Summary
Ingegneria tissutale di intero pancreas è una sfida a causa delle sue funzioni esocrine ed endocrine. Vi mostriamo un metodo per la dissezione di un pancreas suino intatto e il processo di decellularizzazione successo tramite aspersione di detergenti Triton X-100, sodio desossicolato e desossiribonucleasi.
Abstract
Ingegneria tissutale di intero pancreas può migliorare i trattamenti correnti per il diabete mellito. L'obiettivo finale è quello di pancreas di ingegnere di tessuto da un'origine allogenica o xenogeniche con le cellule umane. Una dimostrazione dei metodi per la dissezione efficiente, decellularizzazione e ricellularizzazione del pancreas suino potrebbe beneficiare il campo. Simile al pancreas umano, pancreas suino hanno uno speciale ordinamento anatomico con tre lobi (splenici, duodenale e connessione) arrotondato dal duodeno e intestino tenue. Il lobo duodenale del pancreas si connette al duodeno diversi piccoli vasi sanguigni. Ingegneria dei tessuti del pancreas è complicato a causa della sua natura esocrina ed endocrina. In questa carta, indichiamo un protocollo dettagliato per sezionare il pancreas suino intero e si decellularize con detergenti, risparmiando la sua struttura e alcune componenti della matrice extracellulare. Per ottenere la completa perfusione, l'aorta viene scelto come ingresso e la vena portale come sbocco. Altri vasi sanguigni (arteria epatica, della vena splenica, arteria splenica, albero dell'arteria e della vena mesenterica) e dei dotti biliari sono legati. Per evitare la formazione di trombi, il maiale è eparinizzato e, immediatamente dopo la dissezione, l'organo è lavato con eparina freddo. Per inibire l'azione di enzimi esocrini, decellularizzazione il pancreas è impostato a 4 ° C. Il decellularizzazione viene eseguita tramite aspersione di Triton X-100, sodio desossicolato e desossiribonucleasi, con un lavaggio esteso intermittente e finale. Con un successo decellularizzazione, pancreas appare bianco, e una valutazione istologica con ematossilina ed eosina Mostra un'assenza dei nuclei con una struttura di matrice extracellulare conservata. Così, il metodo proposto può essere utilizzato per sezionare e decellularize pancreas suino intero con successo.
Introduction
Diabete mellito è caratterizzato dalla presenza di elevati livelli di glucosio nel sangue. È riconosciuto come una sfida importante di sanità pubblica nella maggior parte dei paesi1. Alti livelli di glucosio nel sangue influenzano i vasi sanguigni e il sistema nervoso, causando danni agli occhi, cuore, reni, e l'ischemia dell'arto. I metodi tradizionali di trattamento comprendono le iniezioni di insulina esogena, farmaci e cambiamenti di stile di vita. Mettendo da parte una cura per la malattia, in alcuni casi, disponibili trattamenti non riescono a mantenere l'insulina a livelli terapeutici, con conseguente iperglicemia. Sebbene il trapianto di isole o intero pancreas elimini la malattia, non è fatto comunemente a causa di una carenza di organi del donatore adatto e per i rischi e le difficoltà insite da immunosoppressione e incapsulamento2.
Correnti miglioramenti nel campo della medicina rigenerativa e ingegneria dei tessuti possiedono la capacità di fornire una soluzione per questi problemi. Con la tecnica di decellularizzazione, il materiale cellulare da un donatore umano o animale può essere rimosso mentre le proteine importanti della matrice extracellulare (ECM), fattori di crescita e molecole di segnalazione sono conservate nell'impalcatura. Tali impalcature possono potenzialmente essere trapiantate senza la necessità di immunosoppressione, per ripristinare la funzione di organo dopo ricellularizzazione con le cellule staminali non immunogenico3,4 del destinatario. Gli organi da trapianto allogeneic o xenogeniche fonti tessutale possono essere utilizzati nel trapianto clinico, come le proteine della matrice extracellulare principali sono conservate tra le specie e non potrebbero essere respinta dopo trapianto5.
Decellularizzazione è un metodo ben esplorato che coinvolgono l'uso ottima delle forze fisiche, detergenti chimici ed enzimi in un ambiente fisiologico per rimuovere le cellule e materiale nucleare da un tessuto o organo. Ricellularizzazione è una procedura di semina di cellule nuovamente dentro l'organo acellulare. È una procedura intellettualmente difficile, che richiedono un gran numero di cellule, una strategia ottimale di semina delle cellule e un sistema di bioreattore per la cultura dell'organo alle condizioni fisiologicamente accettabili come temperatura, pressione e gas6.
Il pancreas può essere considerato un tessuto impegnativo per l'ingegneria tissutale a causa della sua capacità esocrina ed endocrina. Il tessuto exocrine secerne enzimi digestivi diversi, mentre la parte endocrina secerne ormoni, compresa l'insulina. Il decellularizzazione di pancreas intatto da mouse7,8, umano9e maiale10 è già stato segnalato usando gli enzimi (tripsina, desossiribonucleasi [dnasi]) e non ionici (Triton X-100) e detergenti ionici ( sodio desossicolato [SDC] e solfato dodecilico di sodio [SDS]). Tuttavia, seguendo i protocolli pubblicati, abbiamo lottato con successo dissezione e completa perfusione e decellularizzati pur mantenendo una struttura di ECM. Abbiamo speculato che i detergenti applicati durante il decellularizzazione causano la lisi delle cellule, liberando gli enzimi digestivi nell'organo. Gli enzimi rilasciati causerà un danno irreversibile al patibolo ECM e renderlo inefficiente per decellularizzazione e ricellularizzazione. Un design del metodo che efficacemente decellularizes pancreas mentre inibendo l'azione degli enzimi digestivi può risolvere il problema. Abbiamo scelto la strategia di Peloso et al., di decellularizzazione del pancreas ad una temperatura fredda, anche se non hanno segnalato sul perché la temperatura fredda è usato9. Allo stesso tempo, abbiamo progettato una strategia di dissezione con modifiche da Taylor et al. , scegliendo l'aorta come un ingresso di aspersione sopra il tronco celiaco (CT) e l' arteria mesenterica superiore (SMA)11.
In un articolo recentemente pubblicato12, dimostriamo un metodo per l'isolamento efficace e decellularizzazione di pancreas suino preservando alcuni componenti della ECM. In questa carta, ci mostra una descrizione dettagliata di come sezionare un pancreas intero suino contenente splenici, duodenale e lobi di connessione e presentare un protocollo graduale per successo decellularizzati.
Protocol
La dissezione di un pancreas suino e la procedura di decellularizzazione presentata qui seguire le linee guida etiche della Università di Göteborg.
1. preparazione dell'assetto decellularizzazione
- Utilizzando tubi in silicone 3 x 5 mm, collegare in serie il contenitore di aspirazione detergente alla pompa peristalic e quindi al pancreas nell'organo da camera tramite Il degassificatore (Vedi Figura 1). Collegare un raccordo maschio luer all'estremità libera del tubo nella camera di organo.
- Utilizzando un altro tubo di silicone di 3 x 5 mm, collegare la camera di organo per il detersivo Saldi contenitore tramite la pompa peristaltica per raccogliere il detersivo irrorato.
- Collegare una pipetta senza etichetta di 2 ml per le estremità libere dei tubi di aspirazione detergente contenitore e detergente scarico container.
- Tenere l'intero set-up a 4 ° C.
Figura 1: preparazione dell'assetto aspersione. Usando un tubo di silicone di 3 x 5 mm, come mostrato nel set-up, collegare in serie il contenitore di aspirazione detergente per la pompa peristaltica, il degasaggio e l'alloggiamento dell'organo. Le frecce nere indicano la direzione di flusso dal contenitore detergente ingresso alla camera di organo. Per la presa di detersivo, utilizzare un altro tubo di silicone di 3 x 5 mm e collegare l'organo da camera tramite la pompa peristaltica per il contenitore di detergente presa. Le frecce rosse indicano la direzione di flusso dalla camera di organo al contenitore detergente presa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. preparazione delle soluzioni di decellularizzazione
- Soluzione 1 (tampone fosfato salino [PBS]): aggiungere 8 g di cloruro di sodio (137 mM), 0,2 g di cloruro di potassio (2,7 mM), 1,44 g di fosfato di sodio (10 mM) e 0,24 g di fosfato di potassio (1,8 mM) a 1 L di acqua ultrapura e mescolare fino a scioglimento. Regolare il pH a 7.4 con acido cloridrico (HCl). In totale, 3,2 L di questa soluzione è necessaria.
- Soluzione 2 (PBS + eparina): aggiungere ad 1 L di soluzione 1, 3,4 mL di eparina (17 unità internazionali [UI] / ml). Preparare questa soluzione fresca e tenerlo su ghiaccio fino a quando diventa freddo. In totale, 1,2 L di questa soluzione è necessaria.
- Soluzione 3 (acqua ultrapura + sodio azide + disodico acido etilendiamminotetracetico [ed]): A 1 L di acqua ultrapura, aggiungere 1,86 g di EDTA (5 mM) e 200 mg di sodio azide (0,02%). Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 22 L di questa soluzione è necessaria.
- Soluzione 4 (PBS + sodio azide + EDTA): A 1 L di soluzione 1, aggiungere 200 mg di sodio azide (0,02%) e 1,86 g (5 mm) EDTA. Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 1 L di questa soluzione è necessaria.
- Soluzione 5 (acqua ultrapura + sodio azide): A 1 L di acqua ultrapura, aggiungere 200 mg di sodio azide (0,02%). Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 260 L di questa soluzione è necessaria.
Nota: EDTA forma un precipitato con DSC ed è stato escluso dalla soluzione 5 poiché verrà utilizzato per il lavaggio immediato prima e dopo il trattamento di DSC. - Soluzione 6 (DSC + Triton X-100): A 940 mL di acqua ultrapura, aggiungere 40 g di (4%) DSC, 60 mL di (6%) Triton X-100, 200 mg di sodio azide (0,02%) e 69,6 mg di fluoruro di phenylmethylsulfonyl (0,4 mM) (PMSF). Mescolare fino a scioglimento. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. Aggiungere PMSF prima dell'uso. In totale, 9,6 L di questa soluzione è necessaria.
- Soluzione 7 (DNasi): Aggiungere 10.000 Kunitz unità di dnasi-ho in 250 mL di PBS di Dulbecco (Kunitz 40 unità/mL) contenente CaCl2 e MgCl2. Preparare fresco e utilizzare immediatamente. Riscaldare la soluzione a 37 ° C prima dell'uso.
- Soluzione 8 (PBS + sodio azide): A 1 L di soluzione 1, aggiungere 200 mg di sodio azide (0,02%). Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 1 L di questa soluzione è necessaria.
3. dissezione del Pancreas suino
Nota: In questo studio, pancreas suino sono stati sezionati da eutanasia, peso 45 kg da una farm di suini di sesso femminile di eparinizzata (400 IU/kg).
- Posto il maiale sulla tabella di dissezione in posizione supina.
- Fare un'incisione del midline dal processo xiphoidal all'osso pubico (circa 40cm) usando un bisturi, esponendo tutti gli organi addominali.
- Individuare la splenica, duodenale e lobi di connessione.
- Individuare il livello della papilla duodenale maggiore e legare il duodeno oralmente da quel sito utilizzando due distinti punti di sutura.
- Legare l'esofago inferiore con due distinti punti di sutura e tagliare tra le legature con le forbici per togliere lo stomaco.
- Separare il tessuto connettivo dal colon per raggiungere l'intestino tenue.
- Separare il tessuto connettivo del colon che si attacca al lobo splenico del pancreas.
- Rimuovere i due punti dal piccolo intestino dopo legatura delle arterie.
- Trovare l'albero di arteria mesenterica inferiore e la vena mesenterica inferiore e legare con una sutura dove appaiono caudale del pancreas.
- Legare l'arteria splenica e vena insieme con una sutura, vicino alla milza, nel hilum e distalmente tagliare con le forbici per rimuovere la milza.
- Seguire il duodeno fino a quando i lobi duodenali e connessione vengono cancellati e legare il duodeno alla fine con due distinti punti di sutura.
- Sezionare la vena portale, lega i con una sutura per prevenire eventuali perdite di sangue dal fegato e tagliare prossimalmente alla legatura. Vena portale serve come una presa di corrente durante il decellularizzati.
- Sezionare e legare il dotto biliare e dell'arteria epatica con due punti di sutura. Tagliare distalmente alla sutura.
- Trovare l'aorta sotto la vena renale e sezionarla in direzione craniale dal muscolo e del tessuto connettivo, fino a quando raggiunge la zona del pancreas.
- Capovolgere delicatamente il pancreas e sezionare l'aorta, mantiene intatti, la SMA e la CT e tagliare l'aorta superiore a CT ed inferiore a SMA con le forbici.
- Tagliare i rimanenti tessuti circostanti con le forbici ed estrarre il pancreas.
- Usando una siringa da 50 mL collegata alla cannula arteriotomia di 4 mm, filo l'organo attraverso l'aorta con soluzione 2 fino a quando non perfuses l'intero organo o fino a quando l'intero organo diventa freddo.
4. preparazione del Pancreas suino decellularizzazione
- Mantenere il pancreas a 4 ° C o sul ghiaccio durante tutto il processo.
- Tagliare le suture del duodeno usando le forbici, pulirlo di cibo da vampate di calore 50-150 mL di acqua ultrapura usando una pipetta 25 mL e legare esso nuovamente con punti di sutura.
- Legare un'estremità dell'aorta e tutte le filiali oltre alla SMA e CT con punti di sutura per evitare perdite.
- Inserire l'altra estremità dell'aorta una cannula di 4 mm arteriotomia e lega i con punti di sutura.
- Irrorare il pancreas con soluzione 3 per 1 h a 20 mL/min utilizzando il set-up di decellularizzazione.
Nota: Prefill i tubi della pompa con soluzione 3, tale che nessun bolle immettere il pancreas. Cercare eventuali perdite da tutti i lati dell'organo e lega i rami vascolari tutti aperti con suture, ad eccezione della vena portale. - Congelare il pancreas a-20 ° C in soluzione 4 fino all'inizio del decellularizzati.
5. decellularizzazione del Pancreas suino
- Scongelare il pancreas a 4 ° C.
- Eseguire la pompa peristaltica nella confi gurazione di decellularizzazione con soluzione 3 a 20 mL/min fino a quando non sono visti bolle d'aria nel tubo di aspirazione detergente.
- Posizionare il pancreas nel contenitore di decellularizzazione e collegare il tubo di aspirazione detergente all'aorta del pancreas. Lavare l'organo mediante perfusione con soluzione 3 pernottamento in 20 mL/min a 4 ° C.
- Versare la soluzione lasciato nella camera di organo.
- Sostituire la soluzione 3 con soluzione 5 e irrorare il pancreas per 30 min a 20 mL/min a 4 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.
- Aggiungere la soluzione 6 e irrorare il pancreas per 8 h a 20 mL/min a 4 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.
- Lavare l'organo mediante perfusione con soluzione 5 per 96 h a 20 mL/min a 4 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.
- Preparare il pancreas per il trattamento della dnasi di ricircolo 500 mL di PBS di Dulbecco contenente CaCl2 e MgCl2 per 30 min a 37 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.
- Aggiungere 250 mL di soluzione 7 e irrorare il pancreas per 4 h a 20 mL/min a 37 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.
- Lavare l'organo mediante perfusione con soluzione 5 per 120 h a 20 mL/min a 4 ° C.
- Conservare l'organo in soluzione 8 a 4 ° C per brevi periodi o a-20 ° C per lunghi periodi.
6. Verifica di decellularizzazione
- Utilizzando le forbici, tagliare le biopsie 3 - 10 mm da tutti i lobi del pancreas e fissarli in formaldeide per 48 h a temperatura ambiente.
- Lavare i pezzi in acqua ultrapura per 15 min, elaborarli in un processatore di tessuti seguendo protocolli standard e incorporarli in paraffina.
- Tagliare sezioni da 5 µm utilizzando microtomo e li macchia di hematoxylin e 0,2% alcolica eosina Meyer (lui) seguendo protocolli standard.
- Mostra i vetrini al microscopio ottico per controllare la perdita dei nuclei.
Nota: Un pezzo da un tessuto fresco trattato nello stesso modo può essere utilizzato come un controllo per verificare la presenza di nuclei.
Representative Results
Immagini di dissezione pancreas suino rappresentativo, che possono aiutare nell'individuazione e nella dissezione dell'arteria mesenterica inferiore e vena albero, vena portale, l'arteria epatica, dotto biliare e l'aorta diramazione a CT e SMA, sono mostrate in Figura 2A, 2Be 2C (giallo frecce), rispettivamente. Figura 3A Mostra la morfologia lorda di un pancreas normale, che appare rosa chiaro e contiene splenica, connessione e lobi duodenali. Dopo decellularizzazione, il colore rosa è perso e pancreas decellularizzati sembra bianco pallido a colori. L'immagine di morfologia lordo risultati splenica, connessione e duodenali lobi di un pancreas decellularizzato è mostrato in Figura 3B. Figura 3 Mostra la presenza di molti nuclei blu in un pancreas normale macchiando con lui. In un pancreas decellularizzato, HE colorazione ha mostrato una perdita dei nuclei, come nessun nuclei blu sono veduti (Figura 3D).
Figura 2: immagini di una dissezione del pancreas suino. (A) posizione dell'inferiore albero di arteria e vena mesenterica (freccia gialla). (B) la legatura della vena portale, l'arteria epatica e del dotto biliare (freccia gialla). (C) Aorta ramificazione per il tronco celiaco e dell'arteria mesenterica superiore (freccia gialla). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: lordo morfologia e lui la macchiatura del pancreas normale e decellularizzati. (A) lordo morfologia di un pancreas normale. (B) lordo morfologia di un pancreas decellularizzato. Colorazione (C), egli mostra la presenza di nuclei blu in un pancreas normale. Colorazione (D), ha illustrato l'assenza dei nuclei blu in un pancreas decellularizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Proposta di protocollo, tramite aspersione di DSC e Triton X-100 a 4 ° C, sarà decellularize pancreas suino intero con successo. La sfida in questa tecnica è la dissezione del pancreas intatto contenente tutti e tre i lobi senza danneggiare il parenchima e relativi vasi fornenti, come pure la legatura degli altri rami vascolari dell'esemplare per irrorare l'organo senza perdite. Il pancreas suino ha un'anatomia differente rispetto al pancreas umano. Esso è costituito da tre lobi e rimane in stretto contatto con l'intestino tenue di parzialmente che lo circonda. Abbiamo sezionato il duodeno insieme al pancreas, come molti piccoli vasi sanguigni dal pancreas collegare l'intestino. Durante gli studi di ottimizzazione, taglio smussato di questi vasi sanguigni ha mostrato perdite e un'incompleta perfusione delle soluzioni.
Poiché l'aorta si connette al pancreas attraverso le arterie mesenteriche celiachia e superiori, abbiamo scelto l'aorta come un'insenatura per mantenere la perfusione semplice utilizzando solo una cannula e, pertanto, un ingresso. Nella nostra esperienza, legatura della aorta sopra il CT e sotto la SMA diminuirà il tempo di dissezione e riduce il rischio di danneggiare qualsiasi delle due navi. Oltre a un maiale eparinizzato, abbiamo anche notato che un'aspersione di eparina freddo tramite l'aorta immediatamente dopo la dissezione aiuta a raggiungere una perfusione di soluzioni in tutto l'organo. Speculiamo che se ciò si verifica, impedendo la formazione di coaguli di sangue nei vasi sanguigni. La perfusione iniziale di un pancreas con acqua ultrapura dopo dissezione sarà lisare cellule rosse del sangue e rimuovere i resti di sangue nell'organo, impedendo così la formazione di coaguli di sangue. Questo periodo consente anche di trovare qualsiasi deossiHb piccoli rami di vene e arterie, come flusso sanguigno può essere facilmente notato sopra lo sfondo.
Abbiamo scelto di mantenere la procedura di decellularizzazione tutta a freddo (4 ° C), come questo ostacolerà l'azione degli enzimi exocrine che liberano dalle cellule exocrine del pancreas. Gli enzimi exocrine, quando non inibita, possono causare un effetto deleterio sulle cellule ed ECM, come sono in grado di digerire le membrane cellulari e proteine12. Come il congelamento e lo scongelamento possono scoppiare in modo efficace le cellule, abbiamo incluso un passaggio di gelo/disgelo, inizialmente anche prima la perfusione di detergenti4,13. Il lavaggio iniziale dopo lo scongelamento rimuoverà i resti della cella scoppia. Il trattamento detergente che abbiamo utilizzato è un mix di DSC e Triton X-100 alle concentrazioni insolitamente elevate e ad una velocità alta perfusione. Abbiamo scelto questo approccio per raggiungere più veloce decellularizzazione rimuovendo le cellule esocrine che danneggiano l'ECM. Speculiamo che un protocollo rigido e veloce è utile per decellularizzazione di pancreas, come meno tempo sarà disponibile per gli enzimi pancreatici interagire con la ECM, preservando in tal modo buoni componenti della ECM. Per mantenere i componenti della ECM, abbiamo anche aggiunto inibitore della serina proteasi (PMSF) per le soluzioni detergenti, che inibisce l'attivazione di enzimi rilasciati da cellule esocrine14. Azoturo di sodio viene aggiunto a tutte le soluzioni di decellularizzazione, in quanto agisce come un agente batteriostatico, quindi inibente la possibilità di contaminazione batterica15.
Il pancreas decellularized seguendo questo protocollo ha mostrato una conservazione di strutture di ECM e la ECM proteine collagene ed elastina. Tuttavia, una perdita significativa di glicosaminoglicani è stata notata nel pancreas decellularizzati. Il pancreas decellularized in questo modo inoltre ha mostrato la promessa per l'attaccamento di cellule staminali embrionali umane del pancreas e l'espressione di marcatori esocrini ed endocrini in pezzi recellularized per 14 giorni12. Tuttavia, per generare un pancreas intatto e funzionale, ulteriore ricerca è richiesta nella valutazione di fonti di cellule corrette, tipi di cellule, cellula semina strategie e cultura bioreattore.
Disclosures
S.S.H. detiene partecipazioni in Verigraft, una società che ha concesso in licenza la tecnologia dell'ingegneria tissutale del vaso sanguigno. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da una sovvenzione dal governo svedese LUA ALF a S.S.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
| 2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
| Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
| PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
| Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Suture | Vömel | 14817 | |
| Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |
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