Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modellering tuberkulose Mycobacterium marinum infisert voksen sebrafisk

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Summary

Her presenterer vi en protokoll til modell menneskelige tuberkulose i en voksen sebrafisk bruker sin naturlige patogen Mycobacterium marinum. Utdraget DNA og RNA fra de innvendige organene av infiserte sebrafisk kan brukes å avsløre hele mycobacterial laster inne fisken og vertens immunreaksjoner med qPCR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis er den dødeligste human patogen forårsaker 1,7 millioner dødsfall og 10.4 millioner infeksjoner hvert år. Eksponering for denne bakterie fører et bredt sykdom spektrum hos mennesker, fra en sterilisert infeksjon til et aktivt tiltagende dødelige sykdommen. Den vanligste formen er den latente tuberkulosen, som asymptomatisk, men har potensial til å reaktivere i en fulminant sykdom. Voksen sebrafisk og sin naturlige patogen Mycobacterium marinum har nylig vist seg for å være en gjeldende modell å studere brede sykdom spekteret av tuberkulose. Viktigere, kan spontane ventetid og reaktivering samt adaptive immunreaksjoner i sammenheng med mycobacterial infeksjon studeres i denne modellen. I denne artikkelen beskriver vi metoder for eksperimentell infeksjon av voksen sebrafisk, innsamling av indre organer for utvinning av nukleinsyrer for måling av mycobacterial laster og vert immunreaksjoner av kvantitative PCR. Den i in-House-utviklet, M. marinum -spesifikke qPCR analysen er mer følsom enn de tradisjonelle plating metodene det også oppdager DNA fra ikke-delte, sovende eller nylig døde mykobakterier. Som både DNA og RNA er Hentet fra samme individ, er det mulig å studere forholdet mellom syke staten, og de vert og patogen genuttrykk. Voksen sebrafisk modell for tuberkulose dermed fremstår som en svært aktuelt, ikke-pattedyr i vivo -system for å studere vert-patogen interaksjoner.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) er en mye brukt dyremodell i biomedisinsk forskning og det er en akseptert modell for vanlige virveldyr biologi. Sebrafisk har blitt tilpasset til mange felt forskning modellering menneskelige sykdommer og lidelser spenner fra kreft1 og hjertesykdom2 infeksjon og immunologiske studier av flere bakteriell 3 og virusinfeksjoner4 , 5. I tillegg ex utero utviklingen av sebrafisk embryoer har gjort sebrafisk en populær modell i utviklingsbiologi6 og toksikologi7,8.

På mange felt i forskning, inkludert infeksjonsbiologi, er optisk gjennomsiktig sebrafisk Larvene ofte brukt. De første immunceller vises i 24 h innlegget befruktning (hpf), når primitive makrofager er oppdaget9. Nøytrofile er neste immunceller vises rundt 33 hpf10. Sebrafisk Larvene er dermed mulig for å studere de tidlige stadiene av infeksjon og rollen til medfødt immunitet i fravær av adaptive immunceller11. Men gir den voksne sebrafisk med sin fullt funksjonell adaptive immunsystemet et ekstra lag med kompleksitet for infeksjon eksperimenter. T celler kan registreres rundt 3 dager legge befruktning12, og B-cellene kan produsere funksjonelle antistoffer i 4 uker post befruktning13. Den voksne sebrafisk har alle de viktigste kolleger av pattedyr medfødte og adaptive immunsystemet. Hovedforskjellene mellom immune systems av fisk og mennesker er funnet i antistoff isotypes også som anatomi av lymfoide vev. Sebrafisk har bare tre antistoff klasser14, mens mennesker har fem15. I fravær av benmargen og lymfeknuter, de primære lymfoide organene i fisk nyre og thymus16 og milten, nyre og tarmen tjene som sekundære lymfoide organer17. Til tross for disse forskjellene, med sin full immun arsenal av medfødte og adaptive celler, er voksen sebrafisk svært aktuelt, lett-å-bruk, ikke-pattedyr modell for vert-patogen samhandling studier.

Sebrafisk er siste etablert som en mulig modell å studere tuberkulose,18,,19,,20,,21,,22. Tuberkulose er en luftbåren sykdom forårsaket av Mycobacterium tuberculosis. Ifølge Verdens helseorganisasjon, tuberkulose forårsaket1,7 millioner dødsfall i 2016 og er den ledende dødsårsaken av en enkelt patogen verdensomspennende23. Mus24,25, kanin26 og ikke-menneskelige primater27 er det mest kjente dyr modeller i tuberkulose forskning men hver ansikt sine begrensninger. Ikke-menneskelige primas modell av M. tuberkulose infeksjon ligner menneskelige sykdommen nærmest, men bruker denne modellen er begrenset på grunn av alvorlige etiske betraktninger. Andre dyr modeller er hindret av vert-spesifisitet av M. tuberkulose som påvirker sykdommen patologi. Sannsynligvis det største problemet i modellering tuberkulose er bredt spekter av smitte og sykdom resultater i human sykdommen: tuberkulose er en svært heterogen sykdom fra sterilisering immunitet til latente, aktiv og reaktiveres infeksjon28 , som kan være vanskelig å reprodusere og modell eksperimentelt.

Mycobacterium marinum er en nær slektning av M. tuberkulose med ~ 3000 orthologous proteiner med 85% aminosyre identitet29. M. marinum infiserer naturlig sebrafisk produsere granulomer, kjennetegnene av tuberkulose, i sitt indre organer19,30. I motsetning til andre dyr modeller brukes i tuberkulose forskning, sebrafisk produserer mange avkom, det krever bare en begrenset plass og viktigere er det neurophysiologically de minst utviklede virveldyr tuberkulose modell tilgjengelig. I tillegg forårsaker M. marinum infeksjon latente infeksjon, aktiv sykdom eller selv sterilisering av mycobacterial infeksjon i voksen sebrafisk tett etterligne spekteret av sykdom resultatene av menneskelig tuberkulose19, 31 , 32. her beskriver vi metoder for den eksperimentelle tuberkulose modellen av voksen sebrafisk injisere M. marinum i bukhulen og bruker kvantitative PCR til å måle mycobacterial laster og immunreaksjoner fra sebrafisk vevsprøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle sebrafisk eksperimenter har blitt godkjent av dyr eksperiment styret i Finland (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Metoder utføres i henhold til loven (497/2013) og regjeringsdekret (564/2013) om vern av dyr som brukes til vitenskapelig eller pedagogiske formål i Finland.

1. dyrking av Mycobacterium marinum

Merk: Siden Mycobacterium marinum er en patogen kan forårsake overfladisk infeksjon hos mennesker, finne ut lokale retningslinjene for sikkerhet og biohazard avfallshåndtering før du begynner å arbeide med denne bakterien.

  1. Kultur M. marinum på en 7 H 10 plate supplert med 10% OADC (oljesyre, albumin, druesukker, catalase) berikelse og 0,5% v/v glyserol på 29 ° C i minst 5 dager. Opprettholde M. marinum kulturer ved å ta frisk bakterier fra fryseren annenhver uke og overføre til en ny plate annenhver uke.
    Merk: M. marinum er en naturlig fisk patogen infisere dyrearter og det er viktig å ta forholdsregler for ikke å forurense sebrafisk aksjer med bakterier. Infiserte sebrafisk og elementer forurenset med bakterier må holdes atskilt fra avl fasiliteter.
  2. Bruk en steril 1-µL inokuleringen sløyfe tas aseptisk overføre en loopful av M. marinum bakteriell masse i en celle kultur kolbe som inneholder 10 mL av 7T 9 medium med 10% ADC (albumin, druesukker, catalase) berikelse, 0,2% v/v polysorbat 80 og 0,2% v/v av glyserol. Kultur i 3-4 dager for ca en OD600 (optisk tetthet) av 0,7 ved 29 ° C i mørket uten risting. La hetten løs, eller bruke en filter-cap, for å tillate tilstrekkelig utveksling av gasser.
    Merk: Polysorbat 80 legges til medium å hindre aggregering av bakterier. I tillegg fører eksponering for lys fenotypiske endringer i bakteriell koloniene (f.eks, endres farge fra hvit til gul). For å unngå dette, kan du holde kulturer i mørket.
  3. Måle OD600verdien med et spektrofotometer. Fortynne flytende kulturen en OD600 av 0,07-0.09 og fortsette dyrking i 2 dager på 29 ° C i mørket uten risting. La hetten løs.
    Merk: Disse to dagene, bakteriell suspensjon vil nå et OD600av ca 0,5 tilsvarer en tidlig Logg-fase.

2. forberedelse av bakteriell løsning for å infisere voksen sebrafisk

  1. Overføre bakteriell suspensjon til store sterilt søppel eller en 15 mL tube og plasser den i mørket ved romtemperatur i 15 min tillate største klumper å avgjøre.
  2. Overføre den øverste 5 – 7 mL suspensjon til en ren rør eller søppel og måle OD600. Bruk denne topp fasen av fjæring for infeksjoner.
  3. Samle 1 mL av M. marinum kultur i en fersk rør og sentrifuge for 3 min 10 000 x g. Fjern nedbryting og resuspend pellet i 1 mL steril 1 x PBS.
  4. Fortynne å nå ønsket bakteriell konsentrasjonen ved hjelp av sterile 1 x PBS med 0,3 mg/mL fenol rød som en tracer. Del utvannet suspensjon i tre dele.
    Merk: Bruk en forhåndsbestemt OD600 vs CFU (colony-forming enheter) / µL kurve til å beregne fortynning for å få ønsket antall bakterier i 5 µL injeksjon volum34. Sammenhengen mellom OD600 og konsentrasjonen av bakteriell suspensjon må godkjennes før den faktiske infeksjon eksperimenter. Reserve to uker for denne godkjenningen datainnsamlingen.
  5. Bruker en 1 mL sprøyte, sakte trekker suspensjon gjennom en 27 G p 3 x. For hver aliquot, utføre dette trinnet bare før bruk.
    Merk: Ikke bruk den samme bakterielle løsningen for mer enn 2 timer.

3. eksperimentelle M. marinum infeksjon med Intraperitoneal injeksjon

  1. Pipetter en 5 µL dråpe fortynnet bakteriell løsningen på et stykke parafilm film og dra slippverktøyet til en 30 G insulin nål.
  2. Bruk 5-8-måneden-gamle vill-type fisk og rag1−/−hu1999 mutant fisk for eksperimentet. Bedøve voksen sebrafisk i akvariet vannet med 0,02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0). Plasser fisk ventrale siden opp til et slit på en fuktig skum plast.
    Merk: Rag-/- mutant fisk kan ikke gjennomgå somatiske rekombinasjon og produsere funksjonell T- og B-cellene.
  3. Sett inn nålen mellom bekken finnene på en ca 45° vinkel. Holde pinnen åpningen oppover for å observere at hele åpningen er i bukhulen. Injiser sakte bakteriell suspensjon og fjern forsiktig nålen.
    Merk: I tilfelle de røde tracer lekker ut av fisken ved injeksjon, utelukke fisken fra eksperimentet.
  4. Umiddelbart etter injeksjon, overføre fisken til en utvinning tanken med frisk tank vann.
  5. Ta prøver av bakteriell suspensjon på 7H 10 plater hver 15 minutter fra bakteriell aliquot i bruk og ruge bakterier på 29 ° C i 5 dager og kontrollere infeksjon dosen ved å telle koloniene på platene.
  6. Sjekk for fisk regelmessig og euthanize noen fisk med symptomer på infeksjon med over 0,02% konsentrasjon av 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0).
    Merk: Ca, 7% av den voksne sebrafisk infisert med 34 ± 15 CFU og 30% av sebrafisk infisert med 2029 ± 709 CFU har hatt symptomer ved 8 uker19. Symptomene kan omfatte unormal svømming, mangel på touch, gisper, ødem eller overholdelse sløse.
  7. Opprettholde sebrafisk ifølge de vanlige standarder35.

4. innhenting av indre organer

  1. Euthanize sebrafisk med en overdose av 3-aminobenzoic acid ethyl ester (over 0.02% konsentrasjon, pH 7.0) i akvariet vannet.
  2. Sett inn en pin bakre branchiostegal stråler og en annen gjennom halen å takle fisken på plattformen.
  3. Åpne hele bukhulen skalpell og samle de indre organene ved å bruke små skjeen og skarp endte pinsett. Starte fra hjertet og arbeide langs ryggraden mot halen koble alle indre organer i ett kvartal.
    Merk: Husk å samle alle nyre vev ved å skrape langs ryggraden med skjeen.
  4. Endelig bruke pinsett for å fjerne tarmen ved den tidligere imot kloakk og overføre organer i en 1,5 mL homogenisering rør med seks 2,8 mm keramisk perler. Umiddelbart plassere på tørris fryse prøven. Prøven kan lagres ved-80 ° C før homogenisert.
  5. Skyll instrumenter med 70% etanol mellom individer.

5. homogenisering og RNA utvinning fra en organ-blokk.

Merk: Metoden er endret fra Stanford University protokoller36.

  1. Legg guanidine thiocyanate-fenol løsning brukes for nukleinsyre utvinning (Tabell for materiale) på prøven til et totalt volum på 1500 µL. sikre at prøven dekker maksimalt 10% av det totale volumet.
    FORSIKTIG: Forventet volumet av høstet vev er 100 µL. Guanidine thiocyanate-fenol løsning inneholder giftige og irriterende forbindelser og krever verneklær, nitrilhansker og arbeider i avtrekksvifte. Ikke kombinere med blekemiddel da dette vil føre til dannelse av giftige gasser. Les sikkerhetsdatabladet (MSDS) før bruk.
  2. Homogenize prøver ved å bruke en perle-juling homogenizer 3 ganger for 40 s 3200 RPM. Kul på is 30 s mellom sykluser. Sonicate homogenisert prøvene i et vannbad i 9 min.
  3. Sentrifuge prøvene 12.000 x g i 10 min på 4 ° C og Flytt 1000 µL av de ryddet homogenate til en frisk microcentrifuge tube.
  4. Legge til 200 µL av kloroform, umiddelbart blande av vortexing for 15 s og Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
    FORSIKTIG: Kloroform er en giftig og irriterende sammensatte Hvis innåndet, svelget eller kontaktet med hud eller øyne. Bruke nødvendig sikkerhetsutstyr for personlig verneutstyr og arbeid i avtrekksvifte. Les sikkerhetsdatabladet (MSDS) før bruk.
  5. Sentrifuge 12.000 x g i 15 min på 4 ° C skille vandige og organiske fasene.
  6. Nøye, overføre 500 µL av topp fase til en frisk tube å unngå forurensende RNA. Fjerne og se bort fra resten av den vandige fasen (~ 100 µL) og lagre interphase og organisk fase 4 ° C for DNA utvinning.
    Merk: Den øverste fasen inneholder RNA.
  7. Legg til 500 µL av 2-propanol og umiddelbart blande av vortexing for 15 s. Incubate i 10 min ved romtemperatur å utløse RNA.
  8. Sentrifuge 12.000 x g i 10 min på 4 ° C pellets RNA. Fjerne nedbryting av pipettering.
  9. Legge 1 mL av 75% etanol og vortex for 10 s.
    Merk: Protokollen kan pauses her, og prøvene holdt over natten på 4 ° C.
  10. Sentrifuger 7500 x g i 5 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting av pipettering.
  11. Gjenta vask trinnene 5.9-5.10. Fjern nedbryting nøye av pipettering og la pellet air-dry i avtrekksvifte.
  12. Oppløse RNA pellet i 500 µL nuclease uten vann og holde prøvene på is. Måle konsentrasjonen med et microvolume spektrofotometer eller tilsvarende utstyr. Lagre RNA på-80 ° C.

6. rensing av co utdraget sebrafisk og Mycobacterial DNA

  1. Forberede en tilbake-utvinning buffer (BEB) ved oppløsning 118.2 g guanidine thiocyanate (siste konsentrasjon 4 M), 3.68 g natriumsitrat (siste konsentrasjon 50 mM) og 30.29 g Tris gratis Base (siste konsentrasjon 1 M) i 120 mL nuclease gratis vann (dette kan kreve røring over natten). Legge til nuclease-fritt vann i et siste totalvolum på 250 mL og filter å sterilisere løsningen.
    Merk: Denne bufferen kan lagres ved romtemperatur for inntil 6 måneder. Ikke kombinere BEB med blekemiddel som de reagerer for å produsere giftige gasser som Hydrogenklorid og hydrogencyanid.
  2. Bruk interphase og organisk fase av prøven for å trekke mycobacterial DNA. Legg til 500 μL BEB hver rør. Bland mye til 10 min ved inversjon ved romtemperatur.
  3. Sentrifuge rørene på 12.000 x g i 30 min ved romtemperatur og nøye overføre 500 µL av øvre vandige fasen med DNA som et nytt rør.
  4. Legge til 400 μL 2-propanol. Bland ved å snu og ruge i 10 min ved romtemperatur.
  5. Sentrifuge prøvene 12.000 x g i 15 min på 4 ° C. Pellets med DNA skal være synlig på dette punktet. Fjern forsiktig nedbryting av pipettering.
  6. Legge til 800 μL 70% etanol. Vask pellet ved inversjon. Gjør ikke vortex eksemplene på dette punktet, som genomisk DNA bryter ned lett.
  7. Sentrifuge prøvene 12.000 x g i 15 min på 4 ° C og fjerne nedbryting av pipettering. Gjenta etanol vask (trinn 6.6 og 6,7).
  8. Fjerne etanol ved nøye pipettering. La prøvene air-dry for 5 – 10 min. oppløse pellet i 200 μL av nuclease-fritt vann.
  9. Måle DNA konsentrasjoner med et microvolume spektrofotometer eller tilsvarende utstyr. DNA kan lagres på 4 ° C eller på 20 ° C for langtidslagring.

7. kvantitativ PCR for å måle Mycobacterial laster

  1. Forberede qPCR reaksjon mikser med no-ROX (carboxy-X-rhodamine) mot M. marinum interne transkribert avstandsstykket (ITS) mellom 16S-23S ITS i henhold til produsentens instruksjoner med MMITS1 primer (tabell 1). Pipetter reaksjonen blanding og smak fortynninger som duplikater på en 96-brønns plate egnet for qPCR. Inkludere en DNA standard fortynning serie av en kjent mengde bakterier i hver kjøring.
    Merk: Den forventede M. marinum belastning per fisk kan variere fra 0 CFU til 1.000.000 CFU på 4 wpi. QPCR analysen kan også utføres med andre qPCR kits, men den annealing temperaturen for primerne må være re optimalisert.
  2. Seal platen med en optisk gjennomsiktig film og sentrifuge plate 2000 x g i 2 minutter på 4 ° C.
  3. Kjøre qPCR programmet vist i tabell 2.
  4. Bruk av standardkurve, beregne antall bakterier i hele fisken prøven.

8. DNase behandling av RNA prøvene

  1. For å fjerne alle mulig resterende spor av genomisk DNA fra RNA, utføre DNase jeg behandling. Tine RNA prøvene på is.
    Merk: Husk å bruke bare RNase uten utstyr og løsninger og tørk av arbeidsgruppen overflaten og Pipetter med en dekontaminering reagens eliminerer RNases (Tabell for materiale) før du begynner å arbeide. Bruk en lang-sleeved labfrakk og hansker for å beskytte prøver.
  2. Forberede 10 μL DNase jeg reaksjon mikser på isen i henhold til produsentens instruksjoner. Mix 1 μL DNase jeg, 1 μL 10 x DNase buffer og 8 μL RNA sample inkludert maks 1 μg av.
  3. Forsiktig bland reaksjonene (ingen vortexing) og ruge i 30 min på 37 ° C.
  4. Før varme-inaktivering, legge til 1 µL 50 mm EDTA hvert 10 µL utvalg. EDTA er ikke lagt, vil RNA gjennomgå kjemiske fornedrelse når oppvarmet.
  5. Inkuber i 10 min på 65 ° C varme-Deaktiver DNase I. fortsette direkte til cDNA syntese eller lagre DNase-behandlet RNA på-80 ° C.

9. cDNA syntese

  1. Oppbevare alle reagenser og prøver på is og forberede reaksjon mikser i henhold til produsentens instruksjoner. For en 5 μL reaksjonen blanding, inkluderer 1 μL reversere transkripsjon Master Mix, 3 μL nuclease-fritt vann og 1 μL DNase behandlet RNA.
  2. Bland forsiktig omvendt transkripsjon reaksjonene og kort spinne røret, hvis nødvendig.
  3. Sett prøvene i en PCR-maskin og bruke vises i tabell 3.
  4. Fortynn cDNA i nuclease-gratis vann i qPCR til en maksimal konsentrasjon av 2,5 ng/μL, hvis nødvendig. cDNA kan lagres på 20 ° C.

10. måle sebrafisk genuttrykk av kvantitative PCR

  1. Klargjør en qPCR master blandingen på isen i henhold til produsentens instruksjoner, og beskytte mot lyset. Bruk primerne introdusert i tabell 1.
    Merk: For å beregne fold av induksjon for hver genet, måle uttrykket også fra et gruppert grunnleggende eksempel utvunnet fra 6 sunn sebrafisk.
  2. Forberede av hvert utvalg og Pipetter reaksjon mikser på en qPCR plate. Seal platen med en optisk gjennomsiktig film og sentrifuge plate 2000 x g i 2 minutter på 4 ° C før kjøringen.
  3. Kjøre qPCR vises i Tabell 4 med annealing temperatur avhengig av primer paret brukes (tabell 1).
  4. Analysere gene expression forholdet i forhold til en rengjøring genet (loopern437) med ΔCt-metoden ved hjelp av formelen:
    Equation

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Naturlig fisk patogen Mycobacterium marinum infiserer de innvendige organene av sebrafisk og produserer en systemisk infeksjon med histologisk synlig granulomer19. Voksen sebrafisk er infisert med M. marinum av en intraperitoneal injeksjon. DNA og RNA pakkes og mycobacterial belastningen er målt ved kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) med DNA som mal. Omrisset av metoden er vist i figur 1.

Første er mykobakterier brukes for å infisere fisk en viktig determinant for utfallet av infeksjon. En høy infeksjon dose M. marinum (~ 2000 CFU) fører til en progressiv sykdom som mycobacterial laster fortsette å øke til gjennomsnittlig bakterielle belastningen når rundt fem millioner bakterier (figur 2A) til slutt drepe fisken. En lav dose (~ 20-90 CFU) M. marinum fører til utvikling av en sykdom spektrum lik som sett i menneskelig tuberkulose (figur 2B). Bakterielle belastningen fortsetter å øke til rundt 4 – 7 uker (figur 2A og figur 3A), som i fleste fisken sykdommen når en stabil. Figur 2B viser et eksempel på distribusjon av sykdom resultater med en lav dose infeksjon: ca 7% av de infiserte sebrafisk var ikke begrense bakterievekst. Disse personene utviklet en primær progressiv sykdom og de døde innen to måneder etter smitte. Rundt ryddet 10% av individene mycobacterial infeksjon 4 uker. De resterende 65% av fisken befolkningen utviklet en latent mycobacterial infeksjon med jevn bakteriell byrder. Men mellom 8 og 32 uker av infeksjon, i 18%, aktivert latente infeksjonen spontant fører til progresjon av sykdommen.

Ved hjelp av fille-/- mutant fisk, er det mulig å studere rollen til adaptive immunreaksjoner i voksen fisk. Rag-/- mutant fisk ikke tilstrekkelig begrenser veksten av mykobakterier fører til høyere bakteriell laster (figur 3A) og økt sykelighet (figur 3B), tydelig demonstrere viktigheten av adaptiv immunitet i kontrollere mycobacterial infeksjon. Også kan viktigheten av adaptive svar i fremkaller visse cytokin reaksjoner i mycobacterial infeksjon studeres i denne modellen. Her viser vi at den adaptive responsen er nødvendig for effektiv induksjon av interleukin 4 (IL4) (Figur 3 c) men er unnværlig for induksjon av interferon-γ (IFNγ) på 4 wpi (figur 3D). Interferon-γ er et cytokin kjører svaret mot intracellulær patogener mens interleukin 4 er en vanlig megler i adaptive immunrespons mot ekstracellulære patogener. Betydelig høyere uttrykk nivåer av il4 i gruppen vill-type sammenlignet fille-/- mutant fisk refererer til viktige adaptive humoral svar i mycobacterial infeksjon (Figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyten studere utviklingen av mycobacterial belastninger i den voksne sebrafisk. Voksen sebrafisk er infisert med en intraperitoneal injeksjon av M. marinum. DNA og RNA trekkes fra de indre organene av fisken og M. marinum belastningen og vertens immunreaksjoner analyseres kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Injeksjon av M. marinum i voksen sebrafisk forårsaker et spekter av sykdomstilstander. (A) sebrafisk ble injisert med lav (34 ± 15 CFU) eller en høy dose (2029 ±709 CFU) M. marinum. Gjennomsnittlig laster for 5 fisk (unntatt 32 uker høy dose, n = 2) vises med SD. lavdose statistikk: * p < 0,05 sammenlignet med 1 uke, ** p < 0,05 sammenlignet med 1 og 2 uke. Høy dose statistikk: *** p < 0,05 sammenlignet med 1, 2, 8, 11 og 20 wk. ¤ lav dose vs høy dose p < 0,05. Endret fra Parikka et al. 201219. (B) typiske distribusjon av sykdom resultater innenfor en vill-type sebrafisk befolkningen smittet med en lav dose av M. marinum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: adaptiv immunitet påvirker løpet av mycobacterial infeksjon i den voksne sebrafisk. Voksen vill-type (wt) og rag1 (−/−) sebrafisk var infisert med en lav dose (n = 30) av M. marinum. (A) gjennomsnittlige mycobacterial laster ble målt med qPCR på 2, 4 og 7 uker innlegg infeksjon (wpi) (n = 10) * P < 0,05. (B) fisken var euthanized på utviklingen av symptomene på sykdommen og overlevelse tomter ble opprettet. (C). uttrykk nivåene av il4 ble målt på 4 wpi. (D) uttrykket nivåer av IFNγ ble målt på 4 wpi. (A og B) endret fra Parikka et al. 201219. (C og D) Endret fra Hammarén et al. 201438. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Gene Primer sekvens Avspenning temperatur
MMITS1 F: CACCACGAGAAACACTCCAA 65
16S-23SITS Locus AB548718 for M. marinum kvantifisering R: ACATCCCGAAACCAACAGAG
loopern4 F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT 61
Uttrykt repeterende elementer R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG
il4 GCAGGAATGGCTTTGAAGGG 59,5
ZDB-GEN-100204-1 GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT
ifnγ1-2 F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, 61
ZDB-GEN-040629-1 R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT

Tabell 1: Primer sekvenser og annealing temperaturer. Sekvenser av primere brukt og deres optimalisert annealing temperaturer. Primere for M. marinum 16S-23S rRNA transkripsjon er optimalisert for en nei-ROX qPCR kit og de andre primerne for en ROX inkludert qPCR kit.

Trinn Tid Temperatur
1 3 min 95 ° C
2 5 s 95 ° C
3 10 s 65 ° C
4 5 s 72 ° C (fluorescens gjenkjenning)
5 Gå til trinn 2. 39 ganger
6 Smeltende curve analyse 55-95° C med 0,5 ° C intervaller
7 Alltid 4 ° C

Tabell 2: qPCR program for å måle M. marinum DNA. En qPCR utformet i henhold til produsentens instruksjoner og optimalisert for å måle M. marinum DNA fra sebrafisk prøver.

Tid Temperatur
5 min 25 ° C
30 min 42 ° C
5 min 85 ° C
alltid 4 ° C

Tabell 3: cDNA programvare. Protokoll for å syntetisere cDNA fra det utdraget RNA i en infisert sebrafisk i henhold til produsentens instruksjoner.

Trinn Tid Temperatur
1 30 s 95 ° C
2 12 s 95 ° C
3 30 s Avspenning ° C
4 Gå til trinn 2. 39 Times
5 Smeltende curve analyse 65-95 ° C med 0,5 ° C intervaller
6 Alltid 4 ° C

Tabell 4: qPCR program for å måle vertens genuttrykk. En qPCR utformet i henhold til produsentens instruksjoner og optimalisert for å måle uttrykket av ulike sebrafisk gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi et qPCR-basert program å måle mycobacterial laster fra DNA utvunnet fra eksperimentelt infiserte voksen sebrafisk vev. Dette programmet er basert på primere designet rundt 16S-23S rRNA interne transkribert spacer sekvens40. Totalt mycobacterial belastning i en fisk prøve anslås ved hjelp av en standard kurve forberedt fra DNA Hentet fra en kjent rekke kulturperler mykobakterier og forutsatt at en bakterie har én kopi av dens Genova til enhver tid. Gjenkjenning grensen av M. marinum -qPCR er ca 100 kolonien danner enheter18. En klar fordel av metoden sammenlignet med tradisjonelle plating er at både aktive og ikke-delte sovende bakterier kan oppdages. I tillegg er et vanlig problem forurensende vekst på kultur plater fra sebrafisk vev circumvented ved denne tilnærmingen. Men som DNA brukes som mal, er det mulig at noen av kopiene målt kan utledes fra DNA av bakterier som døde nylig. En betydelig fordel av nukleinsyre-basert-protokollen er at som både DNA og RNA (samt proteiner, ikke er beskrevet her) kan hentes fra samme individ, mycobacterial belastningen av enkelt kan kombineres med genuttrykk data både på vert og bakterier.

Dosering av M. marinum er en viktig determinant av utfallet av infeksjon. Den lave M. marinum (~ 20-90 CFU) infeksjon dose produserer et spekter av sykdomstilstander med ventetid som den vanligste formen. Hvis infeksjon dosen er i tusenvis, utvikler en mer progressiv sykdom i fleste individer. Som naturlig smittsomme dosen er kjent for å være lav i menneskelig tuberkulose41, er bruker en lav dose av M. marinum i sebrafisk modell sannsynlig å produsere en mer naturlig infeksjon. For å nå den riktige dosen, sørg for å bekrefte forholdet mellom OD600 og colony-forming enheter før du starter noen eksperimenter. Den vanlige varianten av belagt infeksjon doser er ca. 30% og regnes ikke som et problem. Det er imidlertid viktig å kontrollere at hele 5 µL volumet av bakteriell suspensjon forblir inne fisken. Lekker injeksjon løsningen vil gi ekstra variasjoner i infeksjon dosen. I tillegg til infeksjon dose, kan belastningen av bakterier påvirke sykdomsprogresjon. Det har vært vist at virulens av de forskjellige M. marinum stammer kan endre mellom stammene. De to vanligste stammene er ATCC927 (fisk isolert belastningen i disse eksperimentene) og M belastningen. Men varierer disse stammer sterkt i deres virulens. Menneskelige-isolert M belastningen utvikler en mer progressiv sykdom mens fisk-isolert belastningen produserer en mildere sykdom godt egnet for å studere latent form av mycobacterial infeksjon33. Virulens av bakterier i en belastning kan også endre hvis bakterier serielt overføres fra en kultur til en annen, som kan forebygges ved å ta frisk mykobakterier fra fryser lager ofte nok.

In vitro dyrking av sakte dele M. marinum uten antibiotika er utsatt for forurensing. Derfor krever håndtering av bakterier strenge aseptiske tilnærming i laminær strømning hette. Mulig smitte i kultur kan oppdages som for høy et OD600 verdi, odde-ser bakteriell suspensjon eller kolonier. M. marinum koloniene er normalt fuzzy kanter, flat og matt hvit i fargen. M. marinum kulturer er følsomme for lys, og de produseres gule pigment når de utsettes for lys. Denne gule pigment kan brukes til å skille M. marinum kolonier fra andre bakterier etter infeksjoner. Miljøgifter kan forårsake fisken å dø snart etter smitte. Vanligvis vises de første symptomene på en lav dose infeksjon ikke før 3 uker stolpe infeksjon og noen dødelighet før dette tidspunkt er sannsynlig på grunn av forurensning i bakteriell suspensjon eller traumer forårsaket under injeksjon.

Voksen sebrafisk er svært følsomme for 3-aminobenzoic acid ethyl ester og overleve ikke hvis eksponeringstiden er for lang eller konsentrasjonen av anesthetic er for høy. Derfor når infeksjon, sebrafisk må utsettes for anesthetic for minimum av tid å oppnå god anestesi (~ 1-2 min). Etter infeksjon, voksen sebrafisk holdes i grupper på vanntemperaturen på 26-28 ° C. Hvis temperaturen er høyere eller lavere enn dette, kan det påvirke M. marinum vekst og kinetics av infeksjonen. Også er vannkvaliteten tank (mikrobiologisk kvalitet, saltkonsentrasjon, pH, oksygenmetning) en viktig rolle å sikre en vellykket eksperiment. Helseovervåking av fisken må utføres daglig og fisk som viser symptomer på infeksjon må fjernes fra gruppen og euthanized. Hvis fisk dør i akvariet, bli andre fisken infisert på nytt gjennom tarmen, som påvirker utviklingen av infeksjon.

Brukte sebrafisk larver modell av tuberkulose gjelder studie medfødt immunitet, som styrer forsøkene til et begrenset utvalg av verts-mikrobe interaksjoner. Bruk av voksen sebrafisk gjør det mulig å studere både medfødte og adaptive immunreaksjoner i en allsidig modell for18,32,39. Voksen sebrafisk fremstår som en praktisk virveldyr modell å studere hele spekteret av tuberkulose. Med en lav dose eksponering av M. marinum, 7% av fisken befolkningen utvikle primære progressiv sykdom, 10% kan sterilisere infeksjonen, 65% utvikler latent sykdom og 18% spontan reaktivering oppstår (figur 2). Sykdom spekteret ligner som sett i menneskelig tuberkulose, hvor de aller fleste utvikle en latent sykdom, ca 4 – 14% produserer primære aktive infeksjon i de første fem årene etter infeksjon42, 10-20% av tungt utsatte personer synes å sterilisere infeksjon43 og 5 – 10% av latent infeksjoner reaktivere44. Forskjeller i verter genetikk påvirker mottakelighet for tuberkulose og sykdom progresjon45. Dette er også sett i befolkningen sebrafisk som er genetisk svært heterogen i motsetning til mange andre laboratorium dyr46,47. Den naturlige genetisk variasjonen gjør det svært aktuelt modell i søket etter optimal immunreaksjoner i denne multifaktoriell sykdommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet har vært støttet av den finske kulturelle Foundation (H.L.), Tampere tuberkulose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., sekten), grunnlaget for finsk Anti-tuberkulose Association (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., sekten), Sigrid Jusélius Foundation (sekten), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane og Wen Erkko Foundation (sekten) og Academy i Finland (sekten). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo og Jenna Ilomäki er anerkjent for deres kundestøtte. Forfatterne bekrefter Tampere sebrafisk laboratorium for deres tjeneste.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27 G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 mL syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30 G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 mL homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  24. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  25. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  26. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  27. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  28. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  29. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  30. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  31. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
  32. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  33. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  34. Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  35. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  36. Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
  37. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
  38. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  39. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  40. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  41. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  42. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  43. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  44. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  45. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
  46. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  47. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 140 sebrafisk tuberkulose Mycobacterium marinum Mycobacterium tuberculosis mycobacterial infeksjon qPCR immunsystemet
Modellering tuberkulose <em>Mycobacterium marinum</em> infisert voksen sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luukinen, H., Hammarén, M. M.,… More

Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L. M., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter