Summary
여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.
Abstract
세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 현재 합성 hydrogels 체 외에서 세포 배양 하지만 부족 필요한 단백질과 리간드 컴포지션 셀에서 생리 적 행동을 이끌어내는 강력한 기계적인 지원을 제공 합니다. 이 원고는 적절 한 기계적 견고성 및 지원 생 화 확 적인 구성으로 신장 피 질 ECM 파생 된 하이드로 겔의 제조 방법을 설명합니다. 히드로 기계적 조직 및 decellularized 인간 신장 피 질 ECM solubilizing 조작 이다. 매트릭스도 생리 적인 기계 stiffnesses 겔 화 하면서 네이티브 신장 피 질 ECM 단백질 비율을 유지 합니다. 히드로 신장에 따라 피 질에서 파생 된 세포 생리 적인 조건 하에서 유지 될 수 있다 기질 역할을 합니다. 또한, 하이드로 겔 조성 장병의 미래 연구를 가능 하 게 병 환경을 모델링을 조작할 수 있습니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 복잡 한 분자 구성 조직의 구조 및 기능 속성을 조정합니다. 구조 단백질 셀 공간 인식 수 있으며 접착 및 마이그레이션1있습니다. 바운드 ligands 제어 셀 동작2세포 표면 수용 체 상호 작용. 신장 ECM 분자의 조성과 구조에 따라 해부학 적 위치, 발달 단계, 및 질병 상태3,4의 과다를 한 포함 되어 있습니다. ECM의 복잡성을 업과 신장 파생 셀 체 외공부에서 핵심 요소 이다.
ECM microenvironments 복제에 이전 시도 recellularization의 건설 기계를 만드는 decellularizing 전체 조직에 집중 했다. Decellularization 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 등 화학 세제 또는 비 이온 세제, 수행 하 고 중 전체 장기 관류 또는 침수와 교 반 방법5,6,7 활용 ,,89,10,11,,1213. 여기에 제시 된 건설 기계 구조 및 생 화 확 적인 신호 기본 조직 ECM;에 보존 또한, 기증자-특정 셀과 recellularization에 임상 관련성 재건 수술14,15,,1617,18, 그러나 19., 이러한 건설 기계 구조 유연성 부족 하 고 따라서 생체 외에서 연구를 위해 사용 하는 많은 현재 장치와 호환 되지 않습니다. 이 한계를 극복, 많은 그룹이 추가 처리 decellularized ECM hydrogels20,,2122,,2324에. 이러한 hydrogels 사출 성형 및 bioink와 호환 되며 decellularized 세포에 건설 기계 장소 마이크로미터 스케일 공간 제약을 우회. 또한, 분자 구성 및 네이티브 ECM에서 발견 비율3,25유지 됩니다. 여기 신장 피 질 ECM (kECM)에서 파생 된 하이드로 겔을 조작 하는 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 목적은 신장 피 질 영역의 microenvironment 복제 하는 하이드로 겔을 생산 하는 것입니다. 신장 피 질 조직 세포 문제를 제거 하려면 지속적인 동요에서 1 %SDS 솔루션에서 decellularized입니다. SDS 면역 세포 소재6,7,,926를 신속 하 게 제거 하는 기능 조직 decellularize에 일반적으로 사용 됩니다. kECM는 다음 기계적 균질 및 동결은5,,69,,1126. 펩 신으로 강한 산에 가용 화 최종 히드로 재고 솔루션20,27에 발생합니다. 기본 kECM 단백질 구조에 대 한 중요 한 지원 및 신호 변환3,25유지 됩니다. 또한 네이티브 인간의 신장 피 질28,,2930의 한 차수 내는 히드로에 gelled 수 있습니다. 이 매트릭스는 다른 매트릭스 단백질에서 hydrogels에 비해 신장 특정 셀의 정지를 유지 하기 위해 사용 된 생리 적 환경의 제공 합니다. 또한, 매트릭스 구성을 조작할 수 있습니다, 예를 들어 콜라겐의 추가 통해-나, 신장 섬유 증 및 다른 신장 질환31,32의 연구에 대 한 모델 질병 환경.
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Protocol
인간의 신장 LifeCenter 북 서 윤리 지침을 장기 조달 단체의 협회에 의해 설정에 의해 고립 되었다. 이 프로토콜은 워싱턴 대학에 의해 제시 된 동물 관심과 셀 문화 지침을 따릅니다.
1입니다. 인간 신장 조직 준비
- Decellularization 솔루션의 준비
- 소독 5000 mL 비 커와 70 x 10 m m 저 어 바.
- 1:1000 (무게: 볼륨) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 비 커에 압력가 이온된 수에 혼합. 약 200 rpm 24 h 또는 SDS 완전히 녹아 때까지 저 어 접시에 솔루션을 둡니다.
참고: 일반적으로 1 %SDS 솔루션의 2500 mL은 단일 인간의 신장 decellularize 충분 합니다. - 500 mL의 멸 균 진공 필터 솔루션을 전송 하 고 멸 균된 밀폐 가능한 용기에 필터링 합니다.
- 신장 조직의 처리
- 세척 및 고압 집게, 두 개의 hemostat의 쌍 클램프, 일반 서비스 등급이 위, 두 메스 블레이드 핸들, 알루미늄 호 일, 그리고 36 x 9 mm 볶음 바 덮여 1000 mL 비 커.
- Underpad 조직 문화 후드 라인. 비 커, 메 마른 조직 문화 접시 (150 x 25 m m), 및 전체 신장 기관 후드에 놓습니다. 1 %SDS 솔루션의 500 mL로 비 커를 채우십시오.
참고: 인간의 신장 LifeCenter 북 서에서 얼음에 받았습니다. - 신장 균 조직 문화 접시 (그림 1A)에 놓습니다. 가볍게 메스 (그림 1B)로 신장 캡슐 주위 면도 모든 perirenal 지방 질을 제거 합니다.
- 충분히 깨 신장 캡슐 신장의 우수한 끝에 걸쳐 기본 피 질 조직 손상 없이 깊은 메스와 얕은 8-10 cm 절 개를 확인 합니다. 두 hemostat 클램프 (그림 1C) 피 질 조직에서 그것을 박 리 하 여 신장 캡슐을 제거 합니다.
- 신장 (그림 1D)의 측면을 따라 메스를 사용 하 여 코로나 평면 신장을 이등분. 메스 (그림 1E)와 medullar 지역 밖으로 조각 하 여 두 반쪽에서 피 질 조직을 분리 하 고 0.5 c m3 조각 (그림 1 층)으로 피 질 조직 주사위. 어떤 큰 보이는 혈관을 제거.
- 세포 외 매트릭스의 절연
- 조직 문화 후드, 1000 mL 비 커 500 mL 1 %SDS 솔루션을 채워 놓습니다. SDS 솔루션을 포함 하는 비 커로 절단된 피 조직과 저 어 바를 놓습니다. 압력가 알루미늄 호 일로 비 커를 커버 하 고 조직 문화 후드 밖에 약 400 rpm에서 저 어 접시에 놓습니다.
- 후 피 질 조직 24 h에 대 한 저 어 접시에, 조직 문화 후드로 비 커를가지고 고 나일론 메쉬로 만든 40 µ m 살 균 셀 여과기를 추가 합니다. 백제의 200 mL와 함께 별도 1000 mL 비 커와 조직 문화 후드에.
- 표 백제를 포함 하는 비 커에 셀 스 트레이너를 통해 SDS 솔루션 플라스틱. 플라스틱 모든 SDS 솔루션 decellularized 조직과 셀 스 트레이너는 비 커에 남아 때까지.
참고: 셀 여과기 어떤 조직 솔루션 열망 하는 동안 제거 되지 않도록 방지 해야 합니다. - 신선한 SDS 솔루션의 500 mL 비이 커에 채우기 셀 스 트레이너를 두고. 같은 알루미늄 호 일로 비 커를 커버 하 고 앞으로 같은 속도로 저 어 접시에 놓습니다.
