Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago

Published: September 29, 2018 doi: 10.3791/58363
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2, 2, 2, 2
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para producir una fracción vascular estromal derivadas de tejido adiposo y su aplicación para mejorar las funciones de la rodilla mediante la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes humanos con osteoartritis.

Abstract

La osteoartritis (OA) es uno de los más comunes trastornos debilitantes. Recientemente, se hicieron numerosos intentos para mejorar las funciones de las rodillas utilizando diferentes formas de células madre mesenquimales (MSCs). En Corea, concentrados de médula y cordón de células madre procedentes de sangre han sido aprobadas por la administración de medicamentos (KFDA) Coreano para regeneración de cartílago. Además, se ha permitido una derivados del tejido adiposo stromal vascular fracción (SVF) por la KFDA para inyecciones conjuntas en pacientes humanos. SVF autóloga derivadas de tejido adiposo contiene matriz extracelular (ECM) además de las células madre mesenquimales. ECM excreta diferentes citoquinas que, junto con el ácido hialurónico (ah) y plasma rico en plaquetas (PRP) activado por el cloruro de calcio, pueden ayudar a MSCs para regenerar el cartílago y mejorar las funciones de la rodilla. En este artículo, presentamos un protocolo para mejorar las funciones de la rodilla mediante la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes humanos con OA. El resultado del protocolo primero fue divulgado en 2011 seguido por algunas publicaciones adicionales. El protocolo consiste en la liposucción para obtener lipoaspirates autólogo que se mezclan con colagenasa. Esta mezcla de lipoaspirates-colagenasa es luego y homogeneizada para quitar tejido fibroso grandes que puede obstruir la aguja durante la inyección. Luego, la mezcla se incuba para obtener SVF derivadas de tejido adiposo. El SVF resultante derivadas de tejido adiposo, que contienen derivados del tejido adiposo MSCs y restos de ECM, se inyecta en las rodillas de los pacientes, combinados con HA y cloruro de calcio activado PRP. Incluyen tres casos de pacientes que fueron tratados con el protocolo dando por resultado la mejora del dolor de la rodilla, hinchazón y rango de movimiento junto con evidencia de MRI de tejido similar al cartílago hialino.

Introduction

Las células madre mesenquimales (MSCs) se sabe que tienen la capacidad de regenerar cartílago1,2,3,4,5,6. Pueden ser fácilmente obtenidos de diversas fuentes: médula ósea, sangre del cordón umbilical y tejido adiposo entre muchos otros. Entre estas fuentes, el tejido adiposo es la única fuente donde se puede obtener un número suficiente de MSCs sin cualquier expansión de la cultura para la regeneración de cartílago en ajustes clínicos7,8. Fracción vascular estromal de médula ósea autóloga (SVF) puede obtenerse fácilmente así. Sin embargo, el número de células madre contenidas en la médula ampliada de cultura no es muy bajo7,8. Sangre del cordón umbilical puede contener un número suficiente de MSCs. Sin embargo, la sangre del cordón no es una fuente fácilmente disponible de SVF autólogo.

Existen numerosos métodos de procesamiento de tejido adiposo para obtener SVF para aplicaciones clínicas. Entre estos, el método de obtención de MSCs del tejido adiposo con colagenasa, desarrollado y confirmado por Zuk et al. 5 , 6, es muy bien aceptada. Este método de uso de colagenasa se ha modificado para usos clínicos en ortopedia. Para ser aplicado a contextos clínicos, el sistema debe ser un sistema cerrado para mantener la esterilidad, manteniendo la comodidad. Una modificación particular presentada en este artículo implica la homogeneización de la lipoaspirates. Lipoaspirates de tamaño pequeño son digeridos relativamente más rápido que los más grandes que están resultando en un desgaste irregular del tejido adiposo. Además, estos lipoaspirates de tamaño más grandes puede producir tejidos fibrosos que pueden obstruir las jeringas y agujas al realizar inyecciones conjuntas9,10. Para evitar estos problemas, el lipoaspirates puede ser homogeneizada mediante corte y trituración de la lipoaspirates antes de la incubación con colagenasa. El SVF resultante derivadas de tejido adiposo puede contener más uniforme matriz extracelular (ECM) en comparación con lipoaspirates que no están homogeneizadas11. El ECM averiado en el SVF puede funcionar como un andamio de12.

En 2009, SVF autóloga derivadas de tejido adiposo se ha permitido por la administración de drogas (KFDA) cuando se procesa dentro de un centro médico con un mínimo tratamiento por un médico13Coreano. Luego, SVF autóloga derivadas de tejido adiposo ha sido utilizado como un agente potencial para mejorar las funciones de la rodilla en pacientes de osteoartritis (OA) potencialmente regenerando tejido similar a cartílago10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

En 2011, Pak demostró por primera vez que el tejido adiposo células madre derivadas (ASCs) contenidas en el SVF derivadas de tejido adiposo puede mejorar funciones de rodilla potencialmente regenerar tejido similar a cartílago en pacientes humanos de OA cuando se inyecta con rico en plaquetas plasma (PRP) 14. Además, Pak et al han informado datos de seguridad en 2013 con 91 pacientes. La tasa de eficacia media en estos datos de seguridad fue 67%15. Posteriormente, estudios adicionales por Pak et al demostraron rodilla mejora funciones potencialmente debido a la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes con un menisco lagrimal y condromalacia de la rótula10,16,17 ,18. Basado en artículos registrados, se sabe que el número de células madre contenidas en 100 g de tejido adiposo por el protocolo presentado en este artículo puede variar desde 40,000,000 de 1.000.000 dependiendo de las características de pacientes8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Aquí, presentamos un protocolo clínico de OA de la rodilla humana utilizando SVF autóloga derivadas de tejido adiposo con HA y PRP activado con cloruro de calcio. La primera versión de este protocolo clínico, que implica un sistema cerrado, manual para mantener la esterilidad, se reportó en 201114. El protocolo idéntico fue optimizado, mantenimiento de esterilidad y fue reportado en 2013 y 201610,15. Aquí, se presenta el protocolo optimizado. La descripción esquemática del Protocolo se presenta en la figura 1.

