Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以开发一个显性负诱导系统, 在其中任何蛋白质可以有条件地灭活, 可逆地过度表达它的控制负极突变版本。
Abstract
显性阴性 (dn) 蛋白抑制是一种强大的蛋白质功能操作方法, 与其他基于基因组的方法相比具有多种优势。例如, 尽管嵌合和Cre-LoxP靶向策略已被广泛使用, 但这些策略的内在局限性 (即泄漏启动子活性、马赛克cree 表达等) 在很大程度上限制了它们的应用。此外, 完全删除许多内源基因是胚胎致死, 因此不可能研究出生后生活中的基因功能。为了应对这些挑战, 我们对早期的基因工程协议进行了重大修改, 并将 rb1 基因的短 (转基因) 版本与溶酶体蛋白酶原酶 b (cb) 结合起来, 生成 rb1 (cbrb) 的 dn 小鼠模型。由于溶酶体蛋白酶的存在, 整个 cb-rb1 融合蛋白及其相互作用的复合蛋白被路由, 以促进蛋白酶体介导的降解。此外, 在转基因结构中存在四环素诱导剂 (rtta) 元素, 使 rtTA 蛋白具有诱导性和可逆性调节。cbrb 小鼠模型中无处不在的 rosa-cag 启动子的存在使其成为进行瞬态和可逆 rb1 基因消融的有用工具, 并为研究人员提供了一种资源, 以了解其在几乎任何表达 rb1 的细胞类型中的活性。
Introduction
大多数针对基因和蛋白质消融的方法依赖于永久过程, 这通常会导致基因、rna 序列或感兴趣的蛋白质 (poi) 的完全消除或截断。该方法的总体目标是设计重组蛋白, 以消除内源性野生型蛋白的功能。我们重新审视并改进了替代策略1,2, 该策略允许通过 dn 抑制临时消融 poi。这种方法适用于多聚肽和单体肽, 但最适合在多聚体组装中发挥作用的蛋白质。
该方法包括将溶酶体蛋白酶 cb 融合到一个亚基的一个多聚类 poi (cb 融合复合体)。由此产生的 cb 融合复合物可以与内源蛋白相互作用并进行蛋白溶解消化, 或将整个 cb-poi 复合体转移到降解的溶酶体3。此外, cb 融合复合物与四环素控制转录激活 (teto) 系统的诱导性质相结合, 可实现可逆转方式的转基因诱导和可控表达。虽然在许多情况下有用, 但在体内完全删除基因或蛋白质会导致致死性 4,5,6。同样, 使用 cre/lox 系统对某些基因或蛋白质进行组织特异性、有条件的删除可能并不简单, 因为它最终会导致关键基因组元素7的永久丢失。因此, 根据基因或 poi 的不同, 这两种方法都不能有效地为后续研究提供有用的模型, 特别是产后后期和成年小鼠的基因或蛋白质功能研究。
为了避免与这些方法相关的问题, 并提供有关该方法有效性的原则验证, 我们选择通过生成视网膜母细胞瘤 1 (rb1) 蛋白的条件 dn 版本来测试此处提供的方法。提出了若干备选方案8、9、10, 以取消内生 rb1 的功能;然而, 他们都面临着一些相同的限制, 上面讨论: 永久的胚系删除 rb1 是胚胎上致命的, 并与它的肿瘤抑制作用, 永久 rb1 条件删除导致各种肿瘤11。尽管 rb1 的 dn 版本似乎不是自然发生的, 但对于目前可用的策略, 更好的替代方案应该允许对内生 rb1 进行时间控制的停用, 并提供一种替代机制, 最终恢复其功能。这种结构的基础在20多年前被描述了1。然而, 由于技术的局限性, 它缺乏控制转基因激活、反应和组织特异性的机制。本研究首次将多西环素 (dox) 依赖转录系统的优雅与溶酶体蛋白酶 cb 和rb1蛋白的工程转基因结构结合起来。由此产生的 cbrb 鼠标模型允许暂时调节 dox 介导的 rb1 规则2。使用这种基于蛋白质的方法来研究基因功能的好处是, 它可以用于任何感兴趣的基因, 而很少有关于其活性的信息。
与传统方法相比, 提出的 dn 转基因策略具有许多优势。首先, dn 蛋白抑制只导致蛋白质活性的部分消融, 从而保持残留的内源性表达。在完全消除蛋白质活性导致胚胎死亡的情况下, 这样的结果是非常可取的, 这极大地限制了任何研究活老鼠基因功能的研究。其次, teto 系统的存在使转基因激活只有在抗生素存在的情况下才能实现, 从而能够有效和可逆转地控制转基因活动。因此, 通过停止抗生素的管理, 转基因系统可以被停用, 正常的 rb1 表达恢复到原状。第三, 转基因表达的特异性可能因选择的启动子而异。虽然我们选择了无处不在的 rosa-cag 启动子进行原理证明, 但将转基因置于组织特异性启动子之下可能会限制不需要的转基因表达, 并有助于对这种转基因的治疗应用的研究方法。
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Protocol
转基因 cbrb 小鼠的生成以及与这项研究相关的所有动物护理和实验都得到了克雷顿大学机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准, 并由他们的指南进行。
1. 转基因 cb-myc 6-rb1 构建
请注意:cbrb 在多步骤过程中克隆为 pet _ splice 载体 (图 1 a 和1 b)。
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执行第一阶段克隆到 pCS2+CB-myc6 载体。
- 为了创建 cbrb 转基因结构, 使用以下引物集扩增 rb1 蛋白的1583-b 长rb1 cdna 片段 (与氨基酸区369-896 相对应的528氨基酸): 对于 ecori + rb 1243 f, 使用 gggagattca对于xbai + ecorv + rb 2826 r, 使用 cccttatatttta ttggggggttttttttcc.
- 克隆在 pCS2+CB 的ecorr1和xbai限制站点之间生成的片段 (1546 bp)-mec6 向量, 如前面所述的1,12。
注: 融合在rb1片段中的1012-bp-bp-my6 结构 (337 氨基酸) 产生了约865个氨基酸 (约 108 kda) 的蛋白质, 比内源性 rb1 蛋白 (~ 110 kda) 略小 (图 1 )a), 在 n-denml和c-denml 处带有 cb-myc 6 标记。
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执行第二阶段子克隆到 pteet-splice 向量。
- 为了放大 cb-rb-myc6 融合碎片并获得 tet-to28, 使用含有 ecrov 的引物 (xbai + ecorv + rb 2826r) 和 sali站点放大由 cb-myc6-rb1 组成的盒式磁带, 用于 sali +cb, 使用 cccagacaggatggggggggggttgatccttc。
- 将生成的片段 (2567 bp) 分入 sali 和ecorv限制位点之间的 pteet-splice 载体, 使整个 teto-dn-cb-myc6- rb1转基因, 包括 sv40 内部和多聚 a 信号,可以通过一个单一的消化与noi分离 (图 1b)。
注: noi 片段用于生成转基因资助者。
2. teto-dn-cb-myc6-rb1 转基因的体外检测
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dox-toxs 调节: NIH3T3 细胞系
请注意:除非另有说明, 所有卷都已调整为6孔板。- 按照供应商的规格生长 NIH3T3 细胞, 使用推荐的细胞培养培养基, 在37°c 下含有10% 的胎儿牛血清, 并使用10% 的 co2。
- 用 petet-sp联会和 pcmv-et看待3g 矢量 (从步骤 1) 共同对细胞进行 24小时, 按照下面提到的步骤进行同转染。
- 在室温下, 将基于脂质的转染试剂井和不完全 (无血清) dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 的2–4μl 混合5分钟。对于12、24孔板, 分别使用250或500μl 培养基, 并相应调整转染试剂体积。
- 在转染重组-dmem 中加入2-3 微克的质粒 dna 井, 在室温下孵育20分钟。
- 在每口井中加入含有 dna 的混合物和转染试剂。孵育3-4小时后, 加入1毫升的完整培养基 (使最终体积为 2 ml/well)。保持多克斯库存的等价物 (1 mg/ml), 并在每口井中添加 2μl (+ dox)。用5% 的 co2 在37°c 下培养细胞.
请注意:控制样本应包括未使用 dox (-dox) 处理的共同转染细胞, 以及仅使用转化剂 pcmv-et3g 载体转染的 NIH3T3 细胞, 并用 dox 进行24小时处理。对于 pcmv-ett3g, 0.1μg/ll dox 的浓度应足以诱导转基因表达。
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使用 hek293 细胞系测试结构的可逆性。
- 为了测试tet-dn-cb-myc6-rb1转基因细胞的可逆性, 按照供应商的规格在鹰的最小基本培养基 (emem) 中培养 hek293 细胞, 并与 ptet-splice 和 pcmv-et3g 载体进行24小时的辅酶连接, 如下所述(步骤 2.1.2)。
- 对于转基因失活, 在24小时后取出含有多克的培养基, 用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞 2x–3x, 并在无多克培养基中孵育24小时。
请注意:去除多克后, 应在24小时内恢复转基因失活和正常蛋白表达。
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为了评估teto-dn-cb-myc6-rb1结构在促进计划外细胞增殖方面的功能, 请使用 hei-oc1 细胞系进行功能分析, 如下所述。
- 在允许条件下 (33°c, 10% co 2) 在 10% dmem 中培养 hei-oc1细胞。对于细胞增殖研究, 使用细胞计数器和板 10, 000 hei-oc1 细胞在96孔板上的200μl 体积计数。将细胞连夜孵化。
- 第二天, 使用基于脂类转染试剂的 pte-splice 和 pcmvi-tet3g 矢量进行瞬态协变 (请参阅步骤 2.1.2)。在单独的井中, 使用基于脂质转染试剂 (步骤 2.1.2) 进行 pmr-zsgregre1转染, 以计算转染速率。使用未转染的细胞作为对照。
- 在荧光显微镜下检测转染细胞经转染24小时后是否存在绿色荧光 (励磁 = 485 nm, 发射 = 530 nm)。记录是否存在绿色荧光, 并计算转染率作为 transfection 阳性细胞 (转染细胞) 的总数在标记为 dapi (总细胞) 的细胞的总数。
请注意:我们估计转染率约为70%。 - 为了诱导转基因表达, 在转染细胞的子集中添加 1μg/ml dox, 同时使用另一个子集作为对照 (-dox)。使用未经处理的 hei-oc1 细胞作为附加对照。
- 要评估细胞增殖, 请根据制造商的协议使用细胞增殖试剂盒。
- 简单地说, 转染48小时后, 取出细胞培养基, 在微板的每口井中加入100μl 的1x 染料结合溶液。在37°c 下孵化1小时。
- 此后, 使用荧光微板读取器 (激发 = 485 nm, 发射 = 530 nm) 测量每个样品的荧光强度。
- 为了进一步评估细胞增殖使用免疫细胞化学, 将 hei-oc1 细胞放在12孔板的盖板上, 并在37°c 下孵育过夜。
- 第二天, 与 ptet-spice 和 pcmv-et3g 进行辅转转, 并执行 dox 处理 (+ dox)。使用未转染的单元作为控件。处理 hei-oc1 细胞的 ki-67 标签。
- 在 pbs 中固定4% 的甲醛 (pfa) 细胞, ph 7.4, 在室温下固定10分钟。用冰凉 pbs 清洗细胞 3倍, 并在 pbs 中用0.25% 的非离子洗涤剂孵育细胞10分钟。
- 再次清洗细胞, 在 pbs 中清洗 3倍 5分钟, 并在室温下在加湿室内用10% 的血清阻止1小时。
- 在室温下将细胞在500μl 的 ki-67 原代抗体 (1:200 稀释) 中培养 3小时, 或在4°c 下过夜。
- 用 pbs 清洗细胞 3倍, 5分钟。之后, 在室温下在黑暗中用二级抗体孵育细胞1小时。
- 取出二级抗体溶液, 用 pbs 清洗细胞 3x, 在黑暗中各清洗5分钟。
- 对于 phalloidin 标记, 在 1:200 phoiidin 中孵育 hei-oc1 细胞30分钟。要给细胞的细胞核贴上标签, 在室温下用 5μgml dapi 孵育细胞10分钟。
请注意:确保吡格胺染料共轭不同于二级抗体共轭。
3. 产生 cbrb+/rosa-cag-rtta+ (cbrb) 转基因小鼠和 dn-cbb 方法的活体测试
- 在证实了 teto-dn-cb-myc6-rb1转基因的有效 dox 调控后, 纯化了诺吉片段并将其微注入到鼠合子中, 这些受杀女性随后被转移到伪怀孕的雌性中。
请注意:这些程序是在内布拉斯加州大学医学中心 (m科员) 小鼠基因组工程核心设施进行的。 - 分娩后, 使用cb-rb1融合区域特有的引物集对幼崽进行基因型: 对于 cbrb f, 使用 5 ' ctggggcatgattaggtgtggggg 3 ', 对于 cbrb r, 使用 5 ' gttctgggccattacacacacacacacacac3'。
请注意:琼脂糖凝胶上观察到的 pcr 产物尺寸为 401 bp (60-bp cb 区域 + 341-bp rb1区域 (表 1)。根据teto-dn-cb-myc6-rb1转基因的存在, 确定了10条独立的创始人线。在其中的5条线路中, 后代继承了转基因, 这证实了转基因的种系传递。其中一条转基因线最终被用来建立和维护这条线, 并产生实验性的 teto-dn-cb-myc6-rb1动物进行进一步研究。 - 将成年的 teto-dn-cb-myc6-rb1小鼠培育 rosa-cag-rtta 四环素诱导线 (库存 #006965) (或者, 培育成 tta 诱导剂线), 以产生实验性的 dn-cbrb 小鼠. 使用以下引物集对这一交叉的后代进行基因型: 对于 rtta-wt, 使用 ggagggggggagaagggattg;对于 rtta 突变体 r, 使用 gggagagtttcctcaacc;对于 rtta 通用, 请使用 aagtgccctggagtttat。pcr 产品的尺寸为 340 bp (突变体)、340 bp 和 650 bp (杂合 gote) 和 650 bp (野生型)。
- 在 dox 治疗后生成 rb1 蛋白的剂量-反应曲线, 以确定获得转基因表达所需的 dox 治疗的时间和长度。
请注意:本实验采用西印迹和 qrt-pcr 方法对组织特异性转基因激活和 rb1 表达进行了评价。 - 进行荧光原位杂交 (fish), 以确认转基因的基因组插入。
请注意:这项工作是在病童医院应用基因组学中心 (加拿大多伦多) 进行的。elisa 或西方印迹 (使用蛋白质特异性抗体) 可用于评估转基因激活、组织特异性和内源性 poi 水平的变化。对于dn-cb-myc6-rb1结构, 我们使用了抗 rb1 抗体。
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Representative Results
通常, 设计 dn 突变需要大量有关 poi 结构和功能的信息。相反, 在 poi 的结构和功能信息有限的情况下, 此处介绍的 dn 策略特别有用。如果 poi 是一种多细胞蛋白, 将一个亚基与溶酶体蛋白酶结合起来, 可以通过内源性亚基的蛋白溶解和细胞亚分流的组合, 主要抑制组装的多聚体, 并可能抑制其他配体。莫蒂默的溶酶体。为验证多克调控转基因激活的成功克隆和有效性, 将含有teto-dn-cb-myc6-rb1结构的纯化 pte-spil 质粒转染小鼠 NIH3T3 细胞, 稳定表达 rtta蛋白质, 但不是 rb113。在没有 dox 的情况下, 表示 rtta 的细胞没有显示 rtTA 表达式, 而在 dox 存在的情况下观察到一个强大的 rtTA 表达式 (图 2a)。其次 , 为了测试系统的可逆性 , 我们将 hek293 细胞 ( 内生表达rb114) 与纯化的 petet - / teto - nc - mmyc6 -rb1和 pcmv - ett3g 矢量进行了交换。如预期的那样, 细胞培养培养基中添加 dox 可显著抑制内源性 rb1 蛋白的表达对转基因激活的影响 (图 2b)。为了测试系统的可逆性, 在24h 周期之后, 在 hek293 细胞的子集中, 我们用新鲜的无 dox 培养基取代了含有 dox 的细胞培养基, 并将细胞孵育24小时。从区域性介质中删除 dox 时恢复了表达式 (图 2b)。未使用 dox 或 dox 处理的 hek293 细胞仅用 pcmv-etet3g 载体转染的转染 hek293 细胞 (图 2b) 显示了 rb1 表达的基础水平。由于 NIH3T3 细胞不能自然表达 rb1 蛋白, 因此 rb1 的正反应性是由于转基因 rb1 蛋白的积累造成的。鉴于我们对teto-dn-cb-myc6-rb1结构在听觉系统中的潜在增殖效应的兴趣, 我们测量了 pet-dne-dnc-mc6-rb1-和 pcmv-3g-转染的 hei-oc-co1 细胞中的总 dna 含量 (在 dox 存在和不存在的情况下, 腐蚀衍生细胞系的内耳器官)。与这里提出的工作假设一致, 在经过 dox 处理但未得到治疗 (对照) 的 hei-o算氏细胞中, dna 含量显著增加 (相当于细胞数量的增加) (图 3a-3c ) ).
在对转基因活性和功能进行体外确认后, 建立了转基因小鼠模型。fish, 使用teto-dn-cb-myc6-rb1 digoxigenin (dig)-马萝卜过氧化物酶 (HRP)/tyramine-biotin/avidin-Cy5-labeled 探针, 以及男性小鼠脾细胞和耳成纤维细胞的 g 带, 以确认在转基因小鼠基因组。在五个细菌传播创始人中, 第14行显示了在10C3~D2 段内的一致转基因插入 (图4a-4c )。这条线路上的老鼠被用来建立繁殖群体, 并产生实验动物进行进一步研究。为了确定 dox 诱导和teto-dn-cb-myc6-rb1转基因激活的最佳时间, 我们将转基因小鼠分为三组, 其中 dox 在饮用水中的施用时间变长:第1组(3天治疗)、第2组(7天治疗) 和第3组(治疗 10天)。治疗完成后, 用西方印迹法评估 rb1 蛋白表达的变化 (图 5a-5d )。因为 dn 和原生 rb1 蛋白具有相似的分子量, 所以它们不能在西方印迹上相互解析。然而, 与 rb1 蛋白的初始增加一致 (由于 dn-rb1 和内源性蛋白质的积累), 与对照组相比, 转基因小鼠耳蜗中 rb1 蛋白的总表达有初步增加 (图 5) 。此外, 与teto-dn-cb-myc6-rb1转基因产物的抑制和蛋白溶解活性一致, 在第2组和第3组中观察到, 与第1组和对照组相比, rb1 表达可量化下降 (图 5a-5d ). 值得注意的是, 超过10天的治疗并没有导致 rb1 蛋白表达的任何进一步变化。因此, 10天的 dox 治疗被认为是最佳的, 并用于进一步的研究。
由于 rtta 和teto-dn-cb-myc6-rb1转基因激活在无处不在的 rosa-cag启动子下, rtTA 在任何组织或细胞中都可能受到抑制, 而 rtTA 是内生表达的组织或细胞 (如肺、心脏、视网膜)。为了测试和评估转基因组织的特异性, 从teto-dn-cb-mc6-rbrorog-cung-rtta 中解剖了耳蜗、肺、心脏和眼睛活检, 并控制小鼠 (不携带rosa-cag-rtta转基因)。评估为 rb1 表达式 (图 6a-6c ). 无论分析的组织是什么,在 teto-dn-cb-cb-myc6-rbryro9-cag-rtta中观察到 rb1 蛋白显著减少, 但在对照组没有观察到 (图 6a)。与此形成鲜明对比的是, qrt-pcr 对 dox-dn-cb-myc6 和年龄匹配的对照小鼠的眼睛、心脏和耳蜗的分析显示, dn-cbb 转录在前者的组织中显著增加, 而不是(图 6c)。总之, 这些结果证实了结构的效率。转录表达的增加反映了 doxc 调控的转基因诱导的有效性。同样, 蛋白质表达的减少与内源性 rb1 的路由和蛋白溶解降解是一致的。
图 1: cbrb 的多步克隆和诱导 teto-dn-cb-myc6-rb口感-rbr-cag-rtta 的生成.(a) 本面板显示rb1片段克隆到pcs2-cb-myc6载体中的情况。利用EcoRI+RB1243正向和反向引物 Xba+EcoRV+RB2826 pcr 扩增了 1583-bp -bp基因产物。在含有 cb-myc6 构造的 pcs2 向量的ecri和xbal约束位点之间克隆出 rb1片段, 以生成pCS2+CB myc6+Rb1载体。(b) cb-myc6+Rb1片段被克隆到sali和ecorrv限制位点之间的ptetsplice载体中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:doc 调控转基因激活的有效性.(a) NIH3T3 细胞通常不表达 rb113。在证实teto-dn-cb-myc6-rb1结构的有效激活后, 通过对抗 rb1 抗体的西方印迹分析发现, 在 dox (1号和3号车道) 存在的情况下, 但在没有 (2号和4号车道) 的情况下, rb1 表达是稳健的。(b) hek293 细胞内源性表达 rb114, 与teto-dn-cb-myc6-rb1和 pcmv-etet3g 转导载体共同转染。在没有 dox (车道 1) 的情况下, 观察到一个正 rb1 表达。在系统中加入 dox 导致了 teto-dn-cb-myc6-rb1激活和 rb1 向下调节 (车道 2)。在 dox 从媒体 (车道 3) 中删除后24小时恢复 rb1 表达式。c = 对照, 未转染的 hek293 细胞未使用 dox 处理。这是一个最初发表在《细胞神经科学前沿》杂志上的数字的改编。它的复制符合frond对付关于作者版权保留的政策。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: doxc 介导的 dn-cbb 转基因激活可促进细胞增殖.(a) hei-oc1 细胞与纯化的 teto-dn-cb-myc6-rb1和 pcv-tet3g 载体同皮转染, 在没有 (-) 或存在 (+) 的情况下培养。细胞增殖是在转染48小时后使用增殖试验确定的。以未转染细胞为对照, 利用荧光值的变化计算了增殖的百分比变化。在 dox 治疗后, 转染细胞数量略有但显著增加。相反, 未用 (-) dox 处理的经转染的 hei-oc1 细胞与未转染对照之间没有明显变化。(b) hei-oc1 细胞未转染或 (c) 与纯化的 teto-dn-cb-myc6-rb1 和在 dox 存在 (+) 中培养的 pcmv-ett3g 载体共转染后, 标记为 ki-67 (红色), phalloidin (绿色) 和 dapi (蓝色)。* p < 0.05。刻度杆 = 10μm。这是一个最初发表在《细胞神经科学前沿》杂志上的数字的改编。它的复制符合frond对付关于作者版权保留的政策。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 荧光原位杂交 (fish) 确认teto-dn-cb-myc6-rb1转基因基因的基因组插入.pcs2-cbrb (digoxigenin probe/抗 digoxigenin tycobitindibitindinybiotindi-cy5, 用红色) 试验探针与脾细胞和耳成纤维细胞中期杂交, 以确定是否能检测到一个单片靶点插入大小为 2.5 kb 的探针信号。pcs2-cbb 测试探针与明亮的双别探针信号杂交到一个10号染色体上, 显示teto-dn-cb-myc6-rb1转基因在10c3-d2 段内插入。rp23-267g24 (光谱绿色) 控制探针如预期的那样在10a1 波段杂交到10号染色体, 并证实感兴趣的 cbrb dna 插入到10号染色体中。(a) 这个面板显示 g 波段中期。(b) 此面板显示了来自同一中期的 ty卷入信号放大 (tsa) fish 图像, 如面板a所示。(c) 该面板显示10号染色体的合成图像, 显示 (1) g 带、(2) tsa fish 和 (3) tsa fish 与倒置 dapi 条带。红色 = pcs2-cbb 探头;蓝色 = dapi 条带;绿色 = rp23-267g24 控制探头。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5出生 (p) 36 teto-dn-cb-mc6-rbrog-ceg-rtta+ (cbb +) 和 rosa-cag-cadtta + (cbl-rtta-) 3 (第1组) 后小鼠内耳的dna-cb-cprb转基因激活, 7 (第2组) 和 10天 (第3组) dox 的治疗.(A-C)抗 rb1, 它与高磷酸化和低磷化形式的 rb1 反应, 以及抗 c-myc 抗体被用于检测。利用 imagej 软件进行了密度测量分析。将得到的相应值归一化为负对照 cbb-( -), 再归为β-肌动蛋白。每个污点下方都显示了相对 rb1 表达式级别。(d)针对不同处理绘制的归一 rb1 表达式水平的图形表示突出了 cbrb+ (+) 样本中持续较低的 rb1 检测。西方印迹凝胶上的每一条车道和图形上的每一列都对应于不同的个体。* p < 的数字最初发表在《细胞神经科学前沿》杂志 2上。它的复制符合frond对付关于作者版权保留的政策。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: pto-dn-cb-mc6-rbterrosa-cag-民泰转基因激活 p18 teto-dn-cb-mycc 中的空间分析6-rbrosa-cag-rtta+ (+) 和 dn-cbb+/rosa-cag-rtta-阴性对照 (-) 小鼠心脏、眼睛、肺和耳蜗。(a) 确认 dox 介导的转基因激活的效率, 在 cbrb+/rosa-cag-rta+组织中降低了 rb1 的表达, 但在负对照小鼠组织中没有下调。如图 5所示, 进行了密度测量分析。每个污点下方都显示了相对 rb1 表达式级别。(b) 此面板显示针对不同组织绘制的归一化 rb1 表达水平的图形表示。内源性 rb1 水平的个体间变异可能解释了个体对转基因激活和 rb1 下调反应的差异。(c) 眼睛中的 rt-pcr 分析, 心脏和耳蜗揭示了在 dox-dn-cb-mc6-mci-rtta + 组织中的 teto-dn-cb-mc6-cag-rtta 等组织中的 teto-dn-cb-mc6-cartta . 在 dn-cbb+/rosa-cag-rttt-阴性对照组。cbrb+/rtta+ = teto-dn-cb-myc6-rbtrosa-cag-rtta+;/rtTA rtta+ = rosa-cag-rtta+;* p < 0.05。这个数字最初发表在《细胞神经科学2的前沿》杂志上。它的复制符合frond对付关于作者版权保留的政策。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1: pcr 条件, 用于检查cb-rb1融合区域.
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Discussion
为了规避与传统转基因策略相关的限制, 我们试图生成一个鼠标模型, 在这种模型中, 内源性 poi 可以通过以时空方式过度表达 dn 突变形式来有条件地失效。为了消除内生 poi 的功能, 提出了几个备选方案15、16、17。我们已经修改了早期的遗传策略1 , 结合了 dox 依赖转录系统, 以一个简单的策略, 利用溶酶体蛋白酶 cb 的融合, 产生突变肽, 其表达影响表达内生 poi2。最重要的是, 这种技术不需要事先了解与 poi 相关的路径。目前 dn 蛋白抑制的策略表明, cbrb 融合基因上的溶酶体定位信号将整个 rb 相互作用的复合体转移到溶酶体 2,3。一旦进入溶酶体, 这些蛋白质的蛋白溶解处理就会启动, 导致它们的降解3。cb 融合蛋白的内在特性与 teto 系统的可逆诱导相关, 使其成为传统转基因策略 (例如, 完全基因敲除、有条件删除) 的有用替代方法, 尤其是当完全删除感兴趣的基因是不可取的。
我们最初的研究重点是 rb1 蛋白。dn 突变最容易在作为二聚体或多聚体的蛋白质中描述。到目前为止, 还没有证据表明 rb1 分子之间存在直接的物理相互作用。尽管如此, 其活动的固有性质允许在给定时间在同一复杂中存在多个 rb1 分子。例如, 低磷化 rb1 与 e2f1-dp 杂二聚体的结合提供了一个额外的结合位点, 通常由组蛋白去乙酰化酶 (hdac)18、19、20占据。另一方面, hdac1 与 rb1 进行物理交互, 而这一复合体又与 e2f1-dp-rb1 异位体结合, 从而提供额外的转录抑制18。按照这种方法, 如果组中至少有一个 rb1 分子是 dn 突变体, 它将防止复合物抑制转录, 同时降低内源性 rb1 的水平, 从而产生 rb1-空表型。在这里, 在饮用水中给药后10天观察到内源性 rb1 抑制。然而, 可能需要为每个系统根据经验确定 dox 诱导的最佳剂量。此外, 由于大多数rb1基因序列用于构造构成, 因此即使在没有内源性 rb1 的情况下, 突变 rb1 也有可能与 rb1 的任何结合伙伴相互作用并引发 dn 抑制。这一前提可以通过评估已知 rb1 结合分子的表达水平来测试。
急需的、精细调节的时间蛋白和可逆蛋白失活将为在更多的研究领域开展广泛的研究提供基础, 以揭示潜在的复杂生化机制基因和蛋白质的各个方面。根据 poi 的不同, 了解其分子复杂性可能会提高研究人员设计成功治疗策略的能力。通过将 dn 小鼠培育到驱动 tta 或 rtta 系的组织特异性启动子, 可以提高转基因特异性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
pCS2+CB-myc6 向量是马歇尔·霍维茨 (华盛顿大学, 西雅图, 美国) 的礼物。hei-oc1 细胞由 fedrico kalinec (david geffen 医学院, ucla, los angeles, ca, usa) 提供。地雷行动中心小鼠基因组工程核心 (c. b. gurumurthy, don harms, rolen quadros) 和 creighton 大学生物医学综合成像设施 (richard hallworth, john billheimer) 提供了技术支持。m科员部队小鼠基因组工程得到了 NIH/NIGMS 颁发的机构发展奖 (ida) 的支持, 该奖项编号为 p20 GM103471。综合生物医学成像设施得到了克雷顿大学医学院的支持, 并从 nih/iggms 获得了 gm103427 和 gm110768。该设施是在国家研究资源中心 (rr016469) 和 nigms (gm103427) 的赠款支持下建造的。这项研究中产生的老鼠线维持在克里顿大学的动物资源设施, 该基金的基础设施通过 nihx/ncrr g20r024001 的赠款得到改善。这项工作得到了过去的支持, 得到了 nihxcr 5p20r01888-nhhmnigms 8p20gm103471 cobre 赠款 (向 shelley d. 史密斯)、nih/orip r21od01975-01a1 (s. m. r.-s.) 和听力健康基金会 (至 s. tarang) 的一笔新兴研究赠款。这项研究的内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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