- 5 일의 총 단계 1.3.1-1.3.3 신선한 SDS 솔루션 24 시간 마다 반복 합니다.
- Decellularized 조직을 압력가 디 물 단계 1.3.1-1.3.3에 설명 된 기술을 다음과 같은 3 일 총 24 시간 마다 헹 구 십시오.
- Decellularized 조직을 세포 문화 학년 물 단계 1.3.1-1.3.3에 설명 된 기술을 다음과 같은 2 일 총 24 시간 마다 헹 구 십시오.
- 1.3.1-1.3.2 단계를 반복 합니다. Decellularized 조직 (라고도 kECM이이 시점에서에) 30 mL 원뿔 튜브 자체 서에 전송 하 고 모든 조직 빠져들 때까지 셀 문화 학년 물으로 채우십시오.
2입니다. 하이드로 겔 재고 솔루션의 제조
- Decellularized 조직의 기계 가공
- 조직 문화 후드, 기계적으로 2 분 동안 조직 균질 화기와 원뿔 관 내의 kECM 균질.
참고: 무 균된 kECM ECM의 볼 수 없는 조각으로 불투명 한 솔루션을 유사 해야 합니다. - 이상 지속 되는 튜브를 둘러싼 끓는 때까지 액체 질소에 kECM를 포함 하는 원뿔 튜브 잠수함 하룻밤-4 ˚C에서 kECM를 저장 합니다.
- 조직 문화 후드, 기계적으로 2 분 동안 조직 균질 화기와 원뿔 관 내의 kECM 균질.
- 동결은 냉동된 decellularized 조직의
- 약간 가스 교환을 허용 하 고 튜브 동결은 기계를 원뿔 튜브 캡을 풉니다. Lyophilize는 kECM 3 일 동안 또는 그것은 정밀한 백색 분말을 닮을 때까지. 스토어-4 ˚C.
- 화학 소화와 젤의 가용 화
- 압력솥 20 mL 섬광 유리병 및 모자, 15.9 x 7.9 m m 저 어 바 파인 팁 집게 한 쌍
- 동결 건조 된 kECM의 무게와 HCl과 펩 신 solubilize 어디 m펩 신 펩 신의 질량은 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 3% (30 mg/mL) 솔루션 kECM 하는 데 필요한의 질량의 볼륨을 계산, m조직 의 질량은 동결 건조 된 조직, 그리고 VHCl 0.01 N HCl에의 부피는:
- 조직 문화 후드, 섬광 유리병을 돼지 위 펩 신, 0.01 N HCl, 그리고 저 어 바를 추가 하 고 모든 펩 신 해산 했다 때까지 약 500 rpm에서 저 어 접시에 그것을 두고. 섬광 유리병을 동결 건조 된 kECM를 전송 하 고 3 일 동안 약 500 rpm에서 저 어 접시에 솔루션을 떠나.
3. 하이드로 겔 겔 화
- 신장 ECM 히드로 준비
- 1 N NaOH, 미디어 보충 (M199), x 10과 kECM 히드로 재고 솔루션을 혼합 하 여는 히드로 젤 그리고 세포 배양. 얼음에 모든 솔루션을 유지.
참고: 최종 젤 7.5 mg/mL의 농도 세포 배양에 사용 되었다. kECM 젤의 1 mL 제시 세포 배양 실험을 위해 충분 했다. - 생산 가능한 kECM 젤의 볼륨 및 볼륨 V마지막 은 만든 젤의 볼륨 다음 방정식을 사용 하 여 필요한 재고 kECM 하이드로 겔의 결정, V주식 kECM 는 필요한 재고 kECM 하이드로 겔의 볼륨 C재고 kECM 주식 kECM 하이드로 겔의 농도 이며 C마지막 최종 젤의 농도:
- VNaOH 는 1 N NaOH의 볼륨 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 필요 시 약을 중화의 볼륨을 결정, V10 배는 M199 볼륨 10 X 미디어 보충, 그리고 V1 X는 세포 배양의 볼륨:
- 조직 문화 후드에서 자체 서 원뿔 튜브 살 균 30 mL로 중화 시 약 (NaOH, M199, 및 세포 배양) 플라스틱. Microspatula는 중화 시 약 해결책 혼합.
