Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

שיטה מבוססת הדמיה מתואר כי ניתן להשתמש כדי לזהות שלב S ולנתח מחזור התא דינמיקה ב germline אנדרוגינוס C. elegans באמצעות של תימידין אדו אנלוגי. שיטה זו דורשת לא transgenes והוא תואם עם immunofluorescent מכתים.

Abstract

ניתוח מחזור התא פרוקריוטים מנצל לעתים קרובות כרומוזום מורפולוגיה, ביטוי ו/או לוקליזציה של ג'ין המוצרים הנדרשים עבור שלבים שונים של מחזור התא, או שילוב של תחליפי nucleoside. במהלך שלב זה, ה-DNA polymerases לשלב תימידין תחליפי כגון EdU או BrdU בהכפלת ה-DNA, לסמן את התאים עבור ניתוח. עבור C. elegans, nucleoside אדו אנלוגית היא שתתה את התולעים במהלך תרבות קבוע והוא תואם עם טכניקות immunofluorescent. Germline של C. elegans היא מערכת מודל רב עוצמה עבור הלימודים של איתות המסלולים, תאי גזע, מיוזה, מחזור התא כי זה שקוף, נתיישב גנטית, meiotic prophase, בידול הסלולר/gametogenesis מתרחשים הרכבה דמוי ליניארי. תכונות אלה להפוך אדו כלי נהדר ללמוד היבטים דינמיים של תאים mitotically אופניים ופיתוח germline. פרוטוקול זה מתאר את אופן בהצלחה להכין חיידקים אדו, להאכיל בהם פראי-סוג C. elegans אנדרוגינוסים, לנתח את בלוטת המין אנדרוגינוס, כתם על התאגדות אדו לתוך ה-DNA, כתם עם נוגדנים כדי לזהות את מחזור התא השונים, סמנים התפתחותית, תמונה של בלוטת המין ולנתח את התוצאות. הפרוטוקול מתאר הווריאציות שיטת וניתוח לשקילת S-פאזי אינדקס, M-פאזי אינדקס, G2, משך מחזור התא, בקצב חדירה meiotic ומשך קצב התקדמות meiotic prophase. בשיטה זו ניתן להתאים כדי ללמוד על מחזור התא או היסטוריה תא אחרים רקמות, שלבים, רקע גנטי והתנאים פיזיולוגיים.

Introduction

התפתחות בעלי חיים, מאות, אלפים, מיליונים, ביליונים או אפילו. טריליוני חלוקות תאים נדרשים כדי ליצור האורגניזם למבוגרים. מחזור התא, קבוצת הסלולר אירועים מורכב G1 (מרווח), S (סינתזה), G2 (מרווח), M (מיטוזה) מגדירים את סדרת אירועים להורג כל חלוקת התא. מחזור התא הוא דינמי ומוערכת ביותר בזמן אמת, אשר יכול להיות קשה מבחינה טכנית. טכניקות הוצג פרוטוקול זה מאפשר אחד להפוך את המידות של השלבים והתזמון של מחזור התא מתמונות סטילס.

תיוג עם תחליפי nucleoside כגון 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) או 5-ברומו-2'-deoxyuridine (BrdU) הוא תקן זהב כדי לזהות שלב S במחקרים של מחזור התא דינאמיקה של מבוגר Caenorhabditis elegans (C. elegans) אנדרוגינוס germline1,2,3,4,5. עידו והן BrdU יכול לשמש כמעט כל רקע גנטי, הם אינם סומכים על כל מבנה גנטי. להמחיש BrdU דורש טיפול כימי קשה לחשוף אנטיגן של נוגדן anti-BrdU מכתים, אשר לעתים קרובות אינו תואם ההערכה של סמנים אחרים התאית דמיינו ידי מכתימה במשותף עם נוגדנים נוספים. לעומת זאת, להמחיש אדו מתרחשת על ידי לחץ כימיה בתנאים מתון, ובכך הוא תואם עם נוגדן משותפת מכתים6,7.

ייחודה של התווית ברור, מאז גרעינים לשלב רק אנלוגים (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) תימידין לתוך ה-DNA במהלך שלב S. ויזואליזציה מתקיים בתוך הרקמה קבוע. התווית אדו הוא בלתי נראה בפני עצמו עד אזיד המכילים צבען או fluorophore מגיב covalently אלקין באדו על ידי לחץ מזורז נחושת כימיה8. עידו תיוג יכול לספק מידע מיידי שבו הגרעינים הם שלב S, באמצעות דופק קצר של תיוג. EdU יכולים גם לספק מידע דינמי, באמצעות הדופק. צ'ייס או תיוג רציפה; לדוגמה, בניסוי דופק. צ'ייס, התווית הוא מדולל-כל חלוקת התא או הופץ תאים כמו nondividing, ההתקדמות בפיתוח.

Germline אנדרוגינוס C. elegans הוא מערכת מודל רב עוצמה עבור הלימודים של איתות המסלולים, תאי גזע, מיוזה, מחזור התא. Germline למבוגרים הוא קו הרכבה מקוטב עם תאי גזע בקצה הדיסטלי ואחריו ערך וההתקדמות דרך prophase meiotic, בתיאום עם השלבים של gametogenesis יותר הציר הקרוב (איור 1). בסוף צינתור, oocytes מבוגרים, הם ovulated, מופרית ולהתחיל מופרה הרחם9,10,11. אזור זמן ~ 20 תא-קוטר ליד התא עצה הדיסטלי, אשר כולל הגבעול germline mitotically אופניים, ובתאים תאים S-שלב meiotic אבל לא התאים meiotic prophase, נקרא קדמון אזור2,4 , 9 , 12. קרום התא לספק הפרדה לא שלם בין האטומים ב germline דיסטלי, אבל אזור ובתאים עוברים תא mitotic רכיבה על אופניים במידה רבה באופן עצמאי. משך מחזור התא mitotic החציוני germline ובתאים אזור של אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים הוא ~6.5 h; שלב G1 הוא קצר או נעדר, ואת תרדמה לא נצפית1,2,13. התמיינות תאי גזע Germline מתרחשת דרך בידול ישיר במהותו, ובכך חסרה הגברה-טרנזיט חטיבות4. במהלך התמיינות בשלב pachytene, כ 4 מתוך 5 גרעינים לא יהוו oocytes אך במקום עוברים אפופטוזיס, מתנהג כמו האחות תאים על-ידי תרומת התוכן cytoplasmic שלהם כדי מתפתח oocyte12,14 , 15.

בנוסף תאי תיוג בשלב-S עם תחליפי nucleoside, ניתן לזהות את התאים מיטוזה, מיוזה באמצעות נוגדן מכתים. גרעינים של מיטוזה הם immunoreactive ל H3 אנטי-פוספו-היסטון7,(Ser10) נוגדנים (נקרא pH3)16. גרעינים של מיוזה הם immunoreactive נוגדן anti-לו-3 (ציר כרומוזום meiotic חלבון)17. הגרעינים באזור קדמון יכול להיות מזוהה על ידי העדר לו-3, הנוכחות של REC-8 nucleoplasmic18או הנוכחות של WAPL-119. WAPL-1 עוצמת הוא הגבוה ביותר בלוטת המין הסומטית, גבוה באזור ' קדמון ', ונמוך במהלך המוקדמות meiotic prophases19. מדידות מחזור התא מספר אפשריות עם כמה וריאציות של הפרוטוקול: אני) לזהות את הגרעינים בשלב-S ולמדוד את מדד S-שלב; II) לזהות את הגרעינים בשלב-M ולמדוד את האינדקס M-שלב; III) לקבוע אם הגרעינים היו בשלב mitotic או meiotic S; IV) למדוד את משך G2; V) מודד duartion G2 + M + G1 שלבים; VI) למדוד את קצב הכניסה meiotic; VII) הערכת קצב התקדמות meiotic.

אפשר להכין מספר מידות מחזור התא רק כמה סוגי רטוב-מעבדת ניסויים. להלן הפרוטוקול מתאר של תיוג דופק 30 דקות על ידי האכלה C. elegans אנדרוגינוסים למבוגרים עם עידו שכותרתו חיידקים ותאים M-פאזי תיוג במשותף על ידי צביעת עם נוגדן anti-pH3 ו קדמון אזור תאים על ידי צביעת עם נוגדן anti-WAPL-1. שינויים רק משך הזמן של עידו להאכיל (שלב 2.5), סוג של נוגדנים המועסקים (שלב 5) ולאחר ניתוחים (שלב 8.3) נדרשים עבור המדידות נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת התווית על-ידי עידו חיידקים

  1. לגדול תרבות starter של MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) נושא מוטציה ב- thyA.
    1. פס החוצה e. coli MG1693 של מניה גליצרול קפוא על גבי אגר מרק (ליברות) lysogeny צלחת פטרי 120 מ מ. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. לחסן מ בודדים שני e. coli MG1693 המושבות לתוך שני לשכפל צינורות 4 מ"ל של תרבות LB. נוזלי ב 37 ° C עבור h ~ 16.
      הערה: MG1693 גדל בסדר בעוד LB מבלי להשלים עם תימין או תימידין.
  2. לגדול e. coli MG1693 בתקשורת מינימלי בתוספת אדו.
    1. אוטוקלב בקבוקון חרוט 500 מ"ל.
    2. השתמש סטרילי טכניקה כדי להוסיף 5 מל של גלוקוז 20%, 50 μL של 10 מ"ג/מ"ל של תיאמין, μL 120 של תימידין 5 מ מ, 100 μL MgSO 1 מ'4, 200 μL של 10 מ מ אדו 100 מ של מאגר M9, 4 מ"ל של תוצרת טרייה תרבות MG1693 לילה.
      הערה: הריכוז הסופי של עידו הוא μM 20 בזו תרבות1,7. ריכוז זה מוביל DNA נזק ו מחזור התא מעצר אם מוחל ישירות לתאים בתרבית של תרבות20. עם זאת, רק שבריר של עידו זו מעוגנת לתוך של e. coli וזמינים לכן C. elegans. יש הוכחות של מחזור התא מעצר ללא שינוי בגודל של ' קדמון ' או M-פאזי אינדקס לאחר הטיפול אדו של אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים.
    3. תרבות בן לילה, אבל לא יותר מ 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
  3. להתרכז התווית על-ידי עידו e. coli ולהחיל על צלחות פטרי אגר M9.
    1. מראש מגניב צנטריפוגה שולחן עד 4 ° C.
    2. השתמש סטרילי טכניקה להעברת התרבות לתוך צינורות חרוט סטרילי 50 מ ל 2-4.
    3. Centrifuge התרבויות ב x 3000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות הצניפה את התווית על-ידי עידו e. coli.
      הערה: תשליך המכילות אדו תגובת שיקוע בהתאם להנחיות מקומיות ומוסדיים.
    4. Resuspend כדורי עם 4 מיליליטר M9 טריים. השתמש טיפ pipet עקר 1 מ"ל או pipet סרולוגית מ ל סטרילי. Resuspending כדורי עשוי להימשך מספר דקות.
    5. להשתמש את pipet אותה כדי להחיל ולהפיץ ~ 8 טיפות של התווית על-ידי אדו resuspended e. coli MG1693 למרכז בטמפרטורת החדר 60 מ מ M9 אגר פטרי. אצווה אחת מניבה ~ 16 מנות.
    6. לאפשר את הכלים יבש במשך מספר שעות או למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז לאטום כל מנה עם רצועה של סרטים מעבדה. ניתן לאחסן מנות ב- 15 ° C ~ 2 שבועות וב -4 ° C ~ 2 חודשים. השתמש מאותה אצווה של עידו מנות עבור כל ערכה של ניסויים.

2. להאכיל את אדו ל C. elegans

  1. סנכרן האוכלוסייה על ידי טיפול תת-כלורי, אלקליין להטיל ביצה מתוזמן עקב הבקיעה לתוך S-בינוני עם כולסטרול, או על ידי לקטוף את הבמה המתאימה21. לגדול החיות לשלב הרצוי (כאן, 24 שעות ביממה פוסט-L4) על תולעים נימיות מדיום הגידול עם e. coli OP50 ב- 20 ° C.
    הערה: הכנת בעלי חיים 50 – 100 לכל ניסוי, כפי כמה לא יכול לנתח היטב, אחרות יאבדו בתהליך שטיפת והעברת.
  2. לאפשר את הכלים אדו לחמם 20 ° C (או הטמפרטורה הדרושה הניסוי).
  3. לרחוץ את החיות של מנות NGM באמצעות M9 או באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לתוך צינור 1.5 מ. לאפשר החיות להתיישב בקצרה על-ידי כוח הכבידה או סיבוב קצר ב microcentrifuge.
  4. הסר את תגובת שיקוע, לרחוץ את החיות 1 – 2 פעמים עם ~ 1 mL M9 או PBS. הסר את תגובת שיקוע.
  5. השתמש בכוס פסטר פיפטה להעברת חיות וטיפה M9 או PBS במרכז הדשא אדו. המתן מספר דקות על הנוזל להיספג ולאחר מכן דגירה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (עבור S-שלב מדידה ישירה) או יותר (כדי למדוד את ההיסטוריה של S-פאזי), לפי הצורך.
    הערה: עידו האות הוא לזיהוי ב germline גרעינים אחרי קטנה כמו 15 דקות של עידו האכלה1.
  6. לשטוף את התולעים המנה אדו ~ 2 מ של M9 או PBS לתוך כוס לנתח את המנה.

3. ניתוח של קיבוע של C. elegans Germline

הערה: פרוטוקול זה הקרע, קיבוע של נוגדן כתמים germline אנדרוגינוס C. elegans הוא כמעט זהה לזו פורסם על ידי Gervaise ו- Arur (2016)22, חוץ מזה יכול להיות centrifuged את צינורות זכוכית 1 מ"ל כדי להגביר את מהירות שטיפת מדרגות וכוס ומתמשכת פסטר פיפטה יכול לשמש כדי להסיר את הנוזל צינורות זכוכית 1 מ"ל ביעילות רבה יותר.

  1. רוחצים את לנתח germlines C. elegans .
    1. לאפשר את החיות להתיישב לתחתית של המנה ויבתר, מערבולת כדי לאסוף את החיות במרכז, ולהשתמש פיפטה פסטר ארוך כדי להסיר PBS. לשטוף 1 – 2 פעמים עם ~ 2 מ"ל ל- PBS.
    2. להוסיף 2 מ של PBS ו 4 μL של 100 מ מ levamisole כדי לשתק את החיות. מערבולת המנה שוב כדי לאסוף את החיות במרכז המנה.
      הערה: הנייח יכול לקחת בין מספר שניות מספר דקות. קיבעון מלאה אינו נחוץ לצורך ניתוח מוצלח. יש אנשים שיש להם הצלחה טובים יותר כאשר לנתח שהיישום מתאושש חיות.
    3. לנתח את החיות עם זוג "5/8 25G מחטים על ידי חיתוך בראש (בערך בין שתי פקעות בלוע) או הזנב. . הנה. לא לחתוך את הלולאה של germline המעי, germline צריך "יצא" של חלל הגוף עקב הלחץ הפנימי, אבל יישארו מצורפים. פרוטוקול זה דומה שפורסמו בעבר Gervaise Arur (2016)22.
      הערה: לשמור את הזמן לנתיחה ~ 5 דקות, בהחלט לא יותר מ 15 דקות יותר פעמים ניתוח עלול לגרום לאובדן של נוגדן אות מכתימים (סודיר נאיאק, תקשורת אישית), רעב ב- PBS עשוי להשפיע על הפיזיולוגיה החיה. ללמוד לנתח במהירות ובדייקנות עלול לקחת קצת אימון.
    4. אם יש צורך, מערבולת כדי לאסוף את החיות ביתור במרכז, והשתמש על פיפטה פסטר ארוך כדי להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר.
  2. לתקן, מייבשים רקמות
    1. להוסיף 2 מ של 3% paraformaldehyde (PFA) בתמיסה PBS. מכסים את הכלי באופן רופף עם הסרט מעבדה וחנות על ספסל או במגירה במשך 10 דקות.
      הערה: הפשרת PFA פתרון 37 ° C רשמים, ואז להתקרר לטמפרטורת החדר לפני לנתח germlines.
      התראה: PFA הפתרון הוא רעיל בינוני קרוב לוודאי מסרטן ו teratogen. ואדים פולטות מפתרונות paraformaldehyde הם דליקים. ללבוש nitrile כפפות. לדלל מחברים בין 16% ל-3% בשכונה fume כימי. בשעת עבודה מחוץ fume הוד, שמור כל מכולה מכוסה.
    2. העברה הגונדות בקפידה שפופרת צנטרפוגה נקיים מ ל זכוכית.
    3. להוסיף ~ 3 מ"ל של PBSTw (PBS עם 0.1% Tween-20) למנה שהכיל הגונדות כדי לסייע באחזור גונדות הנותרים וכדי לדלל את הפתרון מחברים.
    4. ספין למטה ומפרידה קלינית ב 870 x g עבור ~ 1 מינימלית הצעיר או חיות קטנות יותר דורשים יותר פעמים ספין מבהמות ישנים יותר או גדול יותר.
    5. באמצעות פיפטה של זכוכית רב, להעביר את תגובת שיקוע גביע חומרים לא רצויים עבור ביטול בסופו של דבר בבקבוק חומרים לא רצויים בשכונה כימי.
    6. להוסיף 2 מ של מתנול בדרגה גבוהה טרום מקורר ל-20 ° C. מכסה הצינורית צנטריפוגה בחוזקה עם סרט מעבדה.
      הערה: השימוש במתנול טריים בדרגה גבוהה "גולד לייבל" חיוני עבור מורפולוגיה תקין עם נוגדנים מסוימים.
      התראה: מתנול הוא נוזל דליק, אדי, זה רעיל אם בלע, בשאיפה, או מותר ליצור קשר עם העור. ללבוש כפפות וציוד מגן אישי המתאים. השתמש מקפיא המתאים עבור כמויות קטנות של דברים דליקים.
    7. חנות במקפיא-20 ° C עבור h 1, אפילו לילה או אפילו מספר חודשים.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

4. נוזלים Germlines

  1. למלא את צנטריפוגה מבחנה העליון PBSTw כדי לדלל את מתנול, נתרענן הגונדות. ספין למטה ומפרידה קלינית ב 870 x g ~ 1 דקות.
  2. באמצעות כוס ארוכה פסטר פיפטה, להעביר את תגובת שיקוע גביע חומרים לא רצויים עבור ביטול בסופו של דבר בבקבוק חומרים לא רצויים בשכונה כימי.
  3. לשטוף את בלוטות המין 3 פעמים באמצעות ~ 5 מ של PBSTw, מסתובב למטה ומפרידה קלינית ב 870 x g ~ 1 דקות בכל פעם. הסר את תגובת שיקוע.
  4. לשטוף שפופרת זכוכית בורוסיליקט 1 מ"ל קטן וכוס ארוך פיפטה פסטר עם PBSTw.
  5. להוסיף ~ 700 μL של PBSTw ולהשתמש הזכוכית הארוך פיפטה פסטר להעביר הגונדות צינורית קטנה. השתמש כמה טיפות PBSTw נוספים כדי להבטיח כי כל בלוטות המין מועברים.
  6. ספין למטה ומפרידה קלינית ב 870 x g עבור מינימלית ~ 1 באמצעות כוס ארוכה ומתמשכת פסטר פיפטה, להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מבלי להפריע את בלוטות המין. יוצאים μL לא יותר מ-50.
    הערה: אם זיהוי נוגדנים אינה נחוצה, דלג לשלב 6.

5. לזהות אנטיגנים עם נוגדנים

  1. לדלל העיקרי נוגדנים בסרום 30% ב- PBS. בדוגמה הנוכחית, נוגדן anti-WAPL-1 הוא מדולל 1:2,000 והוא נוגדן anti-pH3 שבערך מדולל. צנטריפוגה סרום המופשרים טריים במשך 10 דקות microfuge ב x 20,000 g ב 4 ° C כדי להסיר את החלקיקים. השתמש את תגובת שיקוע, יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. להשתמש את הנסיוב המתאים כדי להתאים האורגניזם המארח של נוגדנים משניים (עז סרום משמש כאן). ניתן להוסיף שלב אופציונלי החסימה לפני התוספת של נוגדנים העיקרי.
  2. ΜL 100 של נוגדן ראשוני מדולל חלות על כל שפופרת זכוכית קטנים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
    הערה: הדגירה פעמים להשתנות על ידי נוגדנים. עבור כמה נוגדנים, מספיקה 2 h בטמפרטורת החדר. Incubations ארוך יותר (למשל- לילה) אפשריים, אך עלולה להגדיל את הרקע.
  3. מלא הצינורות למעלה עם PBSTw, ספין למטה ומפרידה קלינית ב 870 x g ~ 1 דקות.
  4. לשטוף את בלוטות המין 3 פעמים באמצעות ~ 1 מ ל PBSTw. Incubate ~ 5 דקות לכל לשטוף כדי לאפשר עודף נוגדן ראשוני לנטרל לתוך לשטוף. באמצעות ומתמשכת של זמן זכוכית פסטר פיפטה, להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מבלי להפריע את בלוטות המין. יוצאים μL לא יותר מ-50.
  5. לדלל את הנוגדנים משני בנסיוב עז 30% ב- PBS. בדוגמה הנוכחית, עז-נגד-ארנב-594, עז-נגד-עכבר-647 הם אחד מדולל ב 1:400.
    הערה: בחר נוגדנים משניים בקפידה כדי לוודא צבעי נבדלים לצבוע בערכה אדו. בדוגמה הנוכחית, ערכת אדו הכיל צבע עירור 488 ננומטר.
  6. ΜL 100 של נוגדנים משניים מדולל חלות על כל שפופרת זכוכית קטנים. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר 2 h.
    הערה: הדגירה פעמים להשתנות על ידי נוגדנים. עבור כמה נוגדנים משניים, מספיקה h 1 בטמפרטורת החדר. Incubations ארוך יותר (למשל- לילה) אפשריים, אך עלולה להגדיל את הרקע.
  7. לשטוף את בלוטות המין 3 פעמים באמצעות ~ 1 מ ל PBSTw. Incubate ~ 5 דקות לכל לשטוף כדי לאפשר עודף נוגדנים משניים לנטרל לתוך לשטוף. באמצעות ומתמשכת של זמן זכוכית פסטר פיפטה, להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מבלי להפריע את בלוטות המין. יוצאים μL לא יותר מ-50.
    הערה: בלוטות המין יכול להיות מאוחסן μL 100 ל- PBS לאחר שלב זה, במידת הצורך, למרות שזה עשוי להפחית את האות. הסר PBS לפני שתמשיך.

6. ביצוע התגובה EdU לחץ כדי לזהות אדו

הערה: ביצוע עידו את תגובת לחץ לפני הנוגדן צביעת מדרגות (לבצע צעד 6 לפני שלב 5) קיימת אפשרות, בהתאם הנוגדנים בשימוש7. עם זאת, ריאגנטים לחץ עלולים להפריע אנטיגנים מסוימים (למשל., נוגדן REC-8 הוא רגיש קיבוע ו- permeabilization). סדר הופעתן כאן התשואות נוגדן בהיר מכתים עם REC-8, WAPL-1, לו-3, pH3, דגל, CYE-1 נוגדנים משמש, בין היתר.

  1. הכינו את לחץ אדו קוקטייל8 טריים על-ידי הוספת הבאות צינור נקי mL 1.5. הסדר של תוספות הוא חשוב. להגן מפני אור ולשמור על כל ריאגנטים על קרח. המתכון הזה מניב מספיק דוגמא אחת (100 μL); להכפיל את המתכון לפי הצורך.
    1. להוסיף 2 מיליליטר מים הנדסה גנטית למאגר מוספים. זה הופך את 10 x מאגר כתוסף, אשר חייב להיות מדולל ל- 1 x מיד לפני השימוש.
    2. להוסיף μL 8.5 10 מאגר x 76.5 μL של מים הנדסה גנטית. מערבבים היטב.
    3. להוסיף 4 μL של 100 מ"מ CuSO4 (ייתכן תווית של רכיב אלקטרוני). מערבבים היטב.
    4. הוסף μL 0.25 של 488 ננומטר לצבוע אזיד. זה בטח הקרת בטמפרטורת החדר, כמו שלה ממיס, דימתיל סולפוקסיד, הוא מוצק ב 4 º C. מערבבים היטב, להגן מפני אור.
    5. מיקס 9 μL של הנדסה גנטית מים עם 1 μL של המאגר מוספים בתוך הכיפה של הצינור. Pipet מ המכסה כדי להוסיף הקוקטייל הנותרים ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  2. לבצע את תגובת לחץ אדו.
    1. להוסיף ~ 100 μL של לחץ על עידו קוקטייל הגונדות בצינור קטן. מכסה עם סרט מעבדה, תקופת דגירה של 30-60 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף פעם עם 100 μL התגובה שטיפה המאגר.
    3. לשטוף את הגונדות 4 פעמים באמצעות ~ 1 מ ל PBSTw. Incubate ~ 15 דקות לכל לשטוף כדי לאפשר אדו עודף קוקטייל רכיבים לנטרל לתוך לשטוף. באמצעות ומתמשכת של זמן זכוכית פסטר פיפטה, להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מבלי להפריע את בלוטות המין. יוצאים μL לא יותר מ-50.

7. כתם DNA ולהכין שקופיות

  1. להוסיף טיפה 1 (~ 25 μL) הרכבה antifade בינוני עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, נהגתי לדמיין את ה-DNA) בלוטות המין. חכה כמה דקות אז זה יכול ליישב ומערבבים עם הגונדות-
    הערה: לחלופין, לדילול 1:1,000 דאפי (מתוך מלאי 0.1 מ"ג/מ"ל) ב- PBS ניתן להחיל עבור 5 דקות, ואחריו μL 20 של 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] אוקטן (DABCO) גליצרול 90%, או הרכבה antifade אחר בינוני.
  2. להכין משטח גדול של agarose 2.5% בשקופית מיקרוסקופ זכוכית רגילה.
  3. זכוכית זמן השימוש חדש נקי אבק ללא פיפטה פסטר להעביר הגונדות משטח agarose. שמור כל בלוטות המין של נוזלים בתחתית צר פיפטה כדי למזער האובדן של בלוטות המין.
    הערה: בלוטות המין דבוק מבחנה קטנה או בכוס ארוכה פסטר פיפטה יכול להיות "לחלץ" על ידי שטיפה בעזרת PBSTw, איסוף הנוזל בקערה ויבתר איסוף חיות בודדות על גבי השקופית עם עפעף.
  4. להשתמש ריסים, או לולאה של שיער דק דבוק קיסם כדי להפיץ את הגונדות מעל משטח agarose ולהסיר את חלקיקי אבק.
  5. החל coverslip של זכוכית מלבני. התחתון לאט מצד אחד כדי למנוע בועות אוויר. השתמש בממחטה כדי להסיר עודפי פתרון ובכך למנוע את coverslip לנוע בחופשיות.
    הערה: בחר coverslips התואמים את המיקרוסקופ ייעשה שימוש. #1 ו #1.5 coverslips עובד טוב.
  6. לאפשר את השקופיות ליישב ויבש מעט ללילה בטמפרטורת החדר או 4 ° C. פעולה זו מסייעת לשטח מעט את בלוטות המין. יש לאחסן שקופיות ב 4 º C.
  7. אופציונלי: לאטום את הקצוות של השקופית עם לק, או סילר לאיטום שקופית אחרת. איטום הפינות קודם, ואז הצדדים, מונעת את coverslip הסטה.

8. קונאפוקלית הדמיה וניתוח

  1. תמונה בלוטת המין דיסטלי עם ספינינג דיסק פלורסנט מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם מקור אור אנרגיה גבוהה, מטרות התכנית-apochromatic מצלמת מיקרוסקופ יעילות גבוהה. לכידת התמונות עם 1 μm או רווחים הדוקה בין z-במחסן. שימו לב הזמן כוח, רגישות, חשיפה לייזר עבור כל הערוצים.
    1. השתמש בהבא: 405 ננומטר לייזר קו עירור עם מסנן פליטה nm (W60) 485 עבור דאפי, 488 ננומטר לייזר קו עירור עם מסנן פליטה nm (W55) 527 לאדו, 561 ננומטר לייזר קו עירור עם מסנן פליטה nm (W70) 615 עבור WAPL-1, excita קו 640 של ננומטר לייזר tion עם מסנן פליטה nm (W90) 705 עבור pH3.
      הערה: עוצמת האות ועוצמה רקע ישתנו. כמו כן, הזמנים נדרשת חשיפה ישתנו, ואולי עד 10-fold.
  2. השתמש ביישום plug-in תא מונה23 פיג'י24,25 לספור באופן ידני כל גרעין. תווית לכל גרעין בודדים בהתאם הנוכחות ואת היעדר pH3 אדו, WAPL-1. השתמש את השיעורים של גרעינים המתוארות בטבלה 1 ו- איור 2, כפי אלו יקל על כל החישובים המפורטים להלן.
    הערה: ניסיונאים מיומן לסמוך באופן מדויק כל הגרעינים בתמונת 3D ללא ספירת כפול או חסר כל הגרעינים. . לסירוגין, אחד יכולים לספור כל גרעין של כל מטוס ה-z, התסריט סימני-כדי-תאים R3 עשוי לשמש כדי להסיר גרעינים הכפל-ספרתי.
  3. לחשב את מספרי הטלפון הנייד והתדרים מן הסעיפים לעיל בהתאם לסוג של מחזור התא מדידה הדרושים. סוגי גרעינים מוגדרים טבלה 1 ו- 2 איור. החישובים מסוכמות בטבלה 2.
    1. (וריאציה אני) כדי לזהות את הגרעינים בשלב-S, להאכיל את בעלי החיים אדו למשך 30 דקות. כל גרעינים הצגת תווית אדו הם S-שלב הגרעינים. כדי לחשב, לקחת סכום גרעינים A ו- C, ראה טבלה 1 ו- 2 איור.
      הערה: 30 דקות אדו דופק בפראי-סוג אנדרוגינוסים למבוגרים, אדו כל תווית הגרעינים הם במשותף עם תוויות עם סמנים קדמון אזור1.
    2. כדי למדוד את אזור קדמון, כתם עם סמן אזור קדמון כגון REC-8 או WAPL-1 נוגדן. באזור ' קדמון ' מוגדר כאן כמו כל אורח/ים ילד/REC-8 nucleoplasmic18 או גרעינים immunoreactive germline WAPL-1. כדי לחשב, לסכם את כל הגרעינים immunoreactive WAPL-1 (A + B + C + D, ראה טבלה 1 ואיור 2).
      הערה: WAPL-1 גם מתייגת את DTC ואת הגרעינים סומאטית בלוטת המין אשר לא צריכה להיחשב. סומאטית גרעינים קלים לזיהוי על ידי אות WAPL-1 חזק מאוד, מיקום מעט החוצה את germline, מורפולוגיה "הביצה" של הגרעינים.
    3. כדי למדוד את האינדקס S-פאזי, לבצע 30 דקות ניסוי אדו, תווית במשותף עם נוגדן REC-8 או WAPL-1. מדד S-פאזי מוגדר את הפרופורציה של אזור קדמון זה בשלב-S. כדי לחשב, לספור כל שלב S גרעינים, ולאחר מכן לחלק לפי המספר הכולל של גרעינים אזור קדמון (A + C / A + B + C + D, ראה טבלה 1 ואיור 2).
    4. (וריאציה II) כדי לזהות את הגרעינים בשלב-M, כתם עם נוגדן pH3. הגרעינים immunoreactive כל pH3 הם M-שלב הגרעינים. זה עובד בלי קשר משך אדו להאכיל. כדי לחשב, לקחת את הסכום של A ו- B גרעינים, ראה טבלה 1 ו- 2 איור.
      הערה: WAPL-1 גם מתייגת את DTC ואת הגרעינים סומאטית בלוטת המין אשר לא צריכה להיחשב. סומאטית גרעינים קלים לזיהוי על ידי אות WAPL-1 חזק מאוד, מיקום מעט החוצה את germline, מורפולוגיה "הביצה" של הגרעינים.
    5. כדי למדוד את האינדקס M-שלב, שיתוף תווית עם pH3 REC-8 או נוגדנים WAPL-1. מדד שלב M מוגדר את הפרופורציה של אזור קדמון זה בשלב-מ'. כדי לחשב, לספור כל הגרעינים M-פאזי, ולאחר מכן לחלק לפי המספר הכולל של גרעינים אזור קדמון (A + B / A + B + C + D, ראה טבלה 1 ואיור 2).
    6. (וריאציה השלישי) הגרעינים בשלב mitotic ו- meiotic S-שניהם תווית עם עידו. לספר שתי האוכלוסיות ביניהם, לקבוע אם שלב S יושם על ידי מיטוזה או מיוזה. כדי לקבוע האם בשלב mitotic או meiotic S-גרעינים, להאכיל אדו במשך 4 שעות ותווית שיתוף עבור pH3 (סמן M-פאזי) ולו-3 (ציר כרומוזום meiotic חלבון) על ידי נוגדנים מכתים. להקליט גרעינים המציגים אדו והן pH3 (סוג, ראה טבלה 1 ואיור 2) כשלב mitotic S-תוך גרעינים המציגים אדו והן לו-3 (סוג E, ראה טבלה 1 ואיור 2) כשלב-meiotic S.
    7. (וריאציה IV) לחשב את משך שלב G2.
      הערה: שלב G2 מפריד שלב S M-שלב. אמנם אין סמן דווחה לתווית G2 ב germline C. elegans , ניתן לחשב את משך שלב G2 על-ידי שילוב נתונים מספר ניסויים זה תווית M-פאזי (בזמנו של דיסקציה) ו- S-פאזי (החל מספר שעות לפני ניתוח). תא המציג M-פאזי וסמנים S-פאזי השלימה שלב G2 במהלך הניסוי. תא המציג רק את סמן M-פאזי, לא דה מרקר S-שלב היה לא שלב S במהלך הניסוי.
      1. כדי לחשב את משך שלב G2, להאכיל אדו עבור 2 h ותווית שיתוף עם נוגדן pH3. לבחון רק גרעינים זה תווית עם pH3 (אלה ב- M-שלב בזמנו של דיסקציה) לנוכחות של אדו (אלה היו בשלב-S במהלך התווית אדו 2 h לפני ניתוח). לחשב את השבר של M-שלב הגרעינים השלימה שלב G2 (A / A + B, ראה טבלה 1 ואיור 2).
      2. חזור על הניסוי הזה עם תווית אדו 3 h, ושוב עם תווית אדו 4 שעות (וכאופציה תווית אדו 5 שעות). מגרש האחוזים של גרעין חיובי pH3 כי הם עידו חיובית על ציר-y ואת משך הזמן של עידו תווית בציר ה-x, כפי שמוצג באיור 3 א.
      3. לחשב משך הזמן החציוני של שלב G2 על-ידי חיבור הנקודות בגרף של קביעת איפה הקו חוצה 50%, כפי שמוצג באיור 3 א.
      4. לחשב את משך הזמן המרבי שלב G2 על-ידי חיבור הנקודות בגרף של קביעת איפה הקו חוצה 99%, כפי שמוצג באיור 3 א.
    8. (וריאציה V) לחשב את duraion של G2 + M + G1.
      הערה: ב germline C. elegans , שלב G1 הוא קצר מהרגיל. אמנם אין סמן דווחה לתייג G1 ב germline C. elegans , אחד יכול להעריך את סכום משך שלב G2, M ו- G1 ולאחר מכן השווה הפעם עם הזמן שלב G2 שתוארו לעיל. משך הזמן המרבי G2 + M + G1 מוערך מן האחוז של קדמון כל אזור גרעינים (WAPL-1 immunoreactive) שנותרו שלילי אדו (לא עברה שלב S) לאחר אדו תיוג למשך מספר שעות.
      1. כדי לחשב את משך G2 + M + G1, להאכיל אדו עבור 2 h ותווית שיתוף עם נוגדן REC-8 או WAPL-1. לקבוע את השבר של אזור קדמון שעברו שלב S במהלך תקופה זו (A + C / A + B + C + D, ראה טבלה 1 ואיור 2).
      2. חזור על הניסוי הזה עם תווית אדו 3 h, ושוב עם תווית אדו 4 שעות (וכאופציה תווית אדו 5 שעות). מגרש האחוזים של REC-8 או WAPL-1 גרעין חיובי כי הם עידו חיובית על ציר-y ואת משך הזמן של עידו תווית בציר ה-x, כפי שמוצג באיור 3B.
      3. לחשב את משך הזמן המרבי G2 + M + G1 על-ידי חיבור הנקודות בגרף של מציאת איפה הקו חוצה 99%, כפי שמוצג באיור 3B.
        הערה: זה אפשרי לבצע ניסויים כדי לקבוע את משך G2 ו- G2 + M + G1 כערכה בודדת של 2, 3, 4, 5 שעות אדו ניסויים על-ידי תיוג במשותף עם הארנב-נגד-WAPL-1 והן העכבר-נגד-pH3 נוגדנים.
    9. (וריאציה השישי) כדי לזהות גרעינים זה שוכפל באזור קדמון לך מאז נכנס מיוזה, להאכיל את בעלי החיים אדו עבור 10 h ותווית שיתוף עם נוגדנים REC-8 או WAPL-1. כל הגרעינים הצגת תווית אדו היו בשלב-S במהלך h 10 האלה. כל גרעינים שאינם מציגים nucleoplasmic REC-8 או WAPL-1 מכתים היו מיוזה. פשוט לספור הגרעינים עם עידו תיוג שאינם מציגים תיוג עם הסמן אזור קדמון (E, ראה טבלה 1).
      הערה: לעומת זאת, אם בלוטות המין מוכתמים עבור דה מרקר meiotic prophase לו-3 עם נוגדנים anti-לו-3, לספור מספר גרעינים עם עידו תיוג זה הן גם חיובי עבור לו-3.
    10. כדי לחשב את קצב הכניסה meiotic, לבצע את הניסוי הנ עם תווית 5 שעות, 10 h ו- 15 h אדו. מגרש מספר גרעינים שנכנסו מיוזה על ציר-y ואת משך הזמן של התווית אדו בציר ה-x, כפי שמוצג באיור 3C. לאחר מכן להשתמש כדי לחשב את השיפוע (מיוזה גרעינים נכנסו לכל h) של רגרסיה ליניארית פשוטה מ y = mx + b.
      הערה: חיוני לשימוש של רגרסיה ליניארית לצורך חישוב ירידת ערך meiotic. זה יהיה שגוי לחלק מספר גרעינים זה שהזין מיוזה משך התווית אדו, פשוט מפני החיתוך-y אינה אפס.
    11. (וריאציה השביעי) למדוד את קצב התקדמות meiotic.
      הערה: מאז אדו covalently משולב לתוך ה-DNA, זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר אוכלוסייה של תאים דרך בידול. התאים שעברו שלב S באזור קדמון שומרים על התווית אדו כפי שהם נכנסים מיוזה, ההתקדמות מיוזה, עוברים oogenesis. ניסוי. צ'ייס דופק עם עידו יכול לשמש כדי למדוד את קצב התקדמות meiotic.
      1. להאכיל התווית על-ידי עידו חיידקים בעלי החיים במשך 4 שעות ("דופק"). להעביר את החיות ללא תווית OP50 חיידקים במשך 48 שעות ("המרדף"), ולאחר מכן לנתח, שיתוף תווית עם סמן אזור קדמון כגון REC-8 או WAPL-1 (או סמן meiotic prophase כגון לו-3) במידת הצורך.
      2. כאשר הדמיה, חפשו את המיקום של גרעין התווית על-ידי עידו מקורב ביותר. הקצב של ההתקדמות meiotic הוא המרחק (ב תאים קטרים מהקצה של אזור קדמון) נסע על ידי אדו מקורב ביותר הנקרא גרעין במהלך המרדף 48 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאז לסינתזת DNA נדרש לשלב אדו, ניתן להסיק כי הגרעינים התווית על-ידי עידו עברה שלב S במהלך חלון הזמן תיוג-אדו. אחד יכול לפרש הגרעינים שהמדבקה ב 30 דקות הנקה עם עידו כאנטי חיידקים גרעינים ב S-שלב ביצוע ניתוח. גרעין זה תווית ב עוד רציף אדו האכלה ניסוי עשוי תייגת מוקדם בחלון הזמן ומאז S שמאל-שלב, או ייתכן תייגת בחלק מאוחר של חלון הזמן אדו. עידו אות רגישה במשותף עם דאפי אות. ב כמה גרעינים, אדו אות מכסה כל הכרומוזומים, ואילו בגרעינים אחרים אדו האות. רגישה ל 1-2 puncta בהיר (איור 4). Puncta אלה הם ככל הנראה שמושרש, המשכפל בשלהי S-שלב13.

. הנה, בעלי החיים היו נמאס אדו ברציפות במשך 30 דקות, גזור, כמתואר לעיל, באיור5. דוגמה אחת של עידו מצליח להכתים חיה למבוגרים צעירים, דוגמה אחת של עידו לא מוצלח מכתים של החיים הבוגר בוגרים (ראו להלן) מוצגים באיור4. עידו אות מ 30 דקות תיוג רגישה לחצי של הגרעינים באזור קדמון (המוגדר על-ידי-WAPL-1 נוגדן תיוג אבל לקרב את ערכיהן מאת דאפי מורפולוגיה26,27,28). אינדקס S-פאזי, היחס של אזור קדמון זה עידו חיובית, היה שדווחה בעבר 57 ±5%, גבוה כמו 70% בוגרים צעירים1,2,3. אינדקס M-שלב הוא כ 2-3%1,29. ב רציף מאכילה במשך 4 שעות או יותר, כל הגרעינים בתווית אזור קדמון עם עידו ולאחר כמה גרעינים זה שכותרתו באזור קדמון מאז נכנסו meiotic prophase1.

ואילו הטכניקה תעבוד באופן עקבי בבעלי למבוגרים צעירים פראי-סוג, חלק משמעותי של אנדרוגינוסים בן 5 יום ובסיומה (אפילו אלה המכילים זרע) נכשלה תווית 30 דקות הדופק אדו (איור 4E). עם זאת, עם ה 4 אדו האכלה, כמעט כל בעלי החיים האלה תווית. כשל סדיר תווית גנטית חיות נקבה עם פולסים קצרים של עידו היה גם דיווח30. ייתכנו מצבים אחרים בכישלון סדיר לתווית.

ניתן לחשב את משך הזמן של מחזור התא על ידי ביצוע מספר תיוג-אדו ניסויים עם pH3 תיוג בכל אחד מהם. משך הזמן של G2 הוערך על ידי ניתוח האחוזים של גרעינים ב- M-פאזי (pH3 immunoreactive) שהיו אדו חיובית במהלך הזמן (איור 6). גישה זו מעניקה חציון משך הזמן המרבי G2 (איור 3 א). הזמן החציוני היה אינטרפולציה, מראה משך G2 משוער של 2.5 h אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים. משך הזמן של G2 + M + G1 הוערך מן האחוז של קדמון כל אזור גרעינים (WAPL-1 immunoreactive) שהיו אדו חיובי (איור 6). השיטה G2 + M + G1 מספק מדד משך הזמן המרבי עבור שלבי המשולב (איור 3B). הפעם האחוזון ה-99 היה אינטרפולציה, מראה משך G2 + M + G1 משוער של 3.4 h אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים. הנתונים מתוך הממצאים באותו שימשו לחישוב ירידת ערך meiotic (גרעינים לכל h). שיעור הוא השיפוע של רגרסיה ליניארית של מספר גרעינים שנכנסו מיוזה (אדו חיובית, חיוביות או שלילית לו-3 WAPL-1) על-פני המשך של התווית אדו (איור 3C). הערכים עבור פראי-סוג 1 בן יום אנדרוגינוסים למבוגרים מוצגות בטבלה מס ' 2.

Figure 1
איור 1: תרשים של C. elegans germline של מחזור התא. (א) מחזור התא של תאי הנבט germline אנדרוגינוס למבוגרים צעירים. המספרים מציינים את אחוז הזמן המושקע בכל שלב של מחזור התא משוער. (B) C. elegans אנדרוגינוסים יש שתי germlines בצורת U (אדום וכחול). Spermatheca מוצג בצהוב, הרחם בפיתוח עוברי מוצג בצבע אפור כהה. קו מקווקו תפוזים מציין איפה בעלי חיים הם גזור כדי הבלטת את germlines. (ג) תרשים של פרש C. elegans germline. דאפי (כחול) הוא צבע DNA המדגישה מורפולוגיה גרעינית. האזור קדמון הדיסטלי (מודגשים באדום בהתבסס על צביעת נוגדן WAPL-1) מכיל תאי גזע mitotically אופניים, ובתאים ותאים בשלב-meiotic S (WAPL-1 גם תוויות בלוטת המין סומאטית גרעינים). התאים בשלב mitotic ו- meiotic S-תווית עם דקה 30 הדופק אדו, מסומנים בירוק. שני תאים בשלב-M תווית עם נוגדן pH3, מוצגים בשחור. התא עצה הדיסטלי (DTC) מספק את ליגנד GLP-1/חריץ כדי לשמור על גורל תאי גזע תאים אלה. כמו התאים להעביר מן ה-DTC, הם מהאזור קדמון והזן meiotic prophase. תאים צהובים הם זרע ב- spermatheca. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: דיאגרמת ון של המעמדות של גרעין האטום. הגרעינים מקובצים לפי הנוכחות ואת היעדר סמנים 3: WAPL-1 מציינת אזור ובתאים (אדום), עידו מציין שלב S תאים (ירוק), pH3 מציין שלב M תאים (כחול). סוגי תאים אלה מזוהות A-G. הערה כי בפראי-סוג אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים לא נמצאו תאים מסוג F, התאים לא שותף תווית עם עידו, pH3 מחוץ המייצר (WAPL-1 חיובית) אזור. בלוטת המין דיסטלי הדיאגרמה שלהלן מציינת דוגמה אחת של A-E, G גרעינים. לקבלת פרטים נוספים, ראה טבלה 1 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מצגת גרפית של מחזור התא משך וקצב נתוני הניסוי ערך meiotic. (א) משך G2 שלב זה אינטרפולציה של pH3 וקטניות אדו משותפת תיוג הבאים משך מגוונות אדו קווים אפורים מציינים percentiles 50, שמידת בשימוש אינטרפולציה חציון ומשכי המרבי G2, המסומנים על ידי חצים. (B) A תא בשלב G2, M או G1 לשלב לא אדו. לפיכך, משך הזמן המרבי שלב G2 + M + G1 יכול להיות מוערך על ידי מדידת משך הזמן המרבי של תווית אדו המניבה תאים אדו-שלילי. משך שלב G2 + M + G1 הוא אינטרפולציה של עידו ו- REC-8 משותפת תיוג בעקבות משך מגוונות אדו פולסים. קו אפור מציין-99 בשימוש ויצירת שינוי משך הזמן המרבי G2 + M + G1, מסומנים בחץ. . זה לא אפשרי לבצע אינטרפולציה משך G2 + M + G1 החציוני. (ג) ירידת ערך meiotic (בתוך הגרעינים לכל ח – ראה בטבלה 2) מחושבת על פי השיפוע של קו הרגרסיה. שים לב כי מכיוון החיתוך חיתוך-y הוא לא אפס, רגרסיה הוא הכרחי עבור חישוב מדויק של שער הכניסה meiotic (ג). . קווי שגיאה מציינות סטיית תקן. דמויות שונה והוא התפרסם בכתב באישור פוקס. et al. 20111. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דוגמה ושנכשלו 30 דקות מכתים אדו. מיקרוסקופ קונפוקלי תמונות של בנות יום 1 (י-ם) בן 5 יום (E-H) אנדרוגינוס בלוטה (לא זרע מרוקנת) אחרי 30 דקות ניסוי תיוג אדו. הקו הלבן מקווקו מסמן את סוף אזור קדמון. הכוכבית מסמן את המיקום של הקצה הדיסטלי. סימוני ירוק אדו מכתים דמיינו ידי לחץ על כימיה (A). תיוג אדו כושל תוצאות ברמה נמוכה רקע מכתים אבל לא בהיר אדו + גרעינים (E). סימנים אדומים WAPL-1 immunofluorescence (B, F). צהוב מציין חפיפה (C, G). סימנים כחולים דאפי מכתים לדנ א (ד, ח). ראשי חץ יחיד להצביע על גרעין עם עידו מכתים לאורך כרומטין. ראשי חץ כפול מצביעים על גרעין עם עידו puncta על זוג אחד בלבד של כרומוזומים. תמונות התקבלו עם יעד X 63. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (ד, ח). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: זרימת עבודה ניסויית. סיכום של פרוטוקול נסיוני לגדול (A), התווית אדו (B), לנתח (C), נוגדנים הכתם (ד), לבצע את תגובת לחץ כדי לצרף צבע אדו (E), כתם DNA (F), תמונה germlines (G), ו לכמת אדו שכותרתו והמוכתמות נוגדן גרעינים (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: דוגמה מוצלחת בתנועת אדו מכתים. מיקרוסקופ קונפוקלי תמונות של בלוטה אנדרוגינוס למבוגרים בן 1 יום לאחר ה 4 הניסוי תיוג אדו. הקו הלבן מקווקו מסמן את סוף אזור קדמון. הכוכבית מסמן את המיקום של הקצה הדיסטלי. מגנטה מסמן immunofluorescence pH3 (א, ג). סימוני ירוק אדו מכתים דמיינו ידי לחץ על כימיה (ב, ג). סימנים אדומים WAPL-1 immunofluorescence (D). צהוב מציין את החפיפה של עידו ו- WAPL-1 (E). סימנים כחולים דאפי מכתים לדנ א (F). ראשי חץ יחיד עולה גרעינים במשותף עם עידו, pH3 תוויות. ראש חץ כפול מסמן pH3 + אדו-גרעין - נדיר תיוג אדו 4 שעות. החצים מסמנים אדו + WAPL-1 - גרעינים אשר נכנסו מיוזה. תמונות התקבלו עם יעד X 63. סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר מוצג (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מרקר: pH3 אדו * WAPL-1 או REC-8 לו-3
פרשנות: מיטוזה S-שלב * אזור קדמון מיוזה
מחלקה: פירוש משולב:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 M-שלב, באזור קדמון, היו בשלב S mitotic בתקופת אדו תווית (שהושלם G2)
B Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 ב- M-שלב, באזור קדמון, לא היו בשלב-S במהלך תווית אדו
C Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 ב לאטמוספרה, באזור קדמון, היו בשלב-S במהלך תווית אדו
D Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 ב לאטמוספרה, באזור קדמון, לא היו בשלב-S במהלך תווית אדו
E Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 מיוזה, היו בשלב-meiotic S בתקופת אדו תווית (כניסה meiotic גרעינים)
F Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 לחזור מיטוזה (נמצאו כמה מוטציות) או חטיבות meiotic (תוך יצירת זרע)
G Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 מיוזה, היו לא בשלב-S במהלך תווית אדו
pH3 סה כ סכום חיובי; כל התאים בשלב-M הסכום הכולל אדו חיובי; כל התאים בשלב-S הסכום הכולל חיובי WAPL-1;  כל התאים באזור קדמון הסכום הכולל חיובי לו-3; כל התאים meiotic prophase

טבלה 1: סוגי גרעינים. * הערה 30 דקות ו- 4 h ניסויים אדו נבדלים פרשנות. במשך זמן אדו ניסויים, תאים סביר התקדמו מעבר שלב S. ראה מבוא ו- 8 שלב משך אדו תיוג לניסוי הרלוונטיים.

חלק מחזור התא הגדרה אופרציונלית חישוב * ערך * *
אזור קדמון גרעינים כל WAPL-1 (או REC-8) חיובית, לו-3 שלילי גרעינים A + B + C + D 231 ± 23 גרעינים
S-שלב הגרעינים הגרעינים אדו חיובי לאחר 30 דקות אדו התווית ואת חיובי WAPL-1 A + C הגרעינים ± 20 133
M-שלב הגרעינים pH3 ואת הגרעינים co-positive WAPL-1 A + B הגרעינים ± 2.3 5.2
אינדקס S-פאזי S-שלב הגרעינים / אזור קדמון גרעינים A + C / A + B + C + D 57% של מחזור התא
אינדקס M-פאזי M-שלב הגרעינים / אזור קדמון גרעינים A + B / A + B + C + D 2% של מחזור התא
תאים כניסה meiotic עידו שכותרתו גרעינים במיוזה E משתנה לפי משך תווית אדו
שער כניסה meiotic הפוסט meiotic גרעינים לכל h של תווית אדו השיפוע של איור 4 C * * * הגרעינים 20.3 לכל h
משך G2 (median) יירוט 50% מ- Figure4A 2.5 h
משך G2 (מקסימום) 99% היירוט של איור 4A 3.5 h
משך G2 + M + G1 (מקסימום) 99% היירוט של איור 4B 3.5 h
משך מחזור התא (median) חציון משך G2 / G2-אינדקס * * * 6.5 h
משך מחזור התא (מקסימום) משך הזמן המרבי G2 / G2-אינדקס * * * 8.1 h

בטבלה 2: חישובי מחזור התא. * האותיות מייצגות את השיעורים של גרעינים המוגדרים ברשימות טבלה 1 באיור 3. חישובים עוברות שינוי מ. פוקס ואח 20111. * * ערכים (± סטיית תקן) עבור אנדרוגינוסים פראי-סוג גדל ב- 20 ° C בגילאי לשלב אמצע-L4 פוסט 24 שעות ביממה. שים לב כי מכיוון החיתוך חיתוך-y הוא לא אפס, רגרסיה הוא הכרחי עבור חישוב מדויק של שער הכניסה meiotic. G2-האינדקס נקבעת על-ידי חיסור אינדקס שלב S, M-פאזי האינדקס וכן משוער G1-אינדקס (2%) מ- 100%, כפי שתואר על ידי פוקס ואח 20111.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנה של חיידקים התווית על-ידי אדו (שלב 1) היא קריטית עבור פרוטוקול זה, ואת הנקודה הראשונה לפתרון. אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים פראי-סוג תווית בצורה אמינה במיוחד ב ה 4 אדו-דופק, שהופך את פקד שימושי עבור כל אצווה חדשה של חיידקים התווית על-ידי אדו. בנוסף, חיידקים התווית על-ידי עידו ללא פגע מזין את המעי (ב בוגרים בעלי חיים או מוטציות פגום מסוים הלוע/מטחנה) תווית עם לחץ על כימיה, מופיעים בהיר מלבני puncta בבטן. טכניקה חלופית עבור תיוג אנדרוגינוסים משתמש "טבילה" ריכוז גבוה (1 מ מ) של אדו3. טכניקה זו מרעיב את החיות משך תיוג, אבל מספק דרך שימושית כדי לעקוף את עשיית התווית על-ידי עידו חיידקים בעת פתרון בעיות קיבוע ולחץ כימיה. אם ניסוי אדו "טבילה" מוצלח בעוד הזנה עידו הוא לא, ואז להכין טרי חיידקים התווית על-ידי אדו. כדי להגיע צפיפות חיידקי מספקת תוך השגת גם תוכן אדו גבוהה, אחד ייתכן שיהיה עליך להתאים את ריכוזי אדו תימידין.

המגבלה העיקרית של טכניקה זו עבור תיוג של S-שלב הוא בצורך להאכיל את התווית על-ידי עידו חיידקים בעלי חיים. בעלי חיים לא יכולים להאכיל (עקב גנוטיפ או שלב) עשוי לא להיות מסומן באמצעות טכניקה זו. ובכל זאת, תחליפי nucleoside הן כיום השיטה היחידה לזיהוי S-שלב הגרעינים ב germline C. elegans , השימוש בהם אינו דורש כי כל transgenes להיות נוכח החיות. בנוסף, לאחר שולבו, אדו שרידים של גרעינים גם יציאה S-שלב, התקדמות דרך מחזור התא, לחלק או להבדיל. האות נחלש בחצי עם כל חלוקת התא. זה הופך את אדו מושלם עבור מעקב אחר ההיסטוריה של התא אפילו דרך כמה חלוקות תאים.

היציבות של עידו עושה ניסויים. צ'ייס הדופק פשוטה; פשוט לשטוף עודף חיידקים אדו מהחיות בסיום הדופק משך הזמן הרצוי, להעביר את החיות חיידקים ללא תווית. עידו נשאר ב- DNA ו נשאר גלוי גם לאחר חלוקות תאים מרובים. עם זאת, הניסויים מוגבלות סוג אחד של תווית S-פאזי (דופק יחיד של עידו). תיוג במשותף עם עידו, BrdU זה מתאפשר בתוך תאים בתרבית של31 אך לא דווחה C. elegans. תיוג משותפת של IdU, CldU משמש יונקים32 אך גם לא דווחה C. elegans.

היתרונות העיקריים של עידו תיוג הם כי השיטה דורשת אין transgenes, עידו יכול להיות מוזן על C. elegans במהלך תרבות קבוע, הכימיה הוא תואם עם טכניקות immunofluorescent אדו נמשכת ב- DNA במשך זמן רב לאחר האכלה יש הפסיקה. תכונות אלה להפוך אדו כלי נהדר ללמוד היבטים רבים של הדינמיקות מחזור התא, תא הנבט.

מחזור התא וניתוח dynamics תא נבט עם עידו ניתן ליישם מגוון רחב של שאלות המחקר. רק כמה דוגמאות של יישומים נוספים של שיטה זו: כיצד לשנות הדינמיקה של מחזור התא בבעלי חיים עם מחזור התא מוטציות? כיצד משפיעות בתנאים פיזיולוגיים על מחזור התא בתאי גזע, הקצב של תא הנבט כניסתו meiotic prophase, הקצב של ההתקדמות תא הנבט דרך meiotic prophase? כיצד משנה מחזור התא במהלך התפתחות הזחל? כיצד משפיעות הפרעות מסלול איתות מרכזי מחזור התא, בנוסף לשינויים גורל (כגון הפצה חוץ רחמי)? מערכת זו יכול להיות שונה כדי ללמוד מה עושים התאים בתנאים שונים רבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנחנו מודים למרכז מניות של e. coli MG1693; Wormbase; המרכז גנטיקה Caenorhabditis אשר ממומן על ידי נבחרת מוסדות של בריאות של מחקר תשתית בתוכניות Office (P40OD010440) עבור זנים; זאק פינקוס לייעוץ סטטיסטי; פנג Aiping עבור ריאגנטים; לוק שניידר, אנדריאה שרף, סנדיפ קומאר, ג'ון ברנר עבור הדרכה, ייעוץ, תמיכה דיון מועיל; המעבדות קורנפלד, Schedl למשוב על כתב היד הזה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R01 AG02656106A1 כדי KK, R01 GM100756 ל TS], מלגת predoctoral הלאומית למדע [DGE-1143954 ו DGE-1745038 כדי ZK]. מכוני הבריאות הלאומיים וגם הקרן הלאומית למדע היה כל תפקיד בעיצוב של המחקר, איסוף, ניתוח ופרשנות של נתונים, ולא בכתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית בעיה 140 C. elegans אדו S-פאזי מחזור התא Germline meiotic שלב S M-שלב שלב G2
ניתוח מחזור התא <em>C. elegans</em> Germline עם עידו אנלוגי תימידין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter