Summary
Descrevemos o protocolo detalhado para projeto, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para um rack de acordeão de DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6.
Abstract
Sistemas mecânicos baseados em nanostructure de DNA ou DNA nanomáquinas, que produzem movimento complexo nanoescala em 2D e 3D no nanômetro a resolução ångström, mostram grande potencial em vários campos da nanotecnologia como os reactores moleculares, administração de medicamentos, e sistemas de nanoplasmonic. O rack acordeão reconfigurável de DNA, que coletivamente pode manipular a uma rede de nanoescala 2D ou 3D de elementos, em múltiplos estágios em resposta às entradas do DNA, é descrito. A plataforma tem potencial para aumentar o número de elementos que DNA nanomáquinas podem controlar a partir de alguns elementos para uma escala de rede com múltiplos estágios de reconfiguração.
Este protocolo, descreveremos todo o processo experimental do rack acordeão DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6. O protocolo inclui um procedimento de regra e simulação de projeto de estruturas e uma experiência de molhado-laboratório de síntese e reconfiguração. Além disso, a análise de estrutura de temperatura (microscopia eletrônica de transmissão) e FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) está incluído no protocolo. Os métodos de projeto e simulação romance cobertos neste protocolo ajudará pesquisadores a utilizar o cesto de acordeão de DNA para novas aplicações.
Introduction
Sistemas mecânicos baseados em nanoestruturas de DNA ou ADN nanomáquinas1,2,3,4,5 são exclusivos porque eles produzem movimento complexo nanoescala em 2D e 3D no nanômetros para Ångström-resolução, de acordo com vários biomolecular estímulos2,3,6. Anexar materiais funcionais sobre estas estruturas e controlando as suas posições, estas estruturas podem ser aplicadas a diversas áreas. Por exemplo, as nanomáquinas de DNA têm sido propostas para um reator molecular7, droga entrega8e nanoplasmonic sistemas9,10.
Anteriormente, nós introduzimos o rack acordeão reconfigurável de DNA, que pode manipular a uma rede de nanoescala 2D ou 3D de elementos11 (figura 1A). Ao contrário de outras DNA nanomáquinas que apenas alguns elementos de controle, a plataforma pode coletivamente manipular periodicamente matriz elementos 2D ou 3D em várias fases. Nós antecipamos que uma rede programável reação química e biológica ou um sistema de computação molecular pode ser construído de nosso sistema, aumentando o número de elementos controláveis. O rack de acordeão de DNA é uma estrutura, em que a rede de múltiplos feixes de ADN está ligada a articulações compostas de DNA de cadeia simples (figura 1B). O acordeão rack gerado por vigas do DNA é reconfigurado pelos bloqueios de DNA, que hibridizam à parte pegajosa de vigas e alterar o ângulo entre os feixes de acordo com o comprimento da ponte parte dos bloqueios (estado bloqueado). Além disso, várias etapa reconfiguração é demonstrada adicionando novas fechaduras após a formação do estado livre removendo bloqueios de DNA através da vertente baseada no ponto de apoio deslocamento12,13.
Neste protocolo, descrevemos o todo processo de design e síntese do rack acordeão DNA reconfigurável. O protocolo inclui design, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para a síntese de rack acordeão DNA de 6 por 6 malhas e uma reconfiguração desses. A estrutura coberta no protocolo é o modelo básico da pesquisa anterior11 e 65 nm em 65 nm de tamanho, constituído por 14 vigas. Em termos de projeto e simulação, o projeto estrutural do acordeão rack é diferente do convencional ADN origami14,15 (ou seja, hermeticamente embalados). Portanto, a regra de projeto e simulação molecular foram modificados dos métodos tradicionais. Para demonstrar, mostramos a técnica de desenho usando a abordagem modificada de circunflexo14 e a simulação do acordeão rack usando oxDNA16,17 com scripts adicionais. Finalmente, os dois protocolos de temperatura e FRET para análise de estruturas de cremalheira acordeão configurados são descritos.
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Protocol
1. projeto do 6 por 6 DNA acordeão Rack com circunflexo14
- Baixe e instale o circunflexo 2.0 software14 para projetar um rack de acordeão de DNA (circunflexo 2.5 também está disponível em https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Abra o circunflexo14 e clique na Ferramenta de Praça para adicionar uma nova parte com uma malha quadrada.
- O número de cada feixe do acordeão rack e desenhar no painel esquerdo da estrutura do circunflexo14 (Figura 2).
- Clique na ferramenta lápis e desenhar cada feixe no painel Editar direito sobre o circunflexo14. Pausa feixes cada 32 bp, que é para articulações entre vigas adjacentes. Coloque o grampos cruzamentos na mesma posição que as articulações. Use a Ferramenta lápis e a Ferramenta inserir no circunflexo14 deixar as articulações ter adicionais single-stranded cruzamentos.
- Clique na Ferramenta lápis e conectar as articulações. Cada feixe tem sete articulações.
- Gere os cruzamentos de andaime para mesclar os andaimes para o único loop usando o andaime relatado anteriormente roteamento algoritmo11. Não deixe que o domínio de ligação mínima entre vertentes andaime e grampo ser menor que 8 bp (Figura 3).
- Coloque os andaimes que não são usados na montagem nos vértices localizados em lados opostos do acordeão rack, conforme mostrado na Figura 3.
- Clique a quebrar a ferramenta. Quebre os fios de fibras descontínuas aonde circular ou mais de 60 bp.
- Desenha a bloqueio de DNA.
- Clique a quebrar a ferramenta. Pausa 8 bp de uma região de DNA descontínuas para fazer uma parte pegajosa e excluir 8 bp de uma região de DNA descontínuas. Existem 18 partes pegajosas (Figura 1) no rack acordeão 6 por 6.
- Coloque sequências que são inversa complementar às partes pegajosas em ambas as extremidades de fechamento cordões e conectá-los por uma região de ponte, que consiste de cadeias de poli T do comprimento desejado (figura 1B).
- Para a reconfiguração, adicionar 8 bp de sequências de ponto de apoio no final do DNA bloqueia para deslocamento de vertente. A sequência de suporte usada é na tabela 2.
- Prepare-se fios de poli A que são reverse complementar à região da ponte.
- Vertentes do projeto que são reverse complementares para as fechaduras de DNA para o experimento de reconfiguração.
- Clique na Ferramenta de sequência e clique em DNA de andaime. Escolha o cadafalso como padrão M13mp18. Clique na Ferramenta de exportação e salvar a sequência no formato csv (tabela 1).
2. simular a estrutura com o oxDNA
- Baixe e instale o oxDNA16,17. O código-fonte mais recente está disponível em https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.
- Fazer arquivos de configuração inicial do arquivo de14 circunflexo usando python script 'cadnano_interface.py', que é fornecido no pacote oxDNA16,17 . O uso é a seguinte: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. O arquivo de topologia e o arquivo de configuração agora são gerados.
Nota: O arquivo de topologia inclui quantos fios e nucleotídeos são na estrutura e informações sobre ligações de backbone-espinha dorsal entre nucleotídeos. O arquivo de configuração inclui informações gerais tais como temporais, energia e tamanho da caixa. Informações de orientação como vector de posição, espinha dorsal da base vetorial, vetor normal, velocidade e velocidade angular de nucleotídeos são também incluída (Figura 4). - Altere as informações no arquivo de configuração e topologia de circunflexo14 para fazê-los refletir as informações estruturais reais do acordeão rack. Todas as vigas são arranjadas em paralelo quando os arquivos de topologia e configuração do circunflexo14 são visualizados. No entanto, o acordeão rack é uma estrutura de treliça assim a distância entre nucleotídeos ligados são longe para simulação (Figura 5).
- Girar e mover cada feixe para a estrutura da estrutura desejada. As nove colunas à esquerda no arquivo de configuração são o vector de posição, espinha dorsal da base vetorial e vetor normal (Figura 4). Para girar um feixe, todos de posição, gire vetores base de espinha dorsal e normais, usando a transformação de rotação. Em seguida, mova um feixe alterando o vector de posição para localizá-lo, como mostrado na Figura 5.
- Relaxe a estrutura usando o script fornecido no pacote oxDNA (ver exemplo em $oxDNA/exemplos/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION para mais informações).
- Execute a simulação de dinâmica molecular para 10 milhões passos usando o arquivo de configuração relaxados. O uso é a seguinte: '. / oxDNA < entrada >' salvar dados todos os passos de 5000 ou 10000.
- Visualização
Nota: As estruturas foram visualizadas usando cogli.- Baixe e instale a versão mais recente do cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).
- Execute o cogli com os arquivos de configuração e topologia de simulação oxDNA. O uso é a seguinte: '. / cogli1 -t < arquivo de topologia >< arquivo de configuração >'.
- Esconda a caixa pressionando b.
3. síntese da estrutura
Nota: O método de síntese é adaptado do anterior protocolo15,18.
- Compre os grampos de DNA projetados de um provedor do oligonucleotide.
- Ajuste a concentração destes grampos de DNA a 100 μM usando água livre de nuclease.
- Cada cadeia de DNA que constitui uma estrutura de 'free estado' em um tubo do pool e ajustar a concentração de 2 μM para cada vertente.
- Bloqueio de DNA piscina vertentes pelo comprimento e número de sites de bloqueio nos tubos e ajustar a concentração de 2 μM para cada vertente. sites de bloqueio 4, 9 e 18 são usados. Adicione fios de A poli, que são complementares à região ponte na mesma concentração.
- Vertentes de piscina que são inverter complementares ao DNA trancar fios pelo comprimento em tubos e ajustam a concentração de 2 μM para cada vertente.
- Preparar a solução de MgCl2 de 300 nM, misturando 70 μL de água livre de nuclease e 30 µ l da solução de2 1 μM MgCl. Prepare uma solução de EDTA Tris de 5x misturando 95 μL de água livre de nuclease e 5 μL de solução de EDTA Tris de 100x.
- Adicione 2 μL de DNA, 1.1 μL de MgCl2 solução de grampo, 2 μL de solução de EDTA Tris, 7.6 μL de água livre de nuclease e 7.3 μL de DNA de andaime de que a concentração é 110 nM tornar 20 μL de caldo misto. Definir a concentração final de cadafalso DNA de 40 nM, grampear o DNA de 200 nM, MgCl2 a 16 mM e solução de Tris-EDTA a 0,5 x.
- Aqueça rapidamente a solução-mãe misturada em um termociclador a 80 ° C e esfriar a 60 ° C, a uma taxa de 4 min por ° C e frio de 60 ° C a 4 ° C, a uma taxa de 40 min por ° C.
4. purificação da estrutura
Nota: As amostras de todas as estruturas foram purificadas antes da análise. Nesta seção, descrevemos o protocolo de purificação de PEG, que é adaptado a partir de literatura anterior19. A amostra também pode ser purificada por eletroforese em gel, conforme descrito em anterior literatura15,18.
- Prepare-se 5m de NaCl e 100 x Tris-EDTA.
- Prepare o buffer de precipitação misturando 150 μL de PEG 8000, 500 μL de 100 x Tris EDTA e 101 μL de 5 M NaCl e 249 μL de água livre de nuclease.
- Prepare o buffer de destino misturando 5.5 μL de solução de 300 nM MgCl2 da secção 3.3, 10 μL de solução de EDTA Tris x 5 da secção 3.3 e 84.5 μL de água livre de nuclease.
- Mix 20 μL da estrutura sintetizada da seção 3 e 20 μL de tampão-precipitação da seção 4.2. Em seguida, girar o estoque misturado a 16000 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante e dissolver a pelota no buffer de destino da seção 4.3.
5. reconfiguração do acordeão Rack de um estado' livre' para um 'estado bloqueado'
- Sintetiza a estrutura sem bloqueios de DNA para a experiência de configuração.
- Prepare o bloqueio de DNA da seção 3.
- Adicione 2 μL de cadeias de ADN bloqueio do comprimento desejado em 20 μL da estrutura sintetizada. Concentração do bloqueio de DNA é cinco vezes maior do que a estrutura.
- Incubar a amostra de 0, 10, 25, 50 ou 100 minutos para ver como a rápida reconfiguração ocorre.
- Para a incubação de 100 minutos, incubar a amostra a 50 ° C durante 30 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 0,33 ° C/minuto.
- Para a incubação de 50 minutos, incubar a amostra a 50 ° C por 15 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 0,66 ° C/minuto.
- Para a incubação de 25 minutos, incubar a amostra a 50 ° C para 7,5 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 1,32 ° C/minuto.
- Para a incubação de 10 minutos, incubar a amostra a 50 ° C por 3 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 3,3 ° C por minuto.
- Para a incubação de 0 minutos, armazene a amostra à direita de 4 ° C após fechamentos de DNA é adicionadas.
- Logo após a etapa de fixação, esfria rapidamente a amostra a 4 ° C para evitar a desnaturação indesejada.
6. reconfiguração do acordeão Rack de um estado 'bloqueado' para um 'estado livre'
- Sintetiza a estrutura com bloqueios de DNA do comprimento desejado para a experiência de configuração.
- Prepare o reversos costas complementares da seção 3.
- Adicione 2 μL de cordões que são inverter complementares para as vertentes de bloqueio do comprimento desejado em 20 μL da estrutura sintetizada. Concentração do bloqueio de DNA é cinco vezes maior do que a estrutura.
- Incubar a amostra para 0, 12, 60, 120, 240 minutos para ver como a rápida reconfiguração ocorre.
- Para o 12, 60, 120, incubação de 240 minutos, aqueça rapidamente a amostra a 40 ° C e esfriar lentamente até 20 ° C para o tempo correspondente a cada uma. Logo após a etapa de desmontar, esfria rapidamente a amostra a 4 ° C para evitar a desnaturação indesejada.
- Para a incubação de 0 minutos, armazene a amostra à direita de 4 ° C depois reversos costas complementares são adicionadas.
7. TEM imagem
Nota: O protocolo de imagem TEM foi adaptado do anterior literatura18,20.
- Prepare a solução de NaOH 1,25 M misturando 87,5 μL de água livre de nuclease e 12,5 μL de solução de NaOH 10 M.
- Adicione 1 μL de solução de NaOH 1,25 M para 50 μL de solução de formiato de uranilo a 2%.
- Vórtice a solução durante 3 minutos e centrifugar a velocidade máxima durante 3 minutos. Depositar 3 μL da amostra purificada na grelha TEM brilho-alta por 3 minutos e lavar rapidamente com papel de filtro.
- Deposite 7 μL de solução de formiato de uranilo preparado por 30 segundos e lavar rapidamente com papel de filtro.
- Medir o comprimento e o ângulo da estrutura acordeão fotografada pela TEM.
8. FRET análise
- Use Atto 550 e Atto 647N corante, para que a distância de Förster é 6.5 nm. Substitua grampo 58 e 117 de grampo na tabela 1 fluorescente etiquetados cordões. Então, sintetiza a estrutura com vertentes fluorescente rotulados pelo método descrito na seção 3.
- Medir a concentração da amostra purificada.
- Normalize a amostra de 10 μL 50 nM e carga para as 384 microplacas bem.
- Excitar a amostra com doador e aceptor de corantes em 550 nm e medir o espectro de fluorescência de 570 nm para 800 nm com um dados.
- Medir o espectro de fluorescência da amostra somente doador da mesma forma.
- Excitar as tinturas da amostra a 650 nm e o espectro de fluorescência e medida de 670 nm para 800 nm. Isto é para medir a concentração do aceitador.
- Obter os desvios-padrão, repetindo o mesmo experimento com três amostras, que são sintetizados e purificados separadamente.
- Calcule a eficiência do traste com a relação de um método, conforme descrito pela equação abaixo de21.
DA550: intensidade de fluorescência de pico aceitador da amostra com doador e aceptor no 550 excitação nm.
D550: intensidade de fluorescência na faixa de emissão aceitador da amostra do doador somente em 550 excitação nm.
DA650: intensidade de fluorescência de pico aceitador da amostra com doador e aceptor na excitação de nm 650.
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Representative Results
O rack de acordeão de DNA 6 projetado por 6 é simulado a partir do oxDNA16,17 , e os resultados são mostrados na Figura 6. O resultado da simulação, foi confirmado que a estrutura se destina é formada sem distorção da estrutura.
As imagens TEM na Figura 7 são imagens de estruturas configuradas com um comprimento de bloqueio da bp 2, 8, 13 e 20. Na imagem, o ângulo das estruturas (Figura 8A) é diminuído conforme o comprimento do bloqueio torna-se mais tempo. Para analisar estatisticamente a tendência, a média e o desvio-padrão do ângulo (Figura 8A) das várias estruturas configurados foram obtidas (Figura 8B). Além disso, os resultados de medição FRET mostraram mudança estrutural e sua velocidade, além da tendência estrutural mostrado na imagem TEM (Figura 8).
Esses procedimentos de análise, caracterização do rack acordeão DNA como bloqueios quantos são necessários para a configuração estrutural e reconfiguração de velocidade foi determinada.
Figura 1. Um rack de acordeão reconfigurável de DNA. R. cremalheira acordeão o ADN é composta por feixes de DNA rígidas e várias articulações flexíveis que conectam cada feixe. O rack de acordeão está configurado diferentemente de acordo com o comprimento dos bloqueios DNA. Várias plataformas 2D e 3D podem ser projetadas, modificando a plataforma. B. A reconfiguração do rack acordeão DNA é conseguida com a hibridação de DNA bloqueios com comprimentos diferentes. A estrutura de 'estado livre', quando nucleotídeos extras são adicionados ao cruzamentos (ou articulações, amarelas), devido a conexão frouxa entre as vigas de DNA (compreendendo duas hélices), o ângulo pode ser alterado (parte superior). Hibridação dos bloqueios DNA com vários comprimentos da parte da ponte à parte pegajosa de ambos os feixes adjacentes gera o estado 'bloqueado' (parte inferior). Deslocamento de Strand, utilizando os elementos de suporte (azuis) de bloqueios o DNA com a vertente de combustível desanexar os bloqueios de DNA do estado bloqueado da estrutura e alterar o estado para a enciclopédia. Repetindo o processo com várias bibliotecas de bloqueios o DNA, a estrutura é reconfigurada com ângulos diferentes. Este valor foi modificado desde a pesquisa anterior11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. 6 por 6 cremalheira acordeão é projetada usando o circunflexo. Os 14 feixes do rack acordeão DNA são numerados e desenhados no painel de treliça do circunflexo. Este valor foi modificado desde a pesquisa anterior11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Algoritmo de roteamento do andaime. R. andaime que não são utilizados na montagem nos vértices localizados em lados opostos do acordeão rack. B. sete ciclos fechados são fundidos em um único loop através da geração de cruzamentos de andaime. São necessários pelo menos seis pontos de cruzamentos de andaime e a posição de crossovers de andaime é adaptada da literatura anterior. Este valor foi modificado desde a pesquisa anterior11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Exemplo de um arquivo de configuração. O arquivo de configuração inclui informações gerais, tais como as informações de tamanho e orientação temporal, a energia e a caixa. As nove colunas à esquerda no arquivo de configuração são o vector de posição, espinha dorsal da base vetorial e vetor normal, respectivamente. As seis colunas da direita são velocidades e velocidades angulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Visualização do arquivo de configuração antes e depois da modificação. Posição, vetor coluna vertebral-base e normal foi modificada usando a transformação rotacional tornar as informações no arquivo de configuração a refletir as informações estruturais do acordeão rack. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Resultado de simulação de oxDNA. O rack de acordeão com bloqueios de DNA, dos quais os comprimentos são bp 2, 8, 13 e 20, foram simulados. foram utilizados 18 bloqueio de sites. Um rack de 6 por 6 acordeão com um DNA lock do que o comprimento é A 2 bp, B 8 bp, C 13 D 20 e bp bp são simulados evisualizado por cogil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Imagens TEM configurado 6 por 6 prateleiras de acordeão DNA. Estruturas com comprimentos de bloqueio da A 2 bp, B 8 bp, C 13 D 20 e bp bp fosse fotografada. 18 bloqueio sites foram usados para esta experiência. (barra de escala: 100 nm). Este valor foi modificado desde a pesquisa anterior11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. O controle do ângulo do rack acordeão 2D. O ângulo do acordeão rack composto de 6 by-6 malhas era controlado pelo comprimento dos bloqueios DNA. R. adicionando travas de DNA com comprimentos de 2, 8, 13 e 20 bp aos 18 sites travamento do rack acordeão, o ângulo (azul) é configurado como visto nas imagens TEM representante. O par de tintura, Atto647N e Atto550 é fixado à estrutura para a análise de eficiência de traste. (barra de escala: 100 nm) B. A distribuição dos ângulos configurados. A linha de tendência sobrepostas (cinza) é o gráfico do 1 bloqueio por 2 malhas. Além disso, a grade de eixo x corresponde à mesma grade no gráfico do 1 bloqueio por 2 malhas. Barras representam um desvio padrão pelo ângulo médio. C. A distribuição das eficiências de traste. Barras representam um desvio padrão da eficiência média. D. FRET mudança eficiência enquanto o estado de transição de livre para bloqueado ou vice-versa foi medido de acordo com os tempos de incubação diferente. O bloqueio de DNA com o comprimento de 2 bp foi usado. Barras representam um desvio padrão da eficiência média. Este valor foi modificado desde a pesquisa anterior11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Sequência de | Comprimento | |||
| Grampo 1 | ATAAGAGGTCATTTTTGCGGATGGATGTTACT | 32 | |||
| Grampo 2 | CAAAGTTACCAGAAGGAAACCGAGACATCGGG | 32 | |||
| Grampo 3 | ACAATGAAATAGCAATAGCTATCTCAAATAAA | 32 | |||
| Grampo 4 | CGCTAATATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGGAACAAAGTCAGAGGG | 56 | |||
| Grampo 5 | CAGAAAACCCGGAATAGGTGTATCACCGTACTCAGGAGGTCCCCCTCAAATGCTTT | 56 | |||
| Grampo 6 | AGTGAGAATAGAAAGGTATGATATTCAACCGTTCTAGCTGATAAATTATCAACAGT | 56 | |||
| Grampo 7 | ATTTGGGGCGCGAGCTATATGGTT | 24 | |||
| Grampo 8 | GCCTTTATTTCAACGCAAGGATAATTAATGGA | 32 | |||
| Grampo 9 | TCAATTACCCACTACGAAGGCACCGGTAAAAT | 32 | |||
| Grampo 10 | ATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGAAAACAGA | 32 | |||
| Grampo 11 | AGAAACAATAACGGATTCGCCTGATAGCCGAA | 32 | |||
| Grampo 12 | ATCAATATCTGGTCAGTTGGCAAAAGTAACAA | 32 | |||
| Grampo 13 | CGGAGACAGTCAAATCACCATCAAGGGTTAGA | 32 | |||
| Grampo 14 | GAGAATTAACTGAACACGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGAAGCGCA | 56 | |||
| Grampo 15 | CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCATAGGAAC | 32 | |||
| Grampo 16 | CCCTTATTAGCGTTTGCCATCTTTTGGTGCCG | 32 | |||
| Grampo 17 | GTTTTCATCGGCATTTATGCCGGA | 24 | |||
| Grampo 18 | GTAGCAACTTCCAGTAAGCGTCATGTCTCTGA | 32 | |||
| Grampo 19 | AGCTAATGCAGAACGCAATAAACA | 24 | |||
| Grampo 20 | CCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGGCCTATTT | 32 | |||
| Grampo 21 | ACCAGAGCCACCACCGCGAGAGGC | 24 | |||
| Grampo 22 | AGGCTCCAAAAGGAGCCGTTTACCAGACGACGATAAAAACCAAAATAGAAAATCTC | 56 | |||
| Grampo 23 | GCCGGAAGGAAACGCAATAATAACGGAATACCCAAAAGAACTCACAATTCCACACA | 56 | |||
| Grampo 24 | TTTTTCACCGGTGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAACAGTACTAAAGGAATTGCGA | 56 | |||
| Grampo 25 | ATCAGGTCTTTACCCTCGCATTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGACCATA | 56 | |||
| Grampo 26 | TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTGACATTCA | 32 | |||
| Grampo 27 | AATAAAGAAATTGCGTAGATTTTCAGCTGCTC | 32 | |||
| Grampo 28 | CCCAATCCTCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCAAAATAAACAGCCATA | 56 | |||
| Grampo 29 | AAAGACTTCAAATATCATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGATTAAGAG | 56 | |||
| Grampo 30 | GTAGCGACAGAATCAAGTTTGCCTGATTTAGA | 32 | |||
| Grampo 31 | GCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAACAAGAG | 32 | |||
| Grampo 32 | AAGCAAGCCGTTTTTATTTTCATCTCCTGATT | 32 | |||
| Grampo 33 | GAGGGTAGCTATTTTTGAGAGATCCGTCAGAC | 32 | |||
| Grampo 34 | TATGACCCTGTAATACTCCCATCCTAATTTACGAGCATGTAGAAACCAGTTGTACC | 56 | |||
| Grampo 35 | GATTAGAGAGTACCTTAACAGTGCCCGTATAAACAGTTAATGCCCCCTAACTCCAA | 56 | |||
| Grampo 36 | CGTCTTTCCAGACGTTGTAGGAATCATTACCGCGCCCAATAGCAAGCACGATCTAA | 56 | |||
| Grampo 37 | TTTAACGTCAAAAATGAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACAAGAAACG | 56 | |||
| Grampo 38 | TTTAACGGGGTCAGTGCCTTGAGTATAAGGGA | 32 | |||
| Grampo 39 | AATTGTGTGCAAAATCCCTTATAAGGTGGTTC | 32 | |||
| Grampo 40 | ACCAGTAGCACCATTACCATTAGCTTTCAGGG | 32 | |||
| Grampo 41 | AAACATCAAGAAAACAAAATTAATTCACATTA | 32 | |||
| Grampo 42 | TTGGCCTTGATATTCATCATCTTT | 24 | |||
| Grampo 43 | TGCATCAATCAACAGTTGAAAGGAATTGAGGAAGGTTATCATTATAGTCAGAAGCA | 56 | |||
| Grampo 44 | GCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTAGGGGACG | 32 | |||
| Grampo 45 | TCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAAGCAAGAA | 32 | |||
| Grampo 46 | GAGCCTAATTTGCCAGGGGGGTAATAGTAAAATGTTTAGACTGGATAGAACGAGCG | 56 | |||
| Grampo 47 | TAAGAGCAACACTATCATAACCCTTTAACGTC | 32 | |||
| Grampo 48 | ATAGCAAGCCCAATAGGAACCCATGCAAAATC | 32 | |||
| Grampo 49 | CATAAAAACTTAGAGCTTAATTGCTGAATATAATGCTGTATAGCAGCCTTTACAGA | 56 | |||
| Grampo 50 | ATTTACCGGGCTACAGAGGCTTTGGAACGAGG | 32 | |||
| Grampo 51 | GTGCCTAATGAGTGAGAATGCAGATACATAACGCCAAAAGGAATTACGAAGTGTAA | 56 | |||
| Grampo 52 | ATACCGATAGTTGCGCATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTTTCTTAA | 56 | |||
| Grampo 53 | ATAACCGATACCGAAGCCCTTTTTAAGAAAAGTAAGCAGAAATGACAACAACCATC | 56 | |||
| Grampo 54 | TCAGAGCCGCCACCCTCAGAACCGGCTCAACA | 32 | |||
| Grampo 55 | TTTTGCAAAAGAAGTTTTGCCAGAAATCAAAA | 32 | |||
| Grampo 56 | GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAAGAAACC | 32 | |||
| Grampo 57 | ACATGTTCAAAGACACCACGGAATCATATAAA | 32 | |||
| Grampo 58 | CTGTGTGAAATTGTTAGAGTAATGTGTAGGTAAAGATTCAAAAGGGTGTGGTCATA | 56 | |||
| Grampo 59 | TTTCGAGGCCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAATTGTATCGGTTTAT | 56 | |||
| Grampo 60 | CTTTAGGAGCACTAACAACTAATAAGCCCCAA | 32 | |||
| Grampo 61 | AGATTAGTTGCTATTTTACAAAGGCTATCAGGTCATTGCCTGAGAGTCTTGAAGCC | 56 | |||
| Grampo 62 | GAGCCGCCGCCAGCATTGACAGGACTGACCTT | 32 | |||
| Grampo 63 | GAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCTCATAGCC | 32 | |||
| Grampo 64 | CATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACACCACCA | 32 | |||
| Grampo 65 | AACCTTGCTTCTGTAAATCGTCGCTTATCAAC | 32 | |||
| Grampo 66 | TAGTTAGCGACAACTCGTATTAAATCCTTTGCCCGAACGTGTAGCATTCCACAGAC | 56 | |||
| Grampo 67 | ACCGATTGAGGGAGGGAAGGTAAAGGGGGATG | 32 | |||
| Grampo 68 | TACCAGCGCCAAAGACAAAAGGGCGTTTAGCT | 32 | |||
| Grampo 69 | TCATATATTTTAAATGCAATGCCTAAAACGAA | 32 | |||
| Grampo 70 | ACATTATCATTTTGCGTATTGACG | 24 | |||
| Grampo 71 | CGGAACCTATTATTCTGAAACATGCGGATTGA | 32 | |||
| Grampo 72 | CCTGAGAGATATTTTGTTAAAATTTAAATTGT | 32 | |||
| Grampo 73 | GAAACCATCGATAGCAAATCAGAT | 24 | |||
| Grampo 74 | CTCAGAGCCGCCACCATATTGGGC | 24 | |||
| Grampo 75 | CACCGACTTGAGCCATTTGGGAATACACTGAG | 32 | |||
| Grampo 76 | TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGTTTGCGGG | 32 | |||
| Grampo 77 | AAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATAAAATAT | 32 | |||
| Grampo 78 | ATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGAAGACTTTT | 32 | |||
| Grampo 79 | ATCAACATTAAATGTGTTGTTCCA | 24 | |||
| Grampo 80 | TGCAGGGAGTTAAAGGAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTTCGGTCG | 56 | |||
| Grampo 81 | ACGTAATGCTGAGCAAAAGAAGATTATTCATT | 32 | |||
| Grampo 82 | AATCGATGAACGGTAATCGTAAAATTAGTACC | 32 | |||
| Grampo 83 | GACCCCCAGCGATTATACCAAGCGGAGGCAGG | 32 | |||
| Grampo 84 | CGAAATCCGCGACCTGGCCTGATA | 24 | |||
| Grampo 85 | GCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGAGTGCCGT | 32 | |||
| Grampo 86 | TCGGCTGTCTTTCCTTATCATTCCATTACCTT | 32 | |||
| Grampo 87 | CAGACCGGGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGTTTAATTCGAGCTTCA | 56 | |||
| Grampo 88 | GTTTGGAACAAGAGTCCACTATTACCTGTAGC | 32 | |||
| Grampo 89 | AACAGTACATAAATCAATATATGTCGGGAGAA | 32 | |||
| Grampo 90 | GACGTTGGGAAGAAAAATCTACGTCTGGCATG | 32 | |||
| Grampo 91 | CAAAATCGCGCAGAGGCGGGAAAC | 24 | |||
| Grampo 92 | ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTGATGAAAC | 32 | |||
| Grampo 93 | CCCCGGTTGATAATCACGTCCAAT | 24 | |||
| Grampo 94 | ATGCCTGCAGGTCGACAAGAACGGGTATTAAACCAAGTACCGCACTCACCAGTGCC | 56 | |||
| Grampo 95 | GTTTGGATTATACTTCTGAATAATTGATTCCC | 32 | |||
| Grampo 96 | ACCGAACTGACCAACTTTGAAAGATAATAAGT | 32 | |||
| Grampo 97 | GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCCCTCAGAG | 32 | |||
| Grampo 98 | CAGTTGAGATTTAGGAATACCACATACATTTA | 32 | |||
| Grampo 99 | TAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTTCCTTTTG | 32 | |||
| Grampo 100 | AGTATTAGACTTTACAAACAATTCCGTAATCA | 32 | |||
| Grampo 101 | CTTGCGGGAGAACCGCCACCCTCAGAGCCACCACCCTCATGAGGCGTTTTAGCGAA | 56 | |||
| Grampo 102 | TTAAGAACTGGCTCATATCAATAA | 24 | |||
| Grampo 103 | CATACAGGCAAGGCAAAGAATTAGAAGTTTAT | 32 | |||
| Grampo 104 | ATTGAGTTAAGCCCAAACATGGCTTTTGATGATACAGGAGTGTACTGGGAGATAAC | 56 | |||
| Grampo 105 | ATAGAAGGCTTATCCGGTATTCTACGGAAACG | 32 | |||
| Grampo 106 | CTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGATTTGAATA | 32 | |||
| Grampo 107 | CTTACCAAGATTAGAGCCGTCAATAGATAATACATTTGAGCCCAGCTACAATTTTA | 56 | |||
| Grampo 108 | ACCTTGCTGAACCTCAAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCAAGAGAAAAAATCT | 56 | |||
| Grampo 109 | TTTGTCACAATCAATAGAAAATTCCAATAAAT | 32 | |||
| Grampo 110 | CAATTCTATTCAACTTTAATCATTCTTGAGAT | 32 | |||
| Grampo 111 | ACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGAGCTGGTTT | 32 | |||
| Grampo 112 | ACTGCGGAATCGTCATAAATATTCATGTCAAT | 32 | |||
| Grampo 113 | TTTCGTCACCAGTACAAACTACAAATCACCGT | 32 | |||
| Grampo 114 | AATTCTGCGAACGAGTAGATTTAGTCCTGATT | 32 | |||
| Grampo 115 | GAAATTATTCATTAAAGGTGAATTTTTAAAAG | 32 | |||
| Grampo 116 | ACCAGAAGGAGCGGAATTATCATCTCGGTGCG | 32 | |||
| Grampo 117 | AATTCGTAACGAGAAACACCAGAACGAGTAGTAAATTGGGGAGGATCCCCGGGTAC | 56 | |||
| Grampo 118 | ATTAAGACTCCTTATTACGCAGTACCAGTCAG | 32 | |||
| Grampo 119 | GGTTTAATCTAATAGTAGTAGCATGGTGGCAT | 32 | |||
| Grampo 120 | AAACCGTCTTAGCGGGGTTTTGCTCAGTACCAGGCGGATATGGACTCCAACGTCAA | 56 | |||
| Grampo 121 | TATCAAAATTATTTGCAGAAAGGC | 24 | |||
| Grampo 122 | ACAACATTATTACAGGTAGAACCC | 24 | |||
| Grampo 123 | CCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACCCTCA | 32 | |||
| Grampo 124 | ACAATTTCATTTGAATTACCTTTTAGATTCAT | 32 | |||
| Grampo 125 | GCTAAACACATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAAATGAATTTTCTGTAT | 56 | |||
| Grampo 126 | AATAGATAAGTCCTGAACAAGAAAGAGTGAAT | 32 | |||
| Grampo 127 | AAAGCTAATGTTAGCAAACGTAGAAAATACATACATAAAGTTAAGCAATAAAGCCT | 56 | |||
| Grampo 128 | TGTTTTAAATATGCAACTAAAGTACGCCTCCC | 32 | |||
| Grampo 129 | ATACAGTAACAGTACCAGGCATAG | 24 | |||
| Grampo 130 | GTAAAACGTTTGACCATTAGATACATTTCGCAAATGGTCACAGGGTTTTCCCAGTC | 56 | |||
| Grampo 131 | AGTTGCAGCAAGCGGTCGCCTGGC | 24 | |||
| Grampo 132 | ATGGCAATTCATCAATTCGAGAAC | 24 | |||
Tabela 1. Sequência das fibras descontínuas
| Nome | Sequência de |
| Toehold_1 | AGAAGTCG |
| Toehold_2 | AGGTATGG |
| Toehold_3 | CTCCACTC |
| Toehold_4 | GTGTCCGA |
| Toehold_5 | AAGTAGAC |
| Toehold_6 | GAGTCGCT |
| Toehold_7 | AGTGTCTA |
| Toehold_8 | GTATCGTG |
| Toehold_9 | CATCACAG |
| Toehold_10 | CGAGACTT |
| Toehold_11 | ACGGACGA |
| Toehold_12 | GCCTACTC |
| Toehold_13 | GATGTGGA |
| Toehold_14 | GCGTGCGT |
| Toehold_15 | GTGGACAA |
| Toehold_16 | TACGACTG |
| Toehold_17 | CAGCCGTG |
| Toehold_18 | TGCCGCAT |
Tabela 2. Sequência de ponto de apoio para o experimento de deslocamento de vertente
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Discussion
Este protocolo apresenta todo o processo de design, simulação, síntese e análise do básico 2D DNA acordeão rack. O projeto modificado e regras de simulação têm sido descritas porque a regra do projeto difere do padrão origami de DNA, em que a cremalheira de acordeão de DNA tem nucleotídeos adicionais em crossovers para flexibilidade14,15. A partir disso, esperamos que o protocolo pode acelerar várias pesquisas usando acordeão cremalheiras de DNA. Além disso, o protocolo descrito também pode ser aplicado a outras pesquisas usando DNA nanostructure em vez do padrão origami de DNA.
Para estruturas que não seja a estrutura básica de 2D demonstrada no trabalho de pesquisa original, o projeto pode ser feito com as modificações do protocolo descrito. Em breve, uma estrutura de boxe-luva-primavera é projetada alterando o número do feixe e o comprimento do modelo básico. Nanotubular 3D estruturas também podem ser criadas, ligando as duas extremidades de uma estrutura 2D acordeão. No entanto, para simular as estruturas 3D, a posição inicial das vigas deve ser considerada no espaço 3D e o estado inicial dos feixes é suposto ser dobrado. Portanto, a transformação computacional mais é necessário. Pesquisa de projeto e simulação de vários 2D e 3D DNA acordeão cremalheira estruturas serão conduzidas por desenvolver o programa auxiliado por computador no futuro.
Velocidade e repetibilidade de atuação também são fatores importantes no domínio da nanotecnologia de ADN dinâmico. Estruturas de DNA recentemente dinâmicas que respondem ao externo elétrico ou campo magnético são propostos e operados com alta velocidade22,23. Enquanto o rack de acordeão de DNA permitiu a atuação coletiva de múltiplos feixes de DNA, a velocidade de reconfiguração não foi melhorou significativamente desde que a atuação é baseada no deslocamento de vertente de DNA. Para outras aplicações, resposta a estímulos externos deve ser melhorada otimizando o projeto de fechamento de DNA ou usando outro estímulos externos.
Como um estudo de aplicação para a estrutura de acordeão reconfigurável, vários materiais funcionais tais como moléculas de drogas, nanopartículas, ou proteínas podem ser fixado à estrutura. Por isso, as moléculas podem ser conectadas para o grampo que existe na posição pretendida. Em geral, uma variedade de estudos de aplicação pode ser realizada através do presente protocolo e suas modificações.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Esta pesquisa foi parcialmente suportada pelo Global Research Center programa de desenvolvimento através do nacional Research Foundation de Korea(NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (MSIT) (2015K1A4A3047345) e Nano· Programa de desenvolvimento de tecnologia de material através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (MSIT) (2012M3A7A9671610). O Instituto de pesquisa de engenharia na Universidade Nacional de Seul desde instalações de pesquisa para este trabalho. Os autores reconhecem gratitude para Yoon Tae-Young (Ciências Biológicas, Universidade Nacional de Seul) em relação a espectroscopia de fluorescência para a análise de traste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M13mp18 Single-stranded DNA | NEB | N4040s | |
| 1M MgCl2 Solution | Biosesang | M2001 | |
| Tris-EDTA buffer | Biosesang | T2142 | |
| Nuclease-Free Water | Qiagen | 129114 | |
| 5M Sodium Chloride solution | Biosesang | s2007 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| 10N NaOH | Biosesang | S2038 | |
| Uranyl formate | Thomas Science | C993L42 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | ||
| Nanodropic 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| TEM (LIBRA 120) | Carl Zeiss | ||
| Fluorometer Enspire 2300 | Perkin-Elmer | ||
| Centrifuge | Labogene | LZ-1580 |
References
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