Figure 1
Figura 1: Descripción esquemática del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

La aprobación y consentimiento para informar después de informes del caso fueron renunciados por el Comité de la Junta de revisión institucional de la Universidad de Myongji (MJUIRB). Además, este protocolo clínico estaba cumpliendo con las directrices de la declaración de Helsinki y la regulación de la KFDA. Para los procedimientos de los pacientes se obtuvieron Consentimientos informados.

1. la liposucción

Nota: Realizar con técnica estéril.

  1. Utilice los siguientes criterios de inclusión: (1) evidencia de MRI de la etapa 3 OA; (2) varón o hembra; (3) mayores de 18 años de edad; (4) el tejido adiposo (100-110 g) suficiente para la liposucción; (5) falta de voluntad para proceder con la intervención quirúrgica; (6) fracaso de tratamiento conservador; y el dolor incapacitante permanente (7).
  2. Utilice los siguientes criterios de exclusión: (1) enfermedad inflamatoria o tejido conectivo activa cree que afectan la condición de dolor (es decir,lupus, artritis reumatoide, fibromialgia); (2) trastorno endocrino activo que pueda impactar la condición de dolor (es decir, hipotiroidismo, diabetes); (3) trastorno neurológico activo que pueda impactar la condición de dolor (es decir, neuropatía periférica, esclerosis múltiple); (4) enfermedad pulmonar activa que requiere el uso de fármacos; y (5) sin antecedentes de inyecciones esteroides común pasados 3 meses.
  3. Poner al paciente en un quirófano con una capucha de biohazard clase A y él (o ella) en una posición supina.
  4. Limpiar la zona abdominal del paciente con 5% betadine (povidona yodada) y cubra al paciente usando la técnica estéril, exponiendo el área limpiada del abdomen para la liposucción.
  5. Aproximadamente 5 cm infero-lateral del ombligo, anestesiar dos sitios (uno a la izquierda y el otro a la derecha del ombligo) de la incisión para-ser-con una aguja (25 calibre, 1½ pulgadas) en una jeringa de 5 mL con 2 mL de lidocaína al 2% sin epinefrina mediante la inyección de cada sitio a nivel epidérmico.
  6. Anestesiar el sitio de la incisión para-ser-usando 5 mL de solución tumescente (de normal salina, 40 mL de lidocaína al 2%, 20 mL de bupivacaína 0.5%, 0.5 mL de epinefrina 1: 1000 500 mL) en jeringa de 10 mL con una aguja (calibre 25, 1½ pulgadas).
  7. Hacen 2 incisiones de 0,5 cm aproximadamente 5 cm debajo del ombligo lateralmente pellizcando la piel para aumentar la profundidad del nivel subcutáneo.
  8. Usando la cuchilla no. 11, empujar la piel levantada para atravesar el nivel subcutáneo pero no penetran a través de la pared abdominal.
  9. Mediante el uso de cánula de calibre 16 de 20 cm, anestesiar el nivel subcutáneo de la zona de abdomen entero inferior, que es a-ser-operada, con 700 a 800 mL de la solución tumescente.
  10. Después de acabado infiltración de todo bajo vientre con la solución tumescente, preparar un aparato de liposucción mediante la conexión de una cánula de 3,0 mm conectada a la jeringuilla de 60 mL (o 30 mL) para la liposucción manual o una cánula especialmente diseñada de 3.0m m conectado a un kit de la centrifugadora, una jeringa de sistema cerrado con el fin de mantener la esterilidad, conectado a una máquina del vacío para la liposucción asistida por vacío.
  11. Realizar la liposucción para obtener 100-110 g de tejido adiposo excepto solución tumescente. Cuando se realiza la liposucción, se obtiene tejido adiposo junto con la solución tumescente, que debe ser separada y eliminada.
  12. Para separar la solución tumescente, primero por gravedad, transferencia de tejido adiposo en el kit de la centrífuga a una jeringa de 60 mL y coloque la jeringa hacia abajo (es decir, que es la porción de la jeringa en la parte inferior). Esperar 5-6 min., se separará el tejido adiposo y el líquido tumescente. Retire el líquido en la parte inferior de la jeringa presionando en la parte superior del émbolo de la jeringa.
  13. Realizar los pasos anteriores 1.9-1.11 hasta que se ha acumulado un total de 100-110 g de tejido adiposo (lipoaspirates) por la rodilla.

2. preparación de mezcla de ASC/ECM con sistema cerrado estéril

  1. Después de separar la solución tumescente por gravedad y acumulando 50-55 g de lipoaspirates por cada kit de 60 mL centrífuga, un sistema cerrado estéril, colocar los kits 2 centrifugadora en una centrifugadora envase cubo y vuelta a 1600 x g durante 5 min, condensación del lipoaspirates y separar el líquido del tejido adiposo. En este proceso de más condensa, la lipoaspirates puede producir aceite graso en ciertos casos.
  2. Ser precavido no debe sacudir, retire el tapón de seguridad y el enchufe en la parte inferior del kit centrífuga.
  3. Retire el líquido de la parte inferior presionando lentamente hacia abajo en la parte superior del émbolo del kit centrífuga.
  4. Jeringa 60 mL separado, disolver 10 mg de colagenasa (5 mg de colagenasa específica para tejido conectivo24 ) y 5 mg de colagenasa específica para tejido adiposo25con 50 mL de solución salina normal.
  5. Mezclar aproximadamente 25-30 mL de lipoaspiración condensada con colagenasa disuelto (5 mg de colagenasa específica para tejido conectivo) y 5 mg de colagenasa específica de tejido adiposo en una proporción de 1:1 (v: v) conectando la jeringa de 60 mL con un kit de centrífuga mediante el uso de un conector especializado.
  6. Mezclar bien la lipoaspiración condensada y la colagenasa, empujando el contenido entre la jeringa de 60 mL y los kits de centrífuga mediante una varilla o un empujador.
  7. Transferir la mezcla de la lipoaspiración y la colagenasa a jeringas de 60 mL.
  8. Conecte cada jeringa de 60 mL que contiene la mezcla con un homogenizador de tejido que contiene las hojas.
  9. Conecte una jeringa de 60 mL vacía al otro extremo de la homogeneizadora.
  10. Empuje la mezcla a la otra jeringa de 60 mL a través del homogeneizador para 4 -6 veces, resultando en el corte y picado de la lipoaspiración.
  11. Transferir la lipoaspiración homogeneizada y la mezcla de la colagenasa a kits de 60 mL centrífuga a través de un conector especializado
  12. Coloque los kits de la centrífuga en un contenedor para ser colocados en una incubadora que ha sido precalentada a 37 ° C.
  13. Incubar los kits de dos centrífugas con la mezcla homogeneizada a 37 ° C durante 40 minutos mientras gira a 45 rpm.
  14. Después de lo 40 min de incubación, retire el recipiente de la incubadora de forma estéril. Luego, retirar los kits de la centrífuga y colocarlos en una máquina de la centrifugadora.
  15. Centrifugar la mezcla a 800 x g durante 5 min separar el SVF derivadas de tejido adiposo.
  16. Después de centrifugar, quitar el sobrenadante (que incluye colagenasa y digiere tejido adiposo) de cada kits centrífuga quitando la tapa de la jeringa en la parte superior del émbolo y colocar una jeringa de 30 mL en el émbolo apertura mediante cerradura de jeringa conexión.
  17. Lentamente Presione hacia abajo la parte del barril de la jeringa de 30 mL de sobrenadante llenar la jeringa de 30 mL.
  18. Presione hacia abajo el cuerpo de la jeringuilla de 30 mL hasta lo últimos 3-4 mL de la parte inferior del kit centrífuga, dejando sólo el último 3-4 mL de SVF derivadas de tejido adiposo. Se descarta el sobrenadante.
  19. Retire la jeringa de 30 mL de la parte superior del émbolo y llenar la jeringa con 5% de dextrosa en solución de Ringer entibiada (D5LR).
  20. Conectando la jeringa de 30 mL llenada de D5LR en la parte superior del émbolo abrir, llenar los kits de centrífuga, 3-4 ml de SVF derivadas de tejido adiposo, con D5LR hasta 55 mL.
  21. Retire la jeringa de 30 mL, tapa el émbolo y centrifugue los kits de centrifugar a 300 x g durante 4 minutos.
  22. Repita los pasos 2.17 2.21 para un total de 4 lavados. La colagenasa utilizada es xenogénica. Por lo tanto, la mayoría de la colagenasa se elimina por 4 lavados. Sin embargo, para la aprobación de la FDA, puesta a punto del Protocolo puede ser necesario eliminar por completo los residuos de colagenasa en el volumen final, aunque el monto actual de los residuos de la colagenasa puede ser lo suficientemente insignificante para los pacientes que no tienen ningún clínico efectos secundarios.
  23. Después de la centrifugación deth 4, para obtener el final SVF para inyección, saque el tapón de seguridad y el tapón en la abertura inferior del kit centrífuga, sin sacudir o girar el kit de la centrifugadora.
  24. Sujetar una jeringa de 20 mL a la base del kit de centrífuga abrir usando un conector especialmente diseñado.
  25. Tire el émbolo de la jeringa varias veces ida y vuelta a las células que se han asentado en la parte inferior del kit de la centrifugadora.
  26. Quitar el volumen total deseado de la SVF que contiene ASCs y ECM junto con otras células y tejidos (generalmente cerca de 3-4 mL de cada kit de centrífuga para inyecciones conjuntas de rodilla).

3. PRP preparado con técnica estéril

  1. Mientras se prepara el ASCs y el ECM, extraer 30 mL de sangre autóloga con 2,5 mL de anticoagulante citrato dextrosa solución.
  2. Transferencia de la sangre dibujada con los kits de centrífuga de 60 mL.
  3. Centrifugar la sangre dibujada a 730 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante en un nuevo kit de centrífuga de 60 mL. Centrifugar el sobrenadante a 1300 x g durante 4 min, dando por resultado en 3-4 mL de PRP.
  4. Justo antes de la inyección, añadir 3% (w/v) cloruro de calcio en una proporción de 10:2 (PRP: cloruro de calcio, v: v) para el PRP para activarlo.
  5. Añadir 0,5% (p/v) HA, como un andamio para el PRP activado con cloruro de calcio. Estos ASC con ECM, junto con PRP, activado por el cloruro de calcio, y HA reposar la mezcla ASC/ECM.

4. ASC/ECM mezcla-tratamiento

  1. Limpiar la rodilla del paciente con clorhexidina 5% y cubra de forma estéril.
  2. Palpar la parte anterior de la rodilla para el espacio articular entre los huesos tibiales y femorales.
  3. Anestesiar el sitio de la inyección superficial con lidocaína diluida (1 mL de lidocaína al 1% diluida con 4 mL de solución salina normal) de la piel a sólo fuera de la cápsula articular.
  4. Anestesiar el interior de la cápsula articular con ropivacaína diluida (ropivacaína de 0.75% de 1 mL diluida con 3 mL de solución salina normal).
  5. Mezcle 2 mL de HA a lo 6-8 mL de SVF contenida en una jeringa de 20 mL a través del conector de la jeringa a jeringa.
  6. Mediante el uso de un conector de jeringa a jeringa, agregar 0,4 mL de cloruro de calcio a lo 3-4 mL de PRP que ya ha sido preparado autólogo y estar preparado en una jeringa de 5 mL.
  7. Se combinan con 8-10 mL de mezcla HA/SVF en un 20 mL jeringa a través de jeringa a jeringa conector 3.5-4.5 mL de cloruro de calcio PRP en una jeringa de 5 mL.
  8. Inmediatamente inyecte lentamente la mezcla (aproximadamente 12-15 mL) en la articulación femoral tibio-femorales anterior de las rodillas con aguja de calibre 18 de 38 mm con o sin la dirección del ultrasonido.
  9. Después de la inyección, venda el sitio de inyección con presión doblando la gasa de algodón 4 x 4 4 veces y colocando cintas sobre la gasa de 4 x 4 doblada.
  10. Instruir al paciente a permanecer todavía durante 60 min permitir el accesorio de la célula.
  11. Instruir al paciente a limitar las actividades para un mínimo de 1 semana tras el alta de la clínica.
  12. Regresar a la clínica de tres inyecciones adicionales de PRP activado por cloruro de calcio durante 3 semanas.

5. después del tratamiento de seguimiento

  1. Evaluar el paciente en la semana del 2, 4 y 16 (18 o 22) para la mejora del dolor en escala visual analógica (VAS) y mejora de la función en términos de parámetros de terapia física. Determinar el índice de clasificación funcional (Vie), VAS y rango de movimiento (ROM) como se describió anteriormente26,27.
  2. Seguir al paciente después del tratamiento RM 3 meses después del tratamiento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tres pacientes (una mujer de 87 años de edad con la etapa 3 OA, un hombre de 68 años de edad con etapa 3 OA, y una mujer de 60 años de edad con etapa 3 OA) sin cualquier pasado significativo historial médico presentó a la clínica con dolor de rodilla persistente y deseado para potencial tratamiento SVF derivadas de tejido adiposo autólogo. Los tres pacientes tenían su rodilla examinada por un cirujano ortopédico y se ofrecieron a reemplazo total de rodilla (TKR) y eran reacios a la cirugía. Antes del procedimiento, los tres pacientes habían recibido múltiples inyecciones de esteroides y HA sin mejoras prolongada.

El paciente femenino Coreano de 87 años de edad, en el momento del examen, se quejó de dolor severo (score VAS de 8; Figura 2A) mientras que el resto. Ella describe el dolor aumentar ([FRI: 37; Figura 2A) al subir y bajar escaleras. En el examen físico, se observaron empalme suave hinchazón con disminución ROM y ternura con la flexión (figura 2B). Sin embargo, se apreció ninguna laxitud de ligamento. Pruebas de McMurray y de Apley eran negativas. Un MRI antes de tratamiento demostró un menisco medial de la disminución del tamaño junto con deformación y maceración. (Figura 2, 2E, 2 Gy 2I).

El segundo paciente, un varón Coreano de 68 años de edad, se quejó de dolor de rodilla izquierda severa (puntuación de VAS: 7; Figura 3A) mientras que el resto. El dolor (FRI: 33; Figura 3A) fue descrito como aumentar al subir y bajar escaleras. En el examen físico, había deformidad suave con leve hinchazón en las articulaciones. ROM (figura 3B) fue disminuida. Además, no se apreció ninguna laxitud de ligamento. Pruebas de McMurray y de Apley eran negativas. Un MRI antes de tratamiento mostró cartílago de adelgazamiento junto con una disminución del tamaño y había deformado el menisco intermedio secundario a la meniscectomy anterior (figura 3, 3E, 3 Gy 3I). El paciente fue diagnosticado a han de la etapa 3 OA.

El tercer paciente, una mujer coreana de 60 años de edad, también informó de dolor (puntaje de VAS: 8; Figura 4A) en el resto. El dolor (FRI: 36; Figura 4A) fue descrito como aumento al caminar. El paciente también tenía hinchazón leve de la rodilla y ROM (Figura 4B). No se apreció ninguna laxitud de ligamento. Pruebas de McMurray y de Apley eran negativas. Un MRI antes de tratamiento demostró disminución de menisco intermedio tamaño con deformación y maceración, y había adelgazamiento del cartílago (figura 4, 4E, 4 Gy 4I).

Plan de tratamiento. Los tres pacientes representativos fueron restringidos de tomar esteroides, aspirina, antiinflamatorios no esteroideos (AINES) y medicamentos herbales asiáticas por lo menos durante 1 semana antes del procedimiento. Después de tomar estudios de imagen de MRI, lipoaspirates fueron obtenidos y procesados como referencia arriba. Luego, el SVF autóloga derivadas de tejido adiposo que contiene ASCs, ECM, HA y PRP autólogo activado por el cloruro de calcio fueron inyectados a las rodillas en el día 0. No hubo ninguna complicación debido a liposucciones e inyecciones conjuntas. Posteriormente, los pacientes regresaron a la clínica en una semana, luego de 2 semanas y luego de 3 semanas para inyecciones adicionales de HA y autólogo PRP activado con cloruro de calcio.

Resultado. Después de la segunda semana de la inyección de mezcla ASC/ECM, el dolor y ROM del paciente femenino de 87 años de edad mejoraron (figura 2A y 2B). Por la semana 16, dolor y ROM del paciente mejoraron significativamente en más de 70% (figura 2A y 2B). Después del tratamiento MRI después de la semana 16 demostró el mayor espesor de tejido similar al cartílago hialino en el lado medial de la rodilla (Figura 2D, 2F, 2 Hy 2J). Como comparación, la tasa de eficacia promedio fue 67% de los datos usando este protocolo clínico, con 91 pacientes y divulgado en 201315.

Figure 2
Figura 2: resultado de las mediciones de dolor (A) y rango de movimiento (B); y MRI sagital (C-F) y alternativamente vistas T2 coronal (G-J) en la rodilla del paciente caso 1. * indica un hallazgo estadísticamente significativo (p < 0.05). Tratamiento previo las exploraciones de MRI (C: imagen secuencial, 5/20; E: 6/20; G: 10/20; y yo: 11/20) muestran lesiones de cartílago (flechas). Después del tratamiento MRI las exploraciones en 16 semanas (D: 6/20; F: 7/20; H: 10/20; y J: 11/20) indican regeneración de tejido similar al cartílago (flecha) que ha sido reparada por el tratamiento de base de mezcla ASC/ECM. Esta figura ha sido modificada desde el informe anterior de Pak et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dolor y ROM del paciente masculino de 68 años de edad mejoraron después de la segunda semana de la inyección de la mezcla de la ASC/ECM (Figura 3A y 3B). Porla semana 18, su dolor y ROM significativamente mejoraron al 80% (Figura 3A y 3B). Repetido de MRI después de 18semana mostraron un aumento en la altura de tejido similar al cartílago hialino en el lado medial anterior de la rodilla (figura 3D, 3F, 3 H y 3J).

Figure 3
Figura 3 : Resultado de las mediciones de dolor (A) y rango de movimiento (B); y MRI sagital (C-F) y alternativamente vistas T2 coronal (G-J) en la rodilla del paciente caso 2. * indica un hallazgo estadísticamente significativo (p < 0.05). Tratamiento previo las exploraciones de MRI (C: imagen secuencial, 6/20; E: 7/20; G: 13/20; y yo: 14/20) muestran lesiones de cartílago (flechas). Después del tratamiento MRI las exploraciones en 16 semanas (D: 6/20; F: 7/20; H: 13/20; y J: 14/20) indican regeneración de tejido similar al cartílago (flecha) que ha sido reparada por el tratamiento de base de mezcla ASC/ECM. Esta figura ha sido modificada desde el informe anterior de Pak et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dolor y ROM del paciente femenino de 60 años de edad mejoraron aproximadamente un 50% después de la segunda semana de la inyección de mezcla ASC/ECM (Figura 4A y 4B). Por la semana 22nd , el dolor y la ROM mejoraron significativamente más 80% (Figura 4A y 4B). MRI repetido después de la semana 22nd mostró un aumento en la altura del cartílago hialino como tejido en el lado medial de la rodilla (figura 4, 4F, 4 Hy 4J).

Figure 4
Figura 4 : Resultado de las mediciones de dolor (A) y rango de movimiento (B); y MRI sagital (C-F) y alternativamente vistas T2 coronal (G-J) en la rodilla del paciente caso 3. * indica un hallazgo estadísticamente significativo (p < 0.05). Tratamiento previo las exploraciones de MRI (C: imagen secuencial, 4/20; E: 5/20; G: 10/20; y yo: 11/20) muestran lesiones de cartílago (flechas). Después del tratamiento MRI las exploraciones en 16 semanas (D: 4/20; F: 5/20; H: 10/20; y J: 11/20) indican regeneración de tejido similar al cartílago (flecha) que ha sido reparada por el tratamiento de base de mezcla ASC/ECM. Esta figura ha sido modificada desde el informe anterior de Pak et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En 2001, Zuk et al. células madre aisladas del tejido adiposo por romper la matriz de colágeno colagenasa6. Luego, el grupo demostró que estas células madre aisladas del tejido adiposo podría transformar en cartílago y otros tejidos del mesodermo en origen, demostrando que estas células madre eran de origen mesenquimales.

Asimismo, el procedimiento presentado en este artículo es un modificado protocolo para aplicar el método similar a pacientes humanos. La principal modificación del protocolo es la incorporación de sistema cerrado las jeringas en la obtención y procesamiento de la lipoaspirates para reducir al mínimo el contacto con el aire manteniendo la facilidad de realizar el procedimiento. Con esas jeringas de sistema cerrado, el tejido adiposo se obtuvo mediante liposucción. Entonces, los lipoaspirates se mezclaron con colagenasa en las jeringas de sistema cerrado. Luego, la colagenasa fue quitado de la mezcla diluyendo la concentración de colagenasa en las jeringas de sistema cerrado. El resultado final es un estéril SVF derivadas de tejido adiposo obtenido con facilidad del proceso.

Mediante el método similar, Pak demostró en 2011, por primera vez, que SVF autóloga derivadas de tejido adiposo puede utilizarse para tratar a los pacientes OA potencialmente regenerando tejido similar al cartílago. Más tarde, Pak et al. también demostró SVF autóloga derivadas de tejido adiposo puede utilizarse para tratar el desgarro de menisco y condromalacia de la rótula mediante la regeneración de tejido similar a cartílago fibroso y cartílago hialino como tejido, respectivamente. En 2013, Pak et al. reportó un estudio de seguridad con 91 pacientes tratados con SVF autóloga derivadas de tejido adiposo. La eficacia media del estudio reportado fue del 67%, allanando el camino a la posibilidad de aplicar SVF autóloga derivadas de tejido adiposo en general población con cartílago daños.

Uno de los efectos secundarios más comunes reportados por Pak et al. en 2013 el estudio de seguridad fue hinchazón en las articulaciones de la rodilla después del tratamiento, que puede explicarse por la muerte de la célula de vástago de 1), 2) inflamación de los glóbulos rojos contenidos en el PRP, o colagenasa 3) residual que se ha mantenido en el volumen final de SVF derivadas de tejido adiposo. MSCs existen en ECM de tejido adiposo11,12, digerir los lipoaspirates con colagenasa para romper la matriz para arrendar las células madre es un proceso obligatorio de12. Sin embargo, después de romper la matriz para liberar las células madre, la colagenasa residual restante debe totalmente extraerse el volumen final con el fin de evitar cualquier posible inflamación que puede ser producido por la colagenasa residual28. Aunque la colagenasa puede causar inflamación, una cantidad insignificante de colagenasa en el volumen final de SVF derivadas de tejido adiposo puede desencadenar una inflamación articular. Este volumen final de SVF autóloga derivadas de tejido adiposo con una cantidad insignificante de colagenasa se ha utilizado con seguridad durante los últimos años para tratar la OA de las rodillas mediante la regeneración de tejido similar al cartílago.

Recientemente dos métodos no enzimáticos de obtener derivados del tejido adiposo SVF han sido introducidas29,30. Estos métodos utilizan cualquier fuerza o ultrasonido (vibracional) fuerza mecánica, en lugar de colagenasa. En el 2018, D'Ambrosi et al. informó el resultado de tratar cuatro lesiones osteocondrales del astrágalo del tobillo con micro fractura purificado autólogo adiposo tejido que se obtuvo mediante el uso de fuerza mecánica para la descomposición de la matriz29. No se utilizó colagenasa para romper la matriz. Cuatro pacientes fueron tratados con el micro fractura el tejido adiposo (es decir, mecánicamente averiado el tejido adiposo), por su talud29. Estos cuatro pacientes mostraron mejoría clínica seis meses después del procedimiento. Ninguno tuvo complicaciones. Sin embargo, en este estudio29, no había ningún reporte de posible regeneración de cartílago. Otro estudio publicado este año que implican energía vibracional demostró que no era suficiente para aislar células madre30energía vibracional en cierta frecuencia.

Como se muestra arriba, diferentes grupos tienen diferentes protocolos para el uso de un tejido adiposo autólogo para el tratamiento de diversos trastornos articulares degenerativos. El protocolo puede variar desde el tamaño de la cánula utilizada para la liposucción, la cantidad de tejido adiposo utilizado, tipo y cantidad de colagenasa (si existe), método de las inyecciones y así sucesivamente. Puesto que existen de MSCs en ECM de tejido adiposo, el efecto de colagenasa, o método de purificación utilizando las fuerzas mecánicas, puede jugar un papel importante. Sobre todo, la eficacia de la colagenasa puede depender de factores como el tamaño del tejido adiposo, cantidad de tejido adiposo, concentración de colagenasa, tiempo y temperatura de incubación con colagenasa y el proceso de eliminar las sobras colagenasa, que puede causar daño de célula28.

Cabe señalar que colagenasa, ya que es un componente importante de este procedimiento para producir células madre que contiene SVF derivadas de tejido adiposo, puede tener un efecto negativo en el volumen final de SVF derivadas de tejido adiposo. En este procedimiento, colagenasa se mezcla con lipoaspirates condensada, homogeneizado, incuban y luego lavada. A lo largo de este proceso, las células madre están expuestas a la colagenasa, que puede tener un efecto perjudicial sobre la supervivencia de las células madre28. Demasiada concentración o exposición prolongada de la colagenasa puede disminuir la viabilidad de la célula de vástago en el final del volumen28. Además, demasiada cantidad de colagenasa en el volumen final puede causar inflamación de la articulación ya que la colagenasa puede romper la matriz del cartílago de la inyección conjunta28.

Además de los posibles efectos negativos de la colagenasa, la liposucción puede llevar a otras complicaciones potenciales. Para obtener el SVF derivadas de tejido adiposo, la liposucción debe realizarse primero. Realizar liposucciones, como otros procedimientos médicos, lleva pocas posibles complicaciones como irregularidades en el contorno de la piel, seromas, infección, perforación de la pared abdominal, necrosante, fascitis, embolia grasa y embolia pulmonar. Entre estas complicaciones, irregularidades de contorno la piel son un efecto secundario muy común que puede evitarse fácilmente mediante el uso de cánulas pequeñas y evitando liposucciones superficiales31,32. Seromas, que es una colección de líquido seroso en la zona de aspirado, también puede ser consecuencia de la agresiva liposucción33. Otras posibles complicaciones como infección, fascitis necrotizante, perforación de las paredes abdominales embolia grasa y embolia pulmonar son todos posibles. Sin embargo, estas complicaciones pueden prevenirse también mediante el uso de técnicas estériles estrictas y mejorando el cumplimiento del paciente34.

Además, los tres pacientes incluidos en el estudio que presentó inicialmente con un derrame leve, un signo claro de sinovitis. Después del tratamiento con derivados del tejido adiposo SVF, todos estos pacientes conjuntos mejora la hinchazón. Por esta razón, también es razonable asumir que la mejora de los síntomas clínicos es no debido a la regeneración de cartílago posible, sino por el contrario, debido al efecto antiinflamatorio y modulador de las células madre y PRP en la membrana sinovial35 , 36. por otra parte, la mejoría de los síntomas puede ser contribuyó a efecto modulador y anti-inflamatorio de las células madre y PRP en la membrana sinovial junto con la posible regeneración de tejido similar al cartílago. Aunque más investigación es necesaria para delimitar el verdadero mecanismo de la mejoría de los síntomas, esta inyección percutánea intra-articular de la terapia celular en forma de autólogo, homogeneizada SVF derivadas de tejido adiposo con PRP autólogo activado con cloruro de calcio y/o HA pueden ofrecer un tratamiento alternativo a la estrategia actual de tratamiento de la rodilla OA.

En cuanto a la adición de PRP autólogo se refiere, que es ampliamente aceptado que PRP contiene varios factores de crecimiento y factores diferenciadores para inyección MSCs para crecer y diferenciar37,38,39. PRP también ha demostrado para tener una colagenasa neutralizar efectos40. Con respecto a la adición de ácido hialurónico (HA), HA ha demostrado tener un papel potencial como material de andamios, debido a su alta afinidad al tejido de cartílago y un papel potencial para ayudar a las células madre en penetrar en el cartílago matriz41.

Como más nuevos procesos de obtención de derivados del tejido adiposo SVF están disponibles, una optimización de un método de procesamiento de lipoaspirates es necesaria estandarizar el proceso. Sin embargo, esto puede ser una tarea difícil debido al número de posibles variaciones en el proceso de obtención y procesamiento de SVF autóloga derivadas de tejido adiposo. Por ejemplo, las diferencias en la textura del tejido adiposo subcutáneo de cada paciente, debido al envejecimiento o el grado de obesidad, pueden tener diferentes respuestas a las actividades de la colagenasa, resultando en un diverso número de ASC en el adiposo autólogo derivados de tejido SVF42. Además, el número de células en cada gramo de tejido adiposo puede diferir de un paciente a otro como muestra de la gran variación de números celulares reportados en publicaciones numerosas de7,19,20, 21 , 22 , 23.

Este protocolo presentada en este artículo es un procedimiento novedoso, innovador, tratar de mejorar la estrategia actual de tratamiento de la OA de la rodilla humana potencialmente regenerando tejido cartílago-como con las inyecciones percutáneas de autólogas derivadas de tejido adiposo SVF. El uso correcto de la colagenasa es un paso importante y fundamental en el presente Protocolo. Utilizando cerrado sistema jeringas para mantener la esterilidad, mientras que mantener la conveniencia de realizar el procedimiento es la modificación importante del protocolo desarrollado por Zuk et al. 5 además, para el uso humano, la cantidad residual de colagenasa en el SVF final derivados del tejido adiposo debe ser insignificante para evitar cualquier inflamación articular. Hay limitaciones de este protocolo: los residuos de colagenasa en el volumen final (aunque esto puede ser despreciable), no hay control de grupos que solo inyección PRP y HA, sin biopsias, ninguna evidencia, excepto la mejora de síntomas clínicos debido a PRP, el pequeño número de pacientes (estudio piloto), no desafiando los componentes de la SVF derivadas de tejido adiposo y no hay especificación del número de células en cada uno de los 3 pacientes. Aplicar derivadas de tejido adiposo SVF para trastornos como un desgarro de menisco, condromalacia de la rótula, los trastornos de disco intervertebral, una cicatrización (o no) del hueso fractura no cura la úlcera de piel, reconstrucción de la mama, y otros trastornos médicos pueden mejorar el resultado clínico. Aunque son posibles aplicaciones clínicas de la SVF derivadas de tejido adiposo, investigaciones clínicas más profundos y vigorosos son necesarios para incorporar SVF derivadas de tejido adiposo en contextos clínicos reales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El autor reconoce el apoyo del personal de la clínica médica Mipro y el diseño de la figura de Jaepil/David Lee. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la bioenergía y programa de desarrollo de tecnología médica de la NRF financiada por MSIT número NRF-2017M3A9E4078014; y el nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y TIC (números NRF-2017R1A2B4002315 y NRF-2016R1C1B2010308).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
5% Betadine (povidone-iodine)  Firson Co., Ltd. 657400260
2% Lidocaine  Daehan Pharmaceutical Co. 670603480
Tumescent solution  Myungmoon Pharm. Co. Ltd. N01BB01 The solution was composed of 500 mL normal saline, 40 mL 2% lidocaine, 20 mL 0.5% marcaine, and 0.5 mL epinephrine 1:1000.
Liberase TL and TM research grade  Roche Applied Science 5401020001
D5LR Dahan Pharm. Co., Ltd. 645101072 Dextrose 5% in lactated Ringer's solution 
Anticoagulant citrate dextrose solution  Fenwal, Inc. NDC:0942-0641 The solution was composed of 0.8% citric acid,
0.22% sodium citrate, and 0.223% dextrose.
3% (w/v) Calcium chloride  Choongwae Pharmaceutical Co. 644902101
0.5% (w/v) HA (Hyaluronic acid ) Dongkwang pharm. Co., Ltd. 645902030
0.25% Ropivacaine Huons Co., Ltd. 670600150
Equipment
3.0 mm Cannula  WOOJU Medical Instruments Co. ML30200
60-mL Luer-Lock syringe BD (Becton Dickinson)  309653
Centrifuge Barrel Kit  CPL Co., Ltd. 30-0827044
Tissue homogenizer that contains blades CPL Co., Ltd. 30-0827045
Rotating incubator mixer Medikan Co., Ltd MS02060092
Centrifuge Hanil Scientific Inc. CE1133
Magnetic Resonance Imaging Philips Medical Systems Inc. 18068
Ultrasound Imaging System Samsung Medison co., Ltd CT-LK-V10-ICM-09.05.2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnoczky, S. P. Building a meniscus. Biologic considerations. Clinical Orthopaedics and Related Research. (367 Suppl), S244-S253 (1999).
  2. Barry, F. P. Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Foundation Symposium. 249, 86-241 (2003).
  3. Usuelli, F. G., et al. Adipose-derived stem cells in orthopaedic pathologies. British Medical Bulletin. 124 (1), 31-54 (2017).
  4. Zhang, H. N., Li, L., Leng, P., Wang, Y. Z., Lv, C. Y. Uninduced adipose-derived stem cells repair the defect of full-thickness hyaline cartilage. Chinese Journal of Traumatology. 12 (2), 92-97 (2009).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  8. Zhu, Y., et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochemistry and Function. 26 (6), 664-675 (2008).
  9. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  10. Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of Cartilage in Human Knee Osteoarthritis with Autologous Adipose Tissue-Derived Stem Cells and Autologous Extracellular Matrix. BioResearch Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
  11. Alexander, R. W. Understanding Adipose-derived Stromal Vascular Fraction (AD-SVF) Cell Biology and Use on the Basis of Cellular, Chemical, Structural and Paracrine Components: A Concise Review. Journal of Prolotherapy. 4, e855-e869 (2012).
  12. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  13. Korean Food and Drug Administration (KFDA). Cell therapy: Rules and Regulations. KFDA. , (2009).
  14. Pak, J. Regeneration of human bones in hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with autologous adipose-tissue-derived stem cells: a case series. Journal of Medical Case Reports. 5, 296 (2011).
  15. Pak, J., Chang, J. J., Lee, J. H., Lee, S. H. Safety reporting on implantation of autologous adipose tissue-derived stem cells with platelet-rich plasma into human articular joints. BMC Musculoskeletal Disorders. 14, 337 (2013).
  16. Pak, J., Lee, J. H., Kartolo, W. A., Lee, S. H. Cartilage Regeneration in Human with Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Current Status in Clinical Implications. BioMed Research International. 2016, 4702674 (2016).
  17. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. A novel biological approach to treat chondromalacia patellae. PLoS One. 8 (5), e64569 (2013).
  18. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. BioMed Research International. 2014, 436029 (2014).
  19. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  20. De Ugarte, D. A., et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs. 174 (3), 101-109 (2003).
  21. Guilak, F., et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells. Journal of Cellular Physiology. 206 (1), 229-237 (2006).
  22. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  23. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  24. Liberase TL information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US (2018).
  25. Liberase TM information available from Sigma Millipore online. , https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/Libtmro?lang=en®ion=US (2018).
  26. Childs, J. D., Piva, S. R. Psychometric properties of the functional rating index in patients with low back pain. European Spine Journal. 14 (10), 1008-1012 (2005).
  27. Price, D. D., McGrath, P. A., Rafii, A., Buckingham, B. The validation of visual analogue scales as ratio scale measures for chronic and experimental pain. Pain. 17 (1), 45-56 (1983).
  28. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicine. 3 (5), 705-715 (2008).
  29. D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus. Journal of Visualized Experiments. (131), e56395 (2018).
  30. Packer, J. D., Chang, W. T., Dragoo, J. L. The use of vibrational energy to isolate adipose-derived stem cells. Plastic Reconstructive Surgery-Global Open. 6 (1), e1620 (2018).
  31. Hanke, C. W., Bernstein, G., Bullock, S. Safety of tumescent liposuction in 15,336 patients. National survey results. Dermatologic Surgery. 21 (5), 459-462 (1995).
  32. Illouz, Y. G. Complications of liposuction. Clinics in Plastic Surgery. 33 (1), 129-163 (2006).
  33. Dixit, V. V., Wagh, M. S. Unfavourable outcomes of liposuction and their management. Indian Journal of Plastic Surgery. 46 (2), 377-392 (2013).
  34. Lehnhardt, M., et al. Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002. Plastic and Reconstructive Surgery. 121 (6), 396e-403e (2008).
  35. Iyer, S. S., Rojas, M. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (5), 569-581 (2008).
  36. Zhang, J., Middleton, K. K., Fu, F. H., Im, H. J., Wang, J. H. HGF mediates the anti-inflammatory effects of PRP on injured tendons. PLoS One. 8 (6), e67303 (2013).
  37. Li, N. Y., Yuan, R. T., Chen, T., Chen, L. Q., Jin, X. M. Effect of platelet-rich plasma and latissimus dorsi muscle flap on osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone in dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 67 (9), 1850-1858 (2009).
  38. Parsons, P., et al. The biological effect of platelet rich-plasma on the fracture healing process. The Journal of bone and joint surgery. British volume. 91-B, 293 (2009).
  39. Wu, W., Chen, F., Liu, Y., Ma, Q., Mao, T. Autologous injectable tissue-engineered cartilage by using platelet-rich plasma: experimental study in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 65 (10), 1951-1957 (2007).
  40. Cooper, T. W., Eisen, A. Z., Stricklin, G. P., Welgus, H. G. Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2779-2783 (1985).
  41. Uzuki, M., Sawai, T. A. A comparison of the affinity of sodium hyaluronate of various molecular weights for degenerated cartilage: a histochemical study using hyaluronic acid binding protein. International Congress Series. 1223, 279-284 (2001).
  42. Pagano, C., et al. Molecular and morphometric description of adipose tissue during weight changes: a quantitative tool for assessment of tissue texture. International Journal of Molecular Medicine. 14 (5), 897-902 (2004).

Tags

Medicina número 139 medicina células madre derivadas de tejido adiposo matriz extracelular regeneración del cartílago humano artrosis medicina regenerativa células madre mesenquimales
Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J.,… More

Pak, J., Lee, J. H., Pak, N. J., Park, K. S., Jeon, J. H., Jeong, B. C., Lee, S. H. Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (139), e58363, doi:10.3791/58363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter