの個人は主な進行性の病気を開発し、感染後 2 ヶ月以内に死亡しました。約個人の 10% は 4 週間で抗酸菌の感染をクリアしました。魚の人口の残りの 65% は、細菌負荷の安定した潜在的な抗酸菌感染症を開発しました。ただし、18% で、感染症の 8 ~ 32 週の間潜伏感染は自発的に病気の進行につながるを再開しました。
使用してぼろ-/-突然変異体の魚、それは大人の魚に適応免疫応答の役割を研究することが可能。ぼろ-/-突然変異体の魚がより高い細菌負荷 (図 3 a) につながる抗酸菌の成長を十分に制限できないと増加罹患率 (図 3 b)、適応免疫の重要性を明確に示す抗酸菌感染症を制御します。また、このモデルの抗酸菌感染症の特定のサイトカイン応答を思い起こさでの適応応答の重要性を学ぶことができます。ここで、適応応答がインターロイキン 4 (IL4) の効率的な誘導に必要なことを示す (図 3)、インターフェロン-γ (肝腎) 4 wpi (3 D 図) での誘導のため不可欠であります。インターフェロン-γ、インターロイキン 4 が外の病原体に対する適応免疫応答の一般的な仲介者に対し細胞内病原体に対して応答を運転サイトカインです。Il4に比べて野生型群の有意に高い発現レベルぼろ-/-変異体の魚は、抗酸菌症 (図 3) 重要な体液性応答を指します。
図 1: 大人のゼブラフィッシュの抗酸菌負荷研究開発のワークフロー 。大人のゼブラフィッシュは、 M. marinumの腹腔内注射で感染しています。魚の内臓から DNA および RNA を抽出し、, M. marinum負荷とホストの免疫反応の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を分析し、.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: アダルト ゼブラフィッシュにM. marinumの注入により、病気の状態のスペクトル。(A) ゼブラフィッシュは低 (34 ± 15 CFU) またはM. marinumの高用量 (2029年 ±709 CFU) を注入しました。5 魚の負荷を平均 (32 週間高用量、n を除く = 2) の SD 低用量の統計情報が表示されます: * p < 1 週間に比べ 0.05 * * p < 1 に比べ 0.05 と 2 週間。高用量の統計情報: * * * p < 0.05 に比べ 1、2、8、11、20 wk. ¤ p 高用量対低用量 < 0.05。Parikkaらから変更201219。(B) 予後M. marinumの低用量に感染した野生型ゼブラフィッシュ集団内での典型的な分布。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 適応免疫に影響を与える大人のゼブラフィッシュの抗酸菌感染症のコース。大人の野生型 (wt) と rag1 (−) は低用量で感染した (n = 30) M. marinumの。(A) 抗酸菌の平均負荷を 2、4、および 7 週間ポスト感染 (wpi)、qPCR 測定した (n = 10) * P < 0.05。(B) 病気の症状の開発時に魚を安楽死させ、生存率プロットが作成されました。(C). 4 wpi でil4の発現量を測定しました。4 wpi で肝腎の式 (D) レベルを測定しました。(A と B) は Parikkaらから 2012年19に変更します。(C と D)Hammarénら201438から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 遺伝子 | プライマー シーケンス | アニーリング温度 |
| MMITS1 | F: CACCACGAGAAACACTCCAA | 65 |
| M. marinum定量化のための 16-23SITS 座 AB548718 | R: ACATCCCGAAACCAACAGAG | |
| loopern4 | F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT | 61 |
| 反復的な要素を表現 | R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG | |
| il4 | GCAGGAATGGCTTTGAAGGG | 59.5 |
| ZDB-遺伝子-100204-1 | GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT | |
| ifnγ1 2 | F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC | 61 |
| ZDB-遺伝子-040629-1 | R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT |
表 1: プライマー シーケンスおよびアニーリングの温度します。使用されるプライマーのシーケンスおよびその最適化されたアニーリングの温度。M. marinum 16S 23S rRNA 転写のためのプライマーは、qPCR キットを含む ROX のない ROX qPCR キットとその他のプライマーに最適化されています。
| ステップ | 時間 | 温度 |
| 1 | 3 分 | 95 ° C |
| 2 | 5 s | 95 ° C |
| 3 | 10 s | 65 ° C |
| 4 | 5 s | 72 ° C (蛍光検出) |
| 5 | 手順 2 に進みます。39 回 | |
| 6 | 融解曲線解析 55-95 ° C 0.5 の ° C 区間と | |
| 7 | 絶えず | 4 ° C |
M. marinum DNA を測定するため表 2: qPCR プログラム。QPCR プロトコルは、製造元の指示に従って設計、ゼブラフィッシュのサンプルからM. marinum DNA を測定するため最適化します。
| 時間 | 温度 |
| 5 分 | 25 ° C |
| 30 分 | 42 ° C |
| 5 分 | 85 ° C |
| 絶えず | 4 ° C |
テーブル 3: cDNA 合成プログラム。製造元の指示に従って感染したゼブラフィッシュの抽出した RNA からの cDNA を合成するためのプロトコル。
| ステップ | 時間 | 温度 |
| 1 | 30 s | 95 ° C |
| 2 | 12 s | 95 ° C |
| 3 | 30 s | ° C の熱処理 |
| 4 | 手順 2 に進みます。39 回 | |
| 5 | 融解曲線解析 65 ~ 95 ° C 0.5 の ° C 区間と | |
| 6 | 絶えず | 4 ° C |
表 4: ホストの遺伝子発現を測定する qPCR プログラム。QPCR プロトコルは、製造元の指示に従って設計、異なるゼブラフィッシュ遺伝子の発現を測定するため最適化します。
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Discussion
ここで実験感染成人ゼブラフィッシュ組織から抽出した DNA から抗酸菌の負荷を測定する qPCR ベースのアプリケーションについて述べる。このアプリケーションは、プライマー 16S 23S rRNA スペーサー シーケンス40を中心に設計に基づいています。魚サンプルの全抗酸菌荷重は、培養抗酸菌の知られている数から抽出され、その 1 つの細菌が任意の時点でそのゲノムの 1 つのコピーを持っていれば DNA から作製した標準曲線を使用して推定されます。M. marinum -qPCR の検出限界は約 100 コロニー形成単位18。伝統的なめっきと比較して方法の明確な利点は、両方のアクティブおよび非分裂の休止状態の細菌を検出できることです。さらに、このアプローチによるゼブラフィッシュ組織から培養皿上の汚染成長の共通の問題が回避されます。ただし、DNA をテンプレートとして使用すると、測定したコピーのいくつかが非常に最近死亡した細菌の DNA 由来することができることが可能です。核酸ベースのプロトコルの重要な利点は、両方 DNA と RNA (と同様ここに記述されていない蛋白質) は、同じ個体から抽出することができますは、両方の遺伝子発現データと個人の抗酸菌の負荷を組み合わせることができますが、ホストと細菌。
M. marinumの投与は、感染症の結果の重要な決定要因です。低M. marinum (~ 20-90 CFU) 伝染の線量として最も一般的なフォームの待機時間で病気の状態のスペクトルを生成します。伝染の線量は、何千もの順序より進歩的な病気が個人の大半で開発しています。自然感染用量は、ひと結核41低いことが知られている、ゼブラフィッシュ モデルのm. marinumの低用量を使用してより自然な感染を引き起こす可能性があります。適切な投与量に達するに、OD600 と実験を開始する前にコロニー形成単位との関係を検証することを確認します。メッキ感染用量の正常変異は、約 30% であり問題とは見なされません。ただし、細菌懸濁液 5 μ L の全体量が魚の中に残っていることを確認することが重要です。注射液の漏れは伝染の線量で余分な変化を引き起こします。伝染の線量だけでなく病気の進行に影響を与える、細菌の緊張。それはずっと病原性を示す菌株間異なるM. marinumの系統を変更できます。2 つの最も一般的に使用される系統は ATCC927 (魚のこれらの実験で使用される分離株) と M ひずみ。しかし、これらの系統は、病原性では大きく異なります。魚分離ひずみ抗酸菌症33の潜在的なフォームの勉強にも適した穏やかな病気を生成するのに対し、M の人間分離株はより進歩的な病気を開発しています。細菌は順次伝達 1 つの文化から別の冷凍庫から新鮮な抗酸菌を取ることによって防ぐことができる場合、ひずみ内で細菌の病原性があります変更もしばしば十分な在庫です。
体外培養抗生物質M. marinumゆっくりと分割は汚染しやすいです。したがって、細菌のハンドリングには、厳格な無菌アプローチ層流フードの実施が必要です。高すぎる外径600値として文化の可能な汚染を検出できる奇妙な細菌懸濁液または植民地。M. marinumのコロニーは、通常ファジィ エッジ、フラット、マット ホワイト色でです。M. marinum文化は光に敏感であり、彼ら光にさらされると黄色の色素の生産を開始します。この黄色の色素は、感染後他の細菌からM. marinum植民地を区別するために使用できます。汚染物質は、感染直後後に死ぬ魚を可能性があります。通常、3 週間ポスト感染、この時点でポイントの前にすべての死亡可能性がある汚染による細菌懸濁液または射出時のトラウマで前に低用量の感染症の最初の症状は表示されません。
アダルト ゼブラフィッシュは 3-アミノ安息香酸エチルに非常に敏感、露光時間が長すぎるか、麻酔薬の濃度が高すぎる場合は生きていけない。したがって、感染しているとき、ゼブラフィッシュにさらされるべき良い麻酔を得るために時間の最小値だけの麻酔 (〜 1-2 分)。感染後 26-28 ° C の水温で、大人のゼブラフィッシュを続けたグループで温度はこれより高いまたは低い、 M. marinum成長率と感染症の動態を影響する可能性があります。また、タンクの水質 (微生物学的品質、塩濃度、pH、酸素飽和度) は、実験が成功を確保する重要な部分です。魚のモニタリング実施される毎日、魚をグループから削除して安楽死させた必要があります感染症の症状を示す必要があります。水槽の魚は死んでしまう、他の魚が感染の進行に影響を与えるが、腸を通じて再感染した可能性があります。
結核の一般的に使用されるゼブラフィッシュ仔モデル限定ホスト微生物間相互作用の実験を指示する研究免疫に適用されます。大人のゼブラフィッシュの使用では、汎用性の高いモデル18,32,39自然免疫と適応免疫応答を検討可能です。大人のゼブラフィッシュは、結核の全体のスペクトルを研究する便利な脊椎動物モデルとしてそれ自身を示します。M. marinumの低線量の露出、魚の人口の 7% を開発主な進行性疾患、10% が感染を殺菌することが、65% 潜在的な疾患を発症して 18% 自発的な再活性化が発生します (図 2)。病気のスペクトルが酷似大半が約 4-14%、潜在的な病気を開発、人間の結核に見られる重く感染4210-20% の後の最初の 5 年の内でプライマリ アクティブな感染を引き起こす44に潜在的な感染症の 5-10% の再アクティブ化して露出された人は感染症43を滅菌することができるようです。ホストの遺伝の違い結核と病気進行45への感受性に影響を与えます。これはまた多く他研究所動物46,47とは異なり非常に遺伝的に異質であるゼブラフィッシュ人口で見られます。自然な遺伝的変異この多因子疾患に最適な免疫応答の検索の高い機種になります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作業によって、フィンランド文化財団 (H.L.)、タンペレ結核財団 (H.L.、l.-m. v.、M.M.H.、m. p.)、フィンランドの結核協会 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L. の基礎をサポートされていますM.M.H.、m. p.)、ねんどろいど Jusélius 財団 (m. p.)、エミール ・ アールト財団 (M.M.H.)、ジェーンと Aatos Erkko 財団 (融点) とフィンランド アカデミー (融点)。その技術支援のレーナ Mäkinen、ハンナ レーナ ・ ピッポ、ジェナ ・ Ilomäki を認めた著者は、彼らのサービスのタンペレ ゼブラフィッシュ研究室を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 mL homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
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