Bioengineering

Tasarım ve Reconfigurable DNA akordeon raf sentezi

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/58364

Yeongjae Choi*¹, Hansol Choi*¹, Amos C. Lee*², Sunghoon Kwon^1,2,3,4

¹Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, ²Interdisciplinary Program for Bioengineering, Seoul National University, ³Institute of Entrepreneurial Bio Convergence, Seoul National University, ⁴Seoul National University Hospital Biomedical Research Institute, Seoul National University Hospital

* These authors contributed equally

Summary

Biz tasarım, simülasyon, ıslak-laboratuvar deneyleri ve analiz için 6 6 kafesleri reconfigurable bir DNA akordeon raf için detaylı iletişim kuralı tanımlamak.

Abstract

DNA nanostructure tabanlı mekanik sistemler veya 2D ve 3D karmaşık nano çekimde nanometre ångström çözünürlük için üretmek, DNA nanomachines büyük bir potansiyel nanoteknoloji ilaç dağıtım moleküler reaktörler gibi çeşitli alanları göster, ve nanoplasmonic sistemleri. Hangi topluca elemanları, 2D veya 3D nano ağ içinde birden çok sahne DNA girişlerine yanıt işleyebilirsiniz, reconfigurable DNA akordeon rack, açıklanmıştır. Platform DNA nanomachines bir ağ ölçeği ile birden fazla yeniden yapılandırılması aşamaları için birkaç öğeleri denetleyebilirsiniz öğelerin sayısını artırmak için bir potansiyele sahiptir.

Bu protokol için deneysel işlemin tamamı 6 6 kafesleri reconfigurable DNA akordeon raf açıklar. Protokol yapıları ve ıslak-Laboratuvar deney sentezi ve yeniden yapılandırılması için tasarım kuralı ve simülasyon yordam içerir. Buna ek olarak, TEM (transmisyon elektron mikroskobu) ve perde (floresan rezonans enerji transferi) kullanarak yapı analizi iletişim kuralında dahildir. Bu protokol için yeni tasarım ve simülasyon Yöntemler araştırmacılar DNA akordeon raf daha fazla uygulamaları için kullanmak için yardımcı olacaktır.

Introduction

2D ve 3D karmaşık nano çekimde nanometre için ürettikleri çünkü DNA nanoyapıların veya DNA nanomachines¹^,²^,³^,⁴^,⁵ temel mekanik sistemler benzersizdir Ångström çözünürlük, göre çeşitli biyomoleküler uyaranlara²^,³^,⁶. Bu yapılar üzerinde fonksiyonel malzemeleri ekleyerek ve konumlarını kontrol, bu yapıların çeşitli bölgelerine uygulanabilir. Örneğin, DNA nanomachines moleküler reaktör⁷, uyuşturucu teslim⁸ve nanoplasmonic sistemleri⁹^,¹⁰için önerilmiştir.

Daha önce biz hangi öğeleri¹¹ (Şekil 1A) 2D veya 3D nano ağ işleyebilirsiniz reconfigurable DNA akordeon rack, tanıttı. Sadece bir kaç elemanları kontrol diğer DNA nanomachines farklı olarak, platform topluca düzenli aralıklarla dizilmiş 2D veya 3D öğeleri çeşitli aşamalarında üzerinde değişiklik yapabilir. Biz bir programlanabilir biyolojik ve kimyasal reaksiyon ağ veya moleküler bilgi işlem sistemi sistemimiz kontrol edilebilir öğelerin sayısını artırarak inşa olabilir tahmin. DNA akordeon raf birden fazla DNA kirişler ağ tek iplikçikli DNA'sını (Şekil 1B) oluşan eklemlere bağlandığı bir yapıdır. DNA kiriş tarafından üretilen akordeon raf kirişler yapışkan parçası melezlemek ve kilitleri (kilitli durum) köprüleme parçası uzunluğuna göre kiriş arasındaki açıyı değiştirmek DNA kilitleri tarafından yapılandırılır. Buna ek olarak, çok adımlı yeniden yapılandırılması DNA kilitleri çıkıntı tabanlı strand deplasman¹²^,¹³arası ayırma tarafından yeni kilitleri serbest devlet oluşumu sonra ekleyerek gösterilmiştir.

Bu protokol için biz tüm tasarım ve sentez reconfigurable DNA akordeon raf süreci açıklanmaktadır. Protokol tasarım, simülasyon, ıslak-laboratuvar deneyleri ve analiz 6 6 kafesler DNA akordeon raf ve bunlar yeniden yapılanma sentezi için içerir. Protokol kapsamında yapısı önceki araştırma¹¹ temel model ve 65 nm tarafından 65 nm boyutunda 14 demeti oluşan. Tasarım ve simülasyon açısından akordeon raf yapısal tasarımı geleneksel DNA origami¹⁴^,¹⁵ (sıkı paketlenmişyani ) farklıdır. Bu nedenle, tasarım kural ve Moleküler Simülasyon geleneksel yöntemleri değiştirilmiştir. Göstermek için biz caDNAno¹⁴ tarihinde yaklaşım ve akordeon raf oxDNA¹⁶^,¹⁷ ile ek komut dosyalarını kullanma simülasyonu kullanarak tasarım tekniği göstermek. Son olarak, yapılandırılmış akordeon raf yapıları çözümlenmesi için her iki iletişim kurallarını-TEM ve perde açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tasarım 6 6 DNA akordeon raf caDNAno¹⁴ ile tarafından

Bir DNA akordeon raf tasarımı için caDNAno 2.0 yazılım¹⁴ yükleyip (caDNAno 2.5 mevcuttur ayrıca https://github.com/cadnano/cadnano2.5 üzerinde). CaDNAno¹⁴ ' ü aç ve Kare aracı kare bir kafes ile yeni bir bölüm eklemek için tıklatın.
Her ışın akordeon raf numarası ve caDNAno¹⁴ (Şekil 2) sol kafes paneli üzerindeki çizin.
Kalem aracını tıklatın ve doğru Düzenleme panelindeki caDNAno¹⁴her ışın çizin. Mola kirişler her 32 bp, bitişik kirişler arasında eklem içindir. Zımba kesişim eklem aynı pozisyonda yerleştirin. Ekle aracı ve Kurşun kalem aracı caDNAno¹⁴ ' te ek tek iplikçikli kesişim var eklem bildirmek için kullanın.
Kurşun Kalem aracını tıklatın ve eklem bağlayın. Her ışını yedi eklem vardır.
İskele algoritması¹¹yönlendirme daha önce raporlanmış iskele kullanarak tek döngü içine birleştirmek için iskele kesişim oluşturmak. 8 olmak en az bağlayıcı etki iskele ve elyaf iplikleri arasında izin vermeyin bp (Şekil 3).
Kullanılmayan iskele akordeon raf karşı taraflarda bulunan köşeleri toplantıda Şekil 3' te gösterildiği gibi yerleştirin.
Aracı Break' ı tıklatın. Dairesel veya 60'dan daha uzun nerede zımba iplikçikleri ayrılmaktadır kırmak bp.
DNA kilit dizilerini tasarlayın.
1. Aracı Break' ı tıklatın. Yapışkan bir parçası yapmak ve 8 silmek için bir elyaf DNA bölgesinin sonu 8 bp bp zımba DNA bölge. 6 6 akordeon raf 18 yapışkan bölümden (Şekil 1) vardır.
2. Ters sıralarını kilit ayrılmaktadır her iki ucunda yapışkan bölümlerine tamamlayıcı yere takıp onları istenilen uzunlukta (Şekil 1B) poli T ipliklerini oluşan bir köprüleme bölgeye göre bağlayın.
3. Yeniden yapılandırılması için 8 add bp DNA sonunda çıkıntı sıralarının kilitler için strand çıkarma. Kullanılan çıkıntı Tablo 2' de dizisidir.
4. Köprüleme bölgesine tamamlayıcı ters poli A iplikçikleri hazırlayın.
5. Yeniden yapılandırılması deney DNA kilitlerine için tamamlayıcı ters tasarım ayrılmaktadır.
Sıra aracını tıklatın ve iskele DNA'ı tıklatın. Standart M13mp18. Verme aracı tıklatın ve sıra (Tablo 1) csv biçiminde kaydedin iskele seçin.

2. oxDNA yapısıyla simülasyonu

Karşıdan yükleyip oxDNA¹⁶^,¹⁷. En son kaynak kodu https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/ üzerinde kullanılabilir.
Python komut dosyası 'cadnano_interface.py' oxDNA¹⁶^,¹⁷ paketinde sağlanan, kullanarak caDNAno¹⁴ dosyasını başlangıç yapılandırma dosyalarından olun. Kullanımı aşağıdaki gibidir: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. Topoloji dosya ve yapılandırma dosyası şimdi oluşturulur.
Not: Kaç iplikçikleri topoloji dosya içerir ve nükleotid yapısı ve omurga-omurga nükleotitler arasındaki bağları ile ilgili bilgi bulunmaktadır. Yapılandırma dosyası timestep, enerji ve kutusu boyutu gibi genel bilgileri içerir. Oryantasyon pozisyon vektör, omurga tabanlı vektör, normal vektör, hız ve nükleotid açısal hızı gibi de dahil (Şekil 4) bilgilerdir.
Topoloji ve yapılandırma dosyanızdaki akordeon raf çok yapısal bilgileri yansıtacak olmaları için caDNAno¹⁴ değiştirin. CaDNAno¹⁴ topoloji ve yapılandırma dosyaları görüntülenir zaman tüm kirişler paralel olarak düzenlenmiştir. Ancak, akordeon raf bir kafes yapısı bu nedenle gümrüklü nükleotitler arasındaki mesafe kadar simülasyon (Şekil 5).
1. Döndürme ve istenen kafes yapısı her ışın taşıyın. Yapılandırma dosyasında soldaki dokuz sütun konumu vektör, omurga tabanlı vektör ve normal vektör (Şekil 4) vardır. Bir ışın döndürmek için tüm konum, omurga-base ve normal vektörel çizimler dönme dönüştürme kullanarak döndürün. O zaman bir ışın Şekil 5' te gösterildiği gibi bulmak için konum vektör değiştirerek taşıyın.
2. OxDNA paketinde sağlanan komut dosyasını kullanarak yapı sakin ol ($oxDNA örneğe bakın/örnekler/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION için daha fazla bilgi).
Moleküler dinamiği simülasyon rahat yapılandırma dosyası kullanarak on milyon adımları için çalıştırın. Kullanımı aşağıdaki gibidir: '. / oxDNA < giriş >' veri her 5000 veya 10000 adımları kaydetmek.
Görselleştirme
Not: Cogli kullanarak yapıları görüntülenir.
1. Download ve cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/) en son sürümünü yükleyin.
2. Cogli topoloji ve yapılandırma dosyaları ile oxDNA benzetim çalıştırın. Kullanımı aşağıdaki gibidir: '. / cogli1 -t < topoloji Dosya >< yapılandırma dosyası >'.
3. Btuşuna basarak kutusunu gizlemek.

3. yapı sentezi

Not: Sentez yöntemi önceki iletişim kuralı¹⁵^,¹⁸uyarlanmıştır.

Tasarlanmış DNA zımba bir oligonükleotid sağlayıcısından satın.
Bu DNA zımba 100 mikron nükleaz ücretsiz su kullanarak için konsantrasyon ayarlayın.
1. 'Devlet ücretsiz' yapısı bir tüp oluşturan her DNA strand havuz ve konsantrasyon için her iplikçik 2 mikron için ayarlayın.
2. Havuzu DNA kilit uzunluğu ve kilit sitelerin sayısı tarafından tüpler içine ayrılmaktadır ve konsantrasyon için her iplikçik 2 mikron için ayarlayın. 18, 9 ve 4 kilit siteleri kullanılır. Aynı konsantrasyonu, köprüleme bölgesine tamamlayıcı poli A iplikçikleri ekleyin.
3. Tamamlayıcı DNA için ters havuzu iplikçikleri ayrılmaktadır boyla tüpler içine kilitle ve konsantrasyon için her iplikçik 2 mikron için ayarlamak.
MgCl₂ çözüm 300 hazırlamak 70 μL nükleaz ücretsiz su ve 1 mikron MgCl₂ çözüm 30 μL karıştırma tarafından nM. 5 Tris EDTA çözüm x 95 μL nükleaz ücretsiz su ve 100 x Tris EDTA çözüm 5 μL karıştırarak hazırlayın.
Zımba DNA, MgCl₂ çözüm 1.1 μL 2 μL, Tris EDTA çözüm, nükleaz ücretsiz su 7.6 μL ve konsantrasyonu 110 olduğu iskele DNA 7.3 μL 2 μL ekleyin nM 20 μL karışık stok yapmak. İskele DNA son konsantrasyonu 40'a ayarla nM, DNA zımbala 200 nM, MgCl₂ ' ye 16 mM ve Tris EDTA çözüm 0.5 x.
Hızla 4 ° c ° C. başına 40 dk hızında 60 ° c ile 60 ° C ° C ve serin başına 4 dk hızında 80 ° c termal cycler ve serin karışık hisse senedi çözümde ısı

4. arıtma yapısı

Not: Tüm yapıları örnekleri analiz daha önce saf. Bu bölümde, önceki edebiyat¹⁹uyarlanmıştır PEG arıtma protokolü açıklar. Örnek ayrıca jel elektroforez tarafından önceki edebiyat¹⁵^,¹⁸' açıklandığı gibi saf.

5 M NaCl ve 100 x Tris-EDTA hazırlayın.
Yağış-tampon 8000, PEG 500 μL Tris EDTA x 100 ve 101 μL 5 M NaCl ve 249 μL nükleaz ücretsiz su 150 μL karıştırarak hazırlayın.
Hedef-tampon Kısım 3.3 300 nM MgCl₂ çözümden 5.5 μL, 5 x Tris EDTA çözümden Kısım 3.3 10 μL ve 84,5 μL nükleaz ücretsiz su karıştırılarak hazır olun.
Bölüm 3 ve yağış-Bölüm 4.2 arabelleğinden 20 μL sentezlenmiş yapısının Mix 20 μL. Karışık hisse senedi 16000 x g 4 ° C'de te spin Süpernatant kaldırmak ve Pelet Bölüm 4.3 hedef arabelleğinden içinde çözülür.

5. yeniden yapılanma 'Devlet kilitli' için bir 'devlet' akordeon raf

DNA kilitleri yapılandırma deneme için olmadan yapı sentez.
DNA kilit dizilerini Bölüm 3 hazırlayın.
İstenilen uzunlukta DNA kilit iplikçiklerinin 2 μL sentezlenmiş yapısı 20 μL ekleyin. DNA kilit dizilerini konsantrasyon yapısı beş kat daha yüksek.
Örnek 0, 10, 25, 50 için kuluçkaya veya ne kadar hızlı yeniden yapılandırılması görmek için 100 dakika oluşur.
1. 100 dakika kuluçka için örnek 50 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya ve 25 ° C de 0,33 ° C/dakika'dan başlayarak bir oranda aşağı yavaş yavaş serin.
2. 50 dakika kuluçka için örnek 50 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya ve 25 ° C de 0,66 ° C/dakika'dan başlayarak bir oranda aşağı yavaş yavaş serin.
3. 25 dakika kuluçka için örnek 50 ° c için 7.5 dakika kuluçkaya ve 25 ° C de 1.32 ° C/dakika'dan başlayarak bir oranda aşağı yavaş yavaş serin.
4. 10 dakika kuluçka için örnek 50 ° c için 1 dakika kuluçkaya ve 25 ° C de 3.3 ° C/dakika'dan başlayarak bir oranda aşağı yavaş yavaş serin.
5. DNA kilitleri dizilerini eklendikten sonra 0 dakika kuluçka için örnek 4 ° C sağ saklayın.
Şu takma adım sonra hızla örnek ile 4 ° C arasında istenmeyen denatürasyon önlemek için sakin.

6. yeniden yapılanma bir 'devlet bir 'devlet için' kilitli' dan akordeon raf

DNA kilitleri yapılandırma deneme için istenilen uzunlukta yapısıyla sentez.
Bölüm 3 ters tamamlayıcı iplikçikleri hazırlayın.
İstenilen uzunlukta kilit ipliklerini için tamamlayıcı ters sentezlenmiş yapısı 20 μL iplikçiklerinin 2 μL ekleyin. DNA kilit dizilerini konsantrasyon yapısı beş kat daha yüksek.
Örnek 0, 12, 60, 120 için kuluçkaya, ne kadar hızlı yeniden yapılandırılması görmek için 240 dakika oluşur.
1. 12, 60, 120, 240 dakika kuluçka, hızla örnek 40 ° c ısı ve yavaş yavaş her birine karşılık gelen kez aşağı 20 ° C serin. Şu ayırmayı adımdan sonra hızla örnek ile 4 ° C arasında istenmeyen denatürasyon önlemek için sakin.
2. Geriye doğru tamamlayıcı iplikçikleri eklendikten sonra 0 dakika kuluçka için örnek 4 ° C sağ saklayın.

7. TEM görüntüleme

Not: TEM görüntüleme Protokolü önceki edebiyat¹⁸^,²⁰uyarlanmıştır.

1.25 M NaOH çözüm 87,5 μL nükleaz ücretsiz su ve 10 M NaOH çözüm 12.5 μL karıştırarak hazırlayın.
1.25 M NaOH çözüm 1 μL % 2 uranyl Format çözüm 50 μL için ekleyin.
Girdap 3 dakika ve 2 dakika için maksimum hızda santrifüj için çözüm. Arıtılmış örnek 3 μL kızdırma taburcu TEM ızgara üzerinde 3 dakika boyunca mevduat ve hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile yıkayın.
Hazır uranyl Format çözüm 7 μL 30 saniyeliğine mevduat ve hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile yıkayın.
Uzunluk ve açı tarafından TEM görüntüsü akordeon yapısının ölçmek.

8. perde Analizi

ATTO 550 ve Förster mesafe 6.5 olduğu sınav 647N boya kullanın nm. Zımba 58 ve elyaf 117 Tablo 1 ' deki fluorescently etiketli lifler ile değiştirin. O zaman fluorescently etiketli iplikçikleri yapısıyla Bölüm 3'te açıklanan yöntemi tarafından sentez.
Arıtılmış örnek konsantrasyonu ölçmek.
10 nM ve yük 50 μL 384 Mikroplaka için örneğine de normalleştirmek.
Donör ve alıcısı boyalar 550 nm ve ölçü birimi ile örnek heyecanlandırmak floresans spektrum üzerinden 570 nm 800 nm bir yer ile.
Sadece donör örnek floresans spektrumu aynı şekilde ölçün.
Örneği 650'boyalar heyecanlandırmak nm ve floresan spektrum ve 670 ölçü nm 800 nm. Alıcısı konsantrasyonunu ölçmek için bu.
Standart sapmalar sentezlenmiş ve ayrı ayrı saf üç örnekleri ile aynı deneyi tekrar ederek elde edilir.
PERDE verimlilik oranı²¹aşağıda denklemi tarafından açıklandığı gibi bir yöntem ile hesaplayın.

DA₅₅₀: donör ve 550 nm uyarma, alıcısı ile örnek alıcısı tepe floresan yoğunluğu.
D₅₅₀: floresan yoğunluğu salt donör örneği 550 nm uyarma'alıcısı emisyon mesafeden.
DA₆₅₀: alıcısı tepe floresan yoğunluğu ile donör ve alıcısı 650 nm uyarma, örnek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tarafından tasarlanmış 6 6 DNA akordeon raf oxDNA¹⁶^,¹⁷ benzetimli ve sonuçları Şekil 6' da gösterilmiştir. Simülasyon sonucu o amaçlanan yapısı yapısı bozulma oluşturulur doğrulandı.

Şekil 7 TEM Albümdeki yapılandırılmış yapıları ile 2, 8, 13 ve 20 bp kilit uzunluğunu görüntülerdir. Kilit uzunluğunu daha uzun hale geldikçe görüntüde yapıları (Şekil 8A) açısını azalır. İstatistiksel olarak eğilimi analiz etmek, ortalama ve standart sapma açısı (Şekil 8A) birden çok yapılandırılmış yapıları (Şekil 8B) elde edilmiştir. Ayrıca, yapısal değişim ve hızı, perde ölçüm sonuçları göster ek olarak yapısal eğilim (Şekil 8 c) TEM resimdeki gösterildiği.

Bu analiz yordamlar gelen DNA akordeon raf kaç kilitleri gibi karakterizasyonu yapısal yapılandırması için ihtiyaç vardır ve yeniden yapılandırılması hızı belirlendi.

Şekil 1. Reconfigurable bir DNA akordeon raf. A. DNA akordeon raf oluşan katı DNA kiriş ve her ışın bağlanmak birden çok esnek eklemleri. Akordeon raf farklı DNA kilitleri uzunluğuna göre yapılandırılır. Çeşitli 2D ve 3D Platformlar platformu değiştirerek tasarlanabilir. B. yeniden yapılandırılması DNA akordeon raf hibridizasyon farklı uzunlukları ile DNA kilitleri ile elde edilir. Fazladan nükleotid kesişim (veya ek yerleri, sarı), eklendiğinde 'devlet' yapısında (iki sarmal oluşan), DNA kirişler arasında gevşek bağlantı nedeniyle açı (üst kısım) değiştirilebilir. Her iki bitişik kirişler yapışkan parçası için köprü bölümünün çeşitli uzunlukları ile DNA kilit hibridizasyon oluşturur 'devlet kilitli (alt bölümü). DNA kilit (mavi) çıkıntı parçalar ile yakıt strand kullanarak Strand deplasman DNA kilitleri kilitli devlet yapısının ayırmak ve ücretsiz için değiştirmek. DNA kilit çeşitli kitaplıklarla işlemi yineleyerek, yapısı farklı açılarla yapılandırılır. Bu rakam önceki araştırma¹¹değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. 6 6 akordeon raf caDNAno kullanarak tasarlanmıştır. DNA akordeon raf 14 demeti numaralandırılır ve caDNAno kafes paneli üzerindeki çizilmiş. Bu rakam önceki araştırma¹¹değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. İskele yapısı-yönlendirme algoritmasını. A. iskele akordeon raf karşı taraflarda bulunan köşeleri toplantıda, kullanılmamalıdır. B. yedi kapalı döngüler iskele kesişim oluşturarak tek bir döngü içine birleştirilir. En az altı iskele kesişim noktaları ihtiyaç vardır ve iskele kesişim önceki edebiyat adapte konumudur. Bu rakam önceki araştırma¹¹değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Bir yapılandırma dosyası örneği. Yapılandırma dosyası timestep, enerji ve kutusu boyutu ve yönlendirme bilgileri gibi genel bilgileri içerir. Yapılandırma dosyasında soldaki dokuz sütun konumu vektör, omurga tabanlı vektör ve normal vektör sırasıyla vardır. Sağ altı sütuna hızları ve açısal hızları vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5. Görsel öğe yapılandırma dosyası önce ve sonra değişikliği. Pozisyon, omurga-base ve normal vektör akordeon raf yapısal bilgileri yansıtacak bilgileri yapılandırma dosyası yapmak için dönüş dönüştürme kullanarak güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6. Simülasyon sonucu oxDNA. DNA kilitler, uzunlukları 2, 8, 13 ve 20 bp, olan ile Akordeon raf simüle. 18 siteleri kilitleme kullanılmıştır. Bir DNA ile 6 6 akordeon kabin kilit uzunluğu A 2 olduğu bp, B 8 bp, C 13 bp ve D 20 bp benzetimli vecogil tarafından görüntülenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7. Tarafından yapılandırılmış 6 6 DNA akordeon raflar görüntülerini TEM. A 2 uzunlukları kilit yapılarla bp, B 8 bp, C 13 bp ve D 20 bp görüntüsü. 18 kilitleme siteleri bu deneme için kullanılmıştır. (ölçek çubuğu: 100 nm). Bu rakam önceki araştırma¹¹değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8. 2D akordeon raf açı kontrolünü. 6-tarafından-6 kafesleri oluşan akordeon raf açısını DNA kilitlerin uzunluğu tarafından kontrol ediliyordu. A. DNA kilit 2, 8, 13 ve 20 bp uzunlukları ile Akordeon raf 18 kilitleme sitelere ekleyerek, açı (mavi) temsilcisi TEM görüntülerde görüldüğü gibi yapılandırılır. Boya çifti, Atto647N ve Atto550 perde Verimlilik Analizi için yapısına bağlı. (ölçek çubuğu: 100 nm) B. yapılandırılmış açıları dağıtım. Yer paylaşımlı trend çizgisi (gri) 2 kafesler başına 1 kilit grafik değil. Ayrıca, x ekseni kılavuz 2 kafesler başına 1 kilit grafik üzerinde aynı kılavuz karşılık gelir. Çubuklar bir standart sapma ortalama açıdan gösterir. C. FRET verimliliği dağıtım. Çubuklar bir standart sapma ortalama verimlilik gösterir. Ö. için ücretsiz üzerinden geçiş durumu kilitli veya tersi farklı kuluçka kez göre ölçüldü verimliliği değişiklik FRET. DNA kilit uzunluğu 2 ile bp kullanıldı. Çubuklar bir standart sapma ortalama verimlilik gösterir. Bu rakam önceki araştırma¹¹değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adı	Sıra	Uzunluğu
Elyaf 1	ATAAGAGGTCATTTTTGCGGATGGATGTTACT	32
Elyaf 2	CAAAGTTACCAGAAGGAAACCGAGACATCGGG	32
Zımba 3	ACAATGAAATAGCAATAGCTATCTCAAATAAA	32
Zımba 4	CGCTAATATGAACGGTGTACAGACCAGGCGCATAGGCTGGGAACAAAGTCAGAGGG	56
Zımba 5	CAGAAAACCCGGAATAGGTGTATCACCGTACTCAGGAGGTCCCCCTCAAATGCTTT	56
Zımba 6	AGTGAGAATAGAAAGGTATGATATTCAACCGTTCTAGCTGATAAATTATCAACAGT	56
Zımba 7	ATTTGGGGCGCGAGCTATATGGTT	24
Zımba 8	GCCTTTATTTCAACGCAAGGATAATTAATGGA	32
Zımba 9	TCAATTACCCACTACGAAGGCACCGGTAAAAT	32
Zımba 10	ATTCAGTGAATAAGGCTTGCCCTGAAAACAGA	32
Zımba 11	AGAAACAATAACGGATTCGCCTGATAGCCGAA	32
Elyaf 12	ATCAATATCTGGTCAGTTGGCAAAAGTAACAA	32
Zımba 13	CGGAGACAGTCAAATCACCATCAAGGGTTAGA	32
Zımba 14	GAGAATTAACTGAACACGAAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATCGAAGCGCA	56
Zımba 15	CGAGAGGGTTGATATAAGTATAGCATAGGAAC	32
Zımba 16	CCCTTATTAGCGTTTGCCATCTTTTGGTGCCG	32
Zımba 17	GTTTTCATCGGCATTTATGCCGGA	24
Zımba 18	GTAGCAACTTCCAGTAAGCGTCATGTCTCTGA	32
Zımba 19	AGCTAATGCAGAACGCAATAAACA	24
Zımba 20	CCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGGCCTATTT	32
Zımba 21	ACCAGAGCCACCACCGCGAGAGGC	24
Zımba 22	AGGCTCCAAAAGGAGCCGTTTACCAGACGACGATAAAAACCAAAATAGAAAATCTC	56
Zımba 23	GCCGGAAGGAAACGCAATAATAACGGAATACCCAAAAGAACTCACAATTCCACACA	56
Zımba 24	TTTTTCACCGGTGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAACAGTACTAAAGGAATTGCGA	56
Zımba 25	ATCAGGTCTTTACCCTCGCATTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGACCATA	56
Zımba 26	TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTGACATTCA	32
Zımba 27	AATAAAGAAATTGCGTAGATTTTCAGCTGCTC	32
Zımba 28	CCCAATCCTCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCGCTTCAAAATAAACAGCCATA	56
Zımba 29	AAAGACTTCAAATATCATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGATTAAGAG	56
Zımba 30	GTAGCGACAGAATCAAGTTTGCCTGATTTAGA	32
Zımba 31	GCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAACAAGAG	32
Zımba 32	AAGCAAGCCGTTTTTATTTTCATCTCCTGATT	32
Zımba 33	GAGGGTAGCTATTTTTGAGAGATCCGTCAGAC	32
Zımba 34	TATGACCCTGTAATACTCCCATCCTAATTTACGAGCATGTAGAAACCAGTTGTACC	56
Zımba 35	GATTAGAGAGTACCTTAACAGTGCCCGTATAAACAGTTAATGCCCCCTAACTCCAA	56
Zımba 36	CGTCTTTCCAGACGTTGTAGGAATCATTACCGCGCCCAATAGCAAGCACGATCTAA	56
Zımba 37	TTTAACGTCAAAAATGAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACAAGAAACG	56
Zımba 38	TTTAACGGGGTCAGTGCCTTGAGTATAAGGGA	32
Zımba 39	AATTGTGTGCAAAATCCCTTATAAGGTGGTTC	32
Zımba 40	ACCAGTAGCACCATTACCATTAGCTTTCAGGG	32
Zımba 41	AAACATCAAGAAAACAAAATTAATTCACATTA	32
Zımba 42	TTGGCCTTGATATTCATCATCTTT	24
Zımba 43	TGCATCAATCAACAGTTGAAAGGAATTGAGGAAGGTTATCATTATAGTCAGAAGCA	56
Zımba 44	GCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTAGGGGACG	32
Zımba 45	TCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAAGCAAGAA	32
Zımba 46	GAGCCTAATTTGCCAGGGGGGTAATAGTAAAATGTTTAGACTGGATAGAACGAGCG	56
Zımba 47	TAAGAGCAACACTATCATAACCCTTTAACGTC	32
Zımba 48	ATAGCAAGCCCAATAGGAACCCATGCAAAATC	32
Zımba 49	CATAAAAACTTAGAGCTTAATTGCTGAATATAATGCTGTATAGCAGCCTTTACAGA	56
Zımba 50	ATTTACCGGGCTACAGAGGCTTTGGAACGAGG	32
Zımba 51	GTGCCTAATGAGTGAGAATGCAGATACATAACGCCAAAAGGAATTACGAAGTGTAA	56
Zımba 52	ATACCGATAGTTGCGCATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTTTCTTAA	56
Zımba 53	ATAACCGATACCGAAGCCCTTTTTAAGAAAAGTAAGCAGAAATGACAACAACCATC	56
Zımba 54	TCAGAGCCGCCACCCTCAGAACCGGCTCAACA	32
Zımba 55	TTTTGCAAAAGAAGTTTTGCCAGAAATCAAAA	32
Zımba 56	GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAAGAAACC	32
Zımba 57	ACATGTTCAAAGACACCACGGAATCATATAAA	32
Zımba 58	CTGTGTGAAATTGTTAGAGTAATGTGTAGGTAAAGATTCAAAAGGGTGTGGTCATA	56
Zımba 59	TTTCGAGGCCGGATATTCATTACCCAAATCAACGTAACAAAATTGTATCGGTTTAT	56
Zımba 60	CTTTAGGAGCACTAACAACTAATAAGCCCCAA	32
Zımba 61	AGATTAGTTGCTATTTTACAAAGGCTATCAGGTCATTGCCTGAGAGTCTTGAAGCC	56
Zımba 62	GAGCCGCCGCCAGCATTGACAGGACTGACCTT	32
Zımba 63	GAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCTCATAGCC	32
Zımba 64	CATCAAGAGTAATCTTGACAAGAACACCACCA	32
Zımba 65	AACCTTGCTTCTGTAAATCGTCGCTTATCAAC	32
Zımba 66	TAGTTAGCGACAACTCGTATTAAATCCTTTGCCCGAACGTGTAGCATTCCACAGAC	56
Zımba 67	ACCGATTGAGGGAGGGAAGGTAAAGGGGGATG	32
Zımba 68	TACCAGCGCCAAAGACAAAAGGGCGTTTAGCT	32
Zımba 69	TCATATATTTTAAATGCAATGCCTAAAACGAA	32
Zımba 70	ACATTATCATTTTGCGTATTGACG	24
Zımba 71	CGGAACCTATTATTCTGAAACATGCGGATTGA	32
Zımba 72	CCTGAGAGATATTTTGTTAAAATTTAAATTGT	32
Zımba 73	GAAACCATCGATAGCAAATCAGAT	24
Zımba 74	CTCAGAGCCGCCACCATATTGGGC	24
Zımba 75	CACCGACTTGAGCCATTTGGGAATACACTGAG	32
Zımba 76	TCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGTTTGCGGG	32
Zımba 77	AAACAGGAAGATTGTATAAGCAAATAAAATAT	32
Zımba 78	ATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGAAGACTTTT	32
Zımba 79	ATCAACATTAAATGTGTTGTTCCA	24
Zımba 80	TGCAGGGAGTTAAAGGAACGAAAGAGGCAAAAGAATACACTAAAACACTTCGGTCG	56
Zımba 81	ACGTAATGCTGAGCAAAAGAAGATTATTCATT	32
Zımba 82	AATCGATGAACGGTAATCGTAAAATTAGTACC	32
Zımba 83	GACCCCCAGCGATTATACCAAGCGGAGGCAGG	32
Zımba 84	CGAAATCCGCGACCTGGCCTGATA	24
Zımba 85	GCCATCAAAAATAATTCGCGTCTGAGTGCCGT	32
Zımba 86	TCGGCTGTCTTTCCTTATCATTCCATTACCTT	32
Zımba 87	CAGACCGGGGGCGCATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTTGTTTAATTCGAGCTTCA	56
Zımba 88	GTTTGGAACAAGAGTCCACTATTACCTGTAGC	32
Zımba 89	AACAGTACATAAATCAATATATGTCGGGAGAA	32
Zımba 90	GACGTTGGGAAGAAAAATCTACGTCTGGCATG	32
Zımba 91	CAAAATCGCGCAGAGGCGGGAAAC	24
Zımba 92	ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTGATGAAAC	32
Zımba 93	CCCCGGTTGATAATCACGTCCAAT	24
Zımba 94	ATGCCTGCAGGTCGACAAGAACGGGTATTAAACCAAGTACCGCACTCACCAGTGCC	56
Zımba 95	GTTTGGATTATACTTCTGAATAATTGATTCCC	32
Zımba 96	ACCGAACTGACCAACTTTGAAAGATAATAAGT	32
Zımba 97	GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCCCTCAGAG	32
Zımba 98	CAGTTGAGATTTAGGAATACCACATACATTTA	32
Zımba 99	TAGCCGGAACGAGGCGCAGACGGTTCCTTTTG	32
Zımba 100	AGTATTAGACTTTACAAACAATTCCGTAATCA	32
Zımba 101	CTTGCGGGAGAACCGCCACCCTCAGAGCCACCACCCTCATGAGGCGTTTTAGCGAA	56
Zımba 102	TTAAGAACTGGCTCATATCAATAA	24
Zımba 103	CATACAGGCAAGGCAAAGAATTAGAAGTTTAT	32
Zımba 104	ATTGAGTTAAGCCCAAACATGGCTTTTGATGATACAGGAGTGTACTGGGAGATAAC	56
Zımba 105	ATAGAAGGCTTATCCGGTATTCTACGGAAACG	32
Zımba 106	CTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGATTTGAATA	32
Zımba 107	CTTACCAAGATTAGAGCCGTCAATAGATAATACATTTGAGCCCAGCTACAATTTTA	56
Zımba 108	ACCTTGCTGAACCTCAAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCAAGAGAAAAAATCT	56
Zımba 109	TTTGTCACAATCAATAGAAAATTCCAATAAAT	32
Zımba 110	CAATTCTATTCAACTTTAATCATTCTTGAGAT	32
Zımba 111	ACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGAGCTGGTTT	32
Zımba 112	ACTGCGGAATCGTCATAAATATTCATGTCAAT	32
Zımba 113	TTTCGTCACCAGTACAAACTACAAATCACCGT	32
Zımba 114	AATTCTGCGAACGAGTAGATTTAGTCCTGATT	32
Zımba 115	GAAATTATTCATTAAAGGTGAATTTTTAAAAG	32
Zımba 116	ACCAGAAGGAGCGGAATTATCATCTCGGTGCG	32
Zımba 117	AATTCGTAACGAGAAACACCAGAACGAGTAGTAAATTGGGGAGGATCCCCGGGTAC	56
Zımba 118	ATTAAGACTCCTTATTACGCAGTACCAGTCAG	32
Zımba 119	GGTTTAATCTAATAGTAGTAGCATGGTGGCAT	32
Zımba 120	AAACCGTCTTAGCGGGGTTTTGCTCAGTACCAGGCGGATATGGACTCCAACGTCAA	56
Zımba 121	TATCAAAATTATTTGCAGAAAGGC	24
Zımba 122	ACAACATTATTACAGGTAGAACCC	24
Zımba 123	CCCGTCGGATTCTCCGTGGGAACAAACCCTCA	32
Zımba 124	ACAATTTCATTTGAATTACCTTTTAGATTCAT	32
Zımba 125	GCTAAACACATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGAAATGAATTTTCTGTAT	56
Zımba 126	AATAGATAAGTCCTGAACAAGAAAGAGTGAAT	32
Zımba 127	AAAGCTAATGTTAGCAAACGTAGAAAATACATACATAAAGTTAAGCAATAAAGCCT	56
Zımba 128	TGTTTTAAATATGCAACTAAAGTACGCCTCCC	32
Zımba 129	ATACAGTAACAGTACCAGGCATAG	24
Zımba 130	GTAAAACGTTTGACCATTAGATACATTTCGCAAATGGTCACAGGGTTTTCCCAGTC	56
Zımba 131	AGTTGCAGCAAGCGGTCGCCTGGC	24
Zımba 132	ATGGCAATTCATCAATTCGAGAAC	24

Tablo 1. Zımba ipliklerini dizisi

Adı	Sıra
Toehold_1	AGAAGTCG
Toehold_2	AGGTATGG
Toehold_3	CTCCACTC
Toehold_4	GTGTCCGA
Toehold_5	AAGTAGAC
Toehold_6	GAGTCGCT
Toehold_7	AGTGTCTA
Toehold_8	GTATCGTG
Toehold_9	CATCACAG
Toehold_10	CGAGACTT
Toehold_11	ACGGACGA
Toehold_12	GCCTACTC
Toehold_13	GATGTGGA
Toehold_14	GCGTGCGT
Toehold_15	GTGGACAA
Toehold_16	TACGACTG
Toehold_17	CAGCCGTG
Toehold_18	TGCCGCAT

Tablo 2. Çıkıntı sıra strand deplasman deneme için

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı tüm süreç tasarımı, simülasyon, sentez ve analiz temel 2D DNA akordeon raf tanıtır. Standart DNA origamisi, tasarım kuralı farklıdır çünkü DNA akordeon raf kesişim esneklik¹⁴^,¹⁵, ek nükleotit yok modifiye tasarım ve simülasyon kuralları tarif edilmistir. Bu, protokol DNA akordeon raflar kullanarak çeşitli araştırmalar hızlandırabilir bekliyoruz. Buna ek olarak, açıklanan protokolü de standart DNA origamisi yerine DNA nanostructure kullanarak diğer araştırma uygulanabilir.

Orijinal araştırma ödevi gösterdi temel 2D yapısı dışında yapıları için tasarım açıklanan protokol değişiklikleri ile yapılabilir. Kısacası, bir boks eldiveni baharında yapısı uzunluğu ve ışın numarası temel modelinden değiştirerek tasarlanmıştır. 3D nanotubular yapıları da her iki ucunda da bir 2D akordeon raf yapı bağlanarak oluşturulabilir. Ancak, 3D yapılar simülasyonu için kiriş ilk pozisyon 3B alanda olduğu kabul ve başlangıç durumu kiriş rüşvetçi gerekiyordu. Bu nedenle, daha fazla hesaplama dönüştürme gereklidir. Araştırma tasarım ve simülasyon çeşitli 2D ve 3D DNA akordeon raf yapıları gelecekte bilgisayar destekli program geliştirme tarafından yapılacaktır.

Hız ve çalıştırma tekrarlanabilirlik aynı zamanda dinamik DNA nanoteknoloji alanında önemli faktörler vardır. Harici elektrik yanıt son zamanlarda Dinamik DNA yapıları veya manyetik alan önerilen ve yüksek hız²²^,²³ile işletilmektedir. DNA akordeon raf birden fazla DNA kirişler toplu çalıştırma etkin iken, çalıştırma DNA strand deplasman üzerinde dayalı olduğundan yeniden yapılandırılması hızı önemli ölçüde geliştirilmiş değil. Daha fazla uygulama için dış uyaranlara yanıt DNA kilit tasarım en iyi duruma getirme veya başka bir dış uyaranlara kullanarak geliştirmek.

Reconfigurable akordeon yapısı, ilaç molekülleri gibi çeşitli işlevsel malzemeler için bir uygulama çalışma olarak nano tanecikleri veya protein yapısına eklenebilir. Bunun için istenen konumda bulunan elyaf molekülleri bağlanabilir. Genel olarak, uygulama çalışmaları çeşitli bu protokolü ve modifikasyonları yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Bu araştırma kısmen küresel araştırma geliştirme merkezi Program aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Bilim Bakanlığı ve ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345) ve Nano· tarafından finanse edilen Korea(NRF) tarafından desteklenmiştir Malzeme teknolojisi geliştirme programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı ve ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610) tarafından desteklenen NMK). Seul Ulusal Üniversitesi'nde Mühendislik Araştırma Enstitüsü araştırma tesisleri bu iş için sağlanan. Yazarlar Tae-genç Yoon (Biyolojik Bilimler, Seul Ulusal Üniversitesi) doğru perde analizi için şükran floresans spektroskopisi ile ilgili olarak kabul.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 Single-stranded DNA	NEB	N4040s
1M MgCl₂ Solution	Biosesang	M2001
Tris-EDTA buffer	Biosesang	T2142
Nuclease-Free Water	Qiagen	129114
5M Sodium Chloride solution	Biosesang	s2007
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
10N NaOH	Biosesang	S2038
Uranyl formate	Thomas Science	C993L42
Thermal cycler C1000	Biorad
Nanodropic 2000	Thermo Fisher Scientific
TEM (LIBRA 120)	Carl Zeiss
Fluorometer Enspire 2300	Perkin-Elmer
Centrifuge	Labogene	LZ-1580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
Cha, T. -G., et al. Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation. Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).
Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. M., Dietz, H. Dynamic DNA devices and assemblies formed by shape-complementary, non-base pairing 3D components. Science. 347 (6229), 1446-1452 (2015).
Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature nanotechnology. 6 (12), 763-772 (2011).
Li, J., et al. Exploring the speed limit of toehold exchange with a cartwheeling DNA acrobat. Nature Nanotechnology. 1, (2018).
Krishnan, Y., Simmel, F. C. Nucleic acid based molecular devices. Angewandte Chemie International Edition. 50 (14), 3124-3156 (2011).
Liu, M., et al. A DNA tweezer-actuated enzyme nanoreactor. Nature communications. 4, 2127 (2013).
Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), New York, N.Y. 831-834 (2012).
Kuzyk, A., et al. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Materials. 13 (9), 862-866 (2014).
Zhou, C., Duan, X., Liu, N. A plasmonic nanorod that walks on DNA origami. Nature communications. 6, 8102 (2015).
Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
Chen, H., et al. Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of their Folding and Unfolding Reconfiguration. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6995-7005 (2014).
Han, D., Pal, S., Liu, Y., Yan, H. Folding and cutting DNA into reconfigurable topological nanostructures. Nature Nanotechnology. 5 (10), 712-717 (2010).
Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature methods. 8 (3), 221-229 (2011).
Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. DNA Nanotweezers Studied with a Coarse-Grained Model of DNA. Physical Review Letters. 104 (17), 178101 (2010).
Snodin, B. E. K., et al. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiments. (106), e51272 (2015).
Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. Journal of Visualized Experiments. (99), e52486 (2015).
Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in enzymology. 211, 353-388 (1992).
Kopperger, E., et al. A self-assembled nanoscale robotic arm controlled by electric fields. Science. 359 (6373), New York, N.Y. 296-301 (2018).
Lauback, S., et al. Real-time magnetic actuation of DNA nanodevices via modular integration with stiff micro-levers. Nature Communications. 9 (1), 1446 (2018).

Bioengineering

Tasarım ve Reconfigurable DNA akordeon raf sentezi

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.