- 살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 중화 시 약 솔루션 주식 kECM 하이드로 겔의 적절 한 볼륨을 전송. microspatula를 사용 하 여 부드럽게 때까지 균질 색상 히드로 솔루션에서은 솔루션을 혼합.
참고: 천천히 그리고 부드럽게 교 반에 의해 기포를 소개 하지 마십시오. - KECM 히드로에 셀을 통합 단계 3.1.1.3에서에서 중화 솔루션 볼륨 계산에서 세포 배양 (V1 X)의 10 µ L을 뺍니다.
- 세포 배양의 10 µ L로 세포를 일시 중단 합니다. #셀 중단 하는 셀의 수를 의미 하는 곳을 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 셀 수를 결정 하 고 V마지막 은 만든 젤의 볼륨:
참고: 300, 000 셀/mL kECM 젤에 사용 된 셀의 농도 이다. - KECM 재고 솔루션 중화 시 약 솔루션으로 혼합 되어 최종 kECM 젤으로 세포 정지 솔루션의 10 µ L를 플라스틱. 셀은 고르게 분포 될 때까지 microspatula로 솔루션을 저 어.
- 세포 배양의 10 µ L로 세포를 일시 중단 합니다. #셀 중단 하는 셀의 수를 의미 하는 곳을 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 셀 수를 결정 하 고 V마지막 은 만든 젤의 볼륨:
- 1 N NaOH, 미디어 보충 (M199), x 10과 kECM 히드로 재고 솔루션을 혼합 하 여는 히드로 젤 그리고 세포 배양. 얼음에 모든 솔루션을 유지.
- 1 mL 주사기를 사용 하 여 kECM 히드로와 원하는 셀 문화 장치를 채우기 위해.
- 전송 하거나 셀을 도금 하기 전에 1 h 37 ˚C에서 설정 하 젤을 허용 합니다.
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Representative Results
KECM 히드로 네이티브 신장 microenvironment로 유사한 화학 성분과 신장 세포 배양에 대 한 매트릭스를 제공합니다. 조작 된 하이드로 겔, 하 신장 피 질 조직 전체 신장 기관 및 절단된 (그림 1)에서 기계적으로 격리 됩니다. 화학 세제 (그림 2A.1 A.3) 세제 입자 (그림 2A.4 A.6)를 제거 하는 물으로 린스 하 여 다음 decellularization 절연된 신장 피 질 ECM을 생성 합니다. 전형적인 기저 층 류 단백질 콜라겐 등 콜라겐 IV와 laminin의 구조 단백질 등을 확인 하는 조직학 평가-내가 유지 됩니다 유일한으로 vitronectin 주의 예외 (그림 2B). 또한, 단백질 구성, isoforms의 보전을 포함 하 여 ECM에 관찰 된 값과 일치 네이티브 신장 ECM (그림 3)에 남아 있습니다. ECM (그림 4A) 기계적으로 무 균 하 고 동결 건조 된 (그림 4B) 다음 최종 kECM 하이드로 겔 (그림 4C) 생산 solubilized. KECM 히드로 소량 보이는 조직 불투명 나타나고 전통적인 콜라겐으로 점성 아니었다-나 하이드로 겔. 15 mg/mL의 농도에 gelled kECM의 유 변 학적 측정 밝혀 약 800의 복잡 한 계수 (동적 탄성 계수) 스트레인의 선형 범위 Pa 7.5 mg/mL 콜라겐 보다 상당히 큰 값-나 (p = 1.602E-14). 인간의 신장 peritubular microvascular 내 피 세포 (HKMECs) 콜라겐에 교양-난, kECM, 및 1:1 혼합물 젤 CD31 식 세포 표면 및 접합 (그림 5)에서 구체적으로 표현 형에서 차이 보였다. 콜라겐에 교양 HKMECs-HKMECs 포함 kECM 표시 두 젤에 교양된 CD31 식 고르지 배포판에 감소 하는 동안 균일 CD31 식을 표시. 매트릭스 형식에 영향을 미칠 높은 PV1 및 낮은 VWF 식은 HKMECs에 나타나지 않았다.
그림 1: 신장 피 질 조직의 절연. 피 질 조직 kECM 하이드로 겔에 대 한 기본 자료로 분리 하는 전체 신장 기관의 기계적 처리. 기계 절연 시작 (A) perirenal 지방 조직의 제거. 지방이 많은 직물의 대형 조각 hemostat 클램프와 신장에서 찢 겨 수 있습니다. 남아 있는 지방이 많은 직물의 조각 각도에서 신장 캡슐에 대 한 메스를 실행 하 여 제거할 수 있습니다. (B) 신장 캡슐 최고의 hemostat 클램프와 기본 조직에서 신장 캡슐 필 링 신장 및 (C)의 우수한 끝을 따라 얕은 절 개 하 여 제거 됩니다. (D) 양분 코로나 축 신장 피 질과 수 질 영역의 시각화 수 있습니다. (E) 피 질 조직의 격리 가장 메스와 모 조직의 조각을 밖으로 조각에 의해 이루어집니다. 대뇌 피 질 영역의 색상 medullar 지역 보다 눈에 띄게 어두운 이며 사용할 수 있는 두 개의 해부학 별개 조직 분화. (F)를 포함 하는 피 질 조직의 최종 처리 조직 후속 decellularization에 도움 0.5 cm3 조각으로 다이 싱. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 피 층 조직의 Decellularization. Decellularized 직물의 특성 한 시각 및 조직학 분석 (A.1) Submerging 절단 1 %SDS 솔루션에서 피 조직 세포와 세포질 물자의 제거의 lysing 발생. (A.2) 후 1 시간 (A.3) 24 h, 조직 시작 색을 잃고, 나타내는 세포 문제 제거 되 고. 조직 희게 된 (A.4) 120 h 여 고 ECM만 남아 있다. 린스 (A.5) 24 h에 물과 (A.6) 120 h 조직에 표시 변경 표시합니다. (세포 물질의 완전 한 제거 및 주요 구조 단백질의 보존 근처 계시 B) 면역 형광 검사 치료 및 decellularized 피 층 조직의 얼룩이 지기 (콜라겐 IV = Col-IV; laminin 램; = fibronectin = FN, 헤 파 린 황산 proteoglycans = HSPG; 그리고 vitronectin VN =). 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: decellularized 직물의 질량 분광학. ECM 단백질 구성을 결정 하는 질량 분석에 의해 decellularized 피 층 조직의 분석. 모든 비율 질량 %로 측정 됩니다. (A) 구조 및 기저 lamina와 관련 된 다른 단백질 콜라겐 IV와-내가 가장 높은 표현 되 고 참석 했다. 모든 지하실 막에 유비 쿼터 스 (B.1) 콜라겐 IV a 1과 A2 체인 보존 했다. 콜라겐 IV A3 그리고 A5 체인, glomerulus의 지하실 막에만 발견 했다. (B.2) 일반적인 isoforms laminins의 (B.3) 콜라겐-또한 감지 했다. 이 수치는 허가12재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: kECM 하이드로 겔의 제조. Decellularized 피 질 조직의 기계 및 화학 처리 중화 시 약으로 겔 화에 따라 충분 한 기계적 성질을 실행할 수 있는 kECM 하이드로 겔을 생성 합니다. (A) decellularized 피 질 조직은 기계적 조직 균질 화기와 무 균 ECM의 아무 보이는 조각 남아 때까지. (B)는 조 악한 분말 동결은에서 3 일 후에 굴복 했다. 가용 화 (C) 섬광 유리병에 펩 신으로 HCl 및 화학 소화 가능한 kECM 히드로에서 결과. 히드로 낮은 점도의 불투명 했다. (KECM 히드로 겔 화 시 약을 중화와 다음의 D) 물리적 특성화 유 변 학적 실험 30 m m 직경 병렬 플레이트 시스템으로 수행 했다. 미네랄 오일 샘플 가장자리 보호 되었다과 로드 플랫폼 37 ˚C에서 설정 했다. KECM 히드로 테스트 전에 1 시간을 위한 젤을 허용 했다. 0.01 ~ 20% 사이 긴장 청소와 젤의 점 탄성 속성 측정 되었다. KECM와 콜라겐의 3 샘플-시험 되었다 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 세포 성장 특성. HKMECs 다른 행렬에 성장 형태학 차이 특성 Hydrogels 중화 시 약을 혼합 하 고 오픈입니다 금형에서 45 분 37 ˚C에서 설정 했다. HKMECs는 젤의 표면에 시드 하 고 고정 되 고 얼룩이 전에 72 h에 대 한 문화에 보관 했다. HKMECs에서 경작의 immunofluorescent 이미지 (A와 D) 7.5 mg/mL 콜라겐-내가 젤; (B와 E) 7.5 mg/mL kECM 젤; 그리고 (C와 F) 7.5 mg/mL 1:1 혼합물 젤. (A-C): 빨간 CD31; = 녹색 = VWF; 블루 = 핵; 눈금 막대 = 50 µ m. (D-F): 레드 = F-말라; 녹색 = PV1; 블루 = 핵; 눈금 막대 = 50 µ m. 이 수치는 허가12재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
행렬 셀 동작을 제어 하는 중요 한 기계 및 화학 신호를 제공 합니다. 합성 hydrogels 복잡 한 3 차원 패턴을 지원 하지만 생리 매트릭스 microenvironments에서 다양 한 세포 외 신호를 제공 하지 못하는 수 있습니다. Hydrogels 네이티브 ECM에서 파생 된는 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구를 위한 이상적인 물자 이다. 이전 연구를 사용 하 고 decellularized ECM hydrogels 호스트 면역학 응답33,34, 줄기 세포35,,3637 을 차별화 하는 방지 하기 위해 합성 바이오 코트 , 38, 2D와 소프트 리소 그래피 셀 문화39,40,,4142, 그리고 3 차원 인쇄43, bioinks의 준비에서 기판으로 44 , 45 , 46. ECM hydrogels 세포 접착을 시작 하 고 추가 확산 및 감 별 법2,47제어에 적절 한 신호를 제공.
비율 및 구성 등 collagens, laminins, 엘라 스 틴, fibronectin, 있다, ECM의 주요 구성 요소는 매우 조직48,49의 기능과 해 부 학적 위치에 따라 50. 잘 설립 특이 현상 또는 nonnative hydrogels ECM 파생을 사용 하 여 셀21,51,52,,5354에서 부적 절 한 응답을 이끌어내는 것입니다. 신장에서 ECM 구성 해 부 위치1,2사이 넓게 변화 한다. 그것은, 그러므로, 피 질, 수 질, 또는 실험적인 용도로 hydrogels 조작 하기 전에 시 등의 지역 사이 분화 하는 것이 중요.
여기 조작 kECM 매트릭스 decellularization는 순수 관련 기계적 강성3,25,28, 겔 화 하면서도 다음 네이티브 신장 피 질 ECM 단백질 비율 유지 29,30. 혈 청 알 부 민, 혈장 단백질 량을 decellularization 이스케이프 덤플링 바인딩 및55,56세 정으로 인해 decellularized 피 질 조직 내에서 발견 되었다. 펩 신, 신장 피 질 ECM 기본이 아닌 화학 주식 kECM 솔루션에 존재 하는, 비록 그것만 gelled 완성품의 2.5% (w/v)을 차지 한다. 또한, 펩 신 중화 시 약 해결책57의 추가 함께 비활성화 됩니다.
KECM 히드로는 신장 피 질 관련 세포 생리 적인 조건 하에서 유지 될 수 있다 기질 역할을 합니다. 우리는이 매트릭스 평면 표면에 HKMEC 성장을 지원할 수 있는 시연 했다. 이러한 HKMECs 기능 분석 실험, phenotypic 표정과 유전 식58통해 결정 무부하 생리 상태를 유지. 반면, 이러한 세포 활성화 되었다 때 콜라겐-나, 신장 섬유 증, 연관 매트릭스 구성 요소 1:1 비율59kECM 히드로에 추가 되었습니다. 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 콜라겐에 교양 있었다 때에 비교 하 여,-, 그들은 했다, 그리고 그들은 되었다 kECM12활성화와 함께 혼합. 따라서 콜라겐-탯 내 지하실 막 구성의 중요 한 요소가 될 것으로 알려져과 preeclampsia38,60같은 병 적인 상태에 따라 감소 됩니다. 이러한 결과 정지 하 고 또한 어떻게 조작 ECM 환경의 항상성을 영향을 미칠 수를 유지 하기 위해 조직의 특정 큐 셀을 제공의 중요성을 강조 표시 합니다.
개요 절차의 모든 단계는 중요 한, 몇 가지 단계는 조작된 하이드로 겔의 생존 보장에 중요 합니다. Decellularized 피 층 조직의 균질 정도의 기술 또는 장비 사용에 따라 달라 집니다. 그것은 찾을 최고의 조직 균질 것 이다 기술 해야 합니다. 가용 화, 동안 pH 3-4는 펩 신 활성 되도록 유지 한다. 시 약을 중화는 히드로 혼합, 철저 하 게 하 고 공기 방울의 소개 없이 젤 혼합 해야 합니다. 균일 혼합물 얻기 어려운 경우에 중립 젤 솔루션의 pH를 확인 합니다.
이 방법에 제시 하는 대표적인 결과 신장 세포의 생체 외에서 연구에 대 한 생리 적으로 관련 된 매트릭스를 얻을 수 있는 방법을 보여 줍니다. Decellularized 신장 피 질 ECM 최종 하이드로 겔 제품3,25ECM 단백질 비율 보존으로 신장에서 파생 된 세포 성장을 지원 하기 위해 이상적인 기본 자료를 제공 합니다. Gelled 제품 또한 순수 관련 기계적 특성28,,2930을 얻을 수 있습니다. KECM 히드로 적절 한 세포-매트릭스 상호 작용에 대 한 허용 하 고 콜라겐 보다 신장 세포에서 큰 생리 적 행동을 유도 표시 되었습니다-난 평면 표면에 경작 하는 경우. 또한,는 히드로 겔 더 순수 관련 3 차원 환경을 모델링할 전에 신장 특정 셀 시드할 수 있습니다. KECM 히드로의 구성도 조작할 수 있습니다 쉽게. 예를 들어 다양 한 양의 콜라겐은 히드로 혼합-겔 화 전에 내가 신장 섬유 증31,32의 진보 상태를 모방 하는 행렬을 생산할 수 있는. 알려진된 질병 ECM 작곡 모방이 ECM 파생 된 하이드로 겔의 tunability 영장 추가 조사 하 고 신장 질환의 미래 연구 하면.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 린 마이크가 비 이미징 연구실 줄기 세포 및 재생 의학 및 LifeCenter 북 서 연구소에서 인정 하 고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국가 학회 교부 금, UH2/UH3 TR000504 (재 혁)에 (Y.Z.)에 DP2DK102258, NIH T32 훈련 부여 DK0007467 (R.J.N.), 북 서 신장 센터를에서 제한 없는 선물의 금융 지원을 인정 하 고 싶습니다는 신장 연구소입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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