Summary
Aquí se describe un protocolo para expresar proteínas en protoplastos mediante método de transformación mediada por PEG. El método proporciona fácil expresión de proteínas de interés y eficiente investigación de localización de la proteína y el proceso de importación para las varias condiciones experimentales en vivo.
Abstract
El cloroplasto es un organelo esencial que es responsable de varios procesos celulares en plantas, tales como la fotosíntesis y la producción de metabolitos secundarios y lípidos. Cloroplastos requieren una gran cantidad de proteínas para estos diversos procesos fisiológicos. Sobre el 95% de las proteínas del cloroplasto son codificadas por el núcleo e importado en cloroplastos desde el citosol después de traducción en los ribosomas citosólicas. Así, la correcta importación o focalización de estas proteínas codificadas por el núcleo cloroplasto cloroplastos es esencial para el buen funcionamiento de los cloroplastos y la célula de la planta. Las proteínas codificadas por el núcleo cloroplasto contienen secuencias de la señal para el objetivo específico a cloroplastos. Maquinaria molecular localizada en el cloroplasto o citosol reconocer estas señales y llevar a cabo el proceso de importación. Para investigar los mecanismos de importación de proteínas o targeting a cloroplastos en vivo, se desarrolló un método rápido y eficiente basado en el protoplasto para analizar proteínas importación en cloroplastos de Arabidopsis. En este método, utilizamos protoplastos aislados de tejidos de la hoja de Arabidopsis. Presentamos un protocolo detallado para que el uso de protoplastos para investigar el mecanismo por el cual las proteínas son importadas en cloroplastos.
Introduction
El cloroplasto es uno de los orgánulos más importantes en las plantas. Una de las principales funciones de los cloroplastos es llevar a cabo fotosíntesis1. Cloroplastos también realizan muchas otras reacciones bioquímicas para la producción de ácidos grasos, aminoácidos, nucleótidos y numerosos metabolitos secundarios1,2. Por todas estas reacciones, cloroplastos requieren un gran número de diferentes tipos de proteínas. Sin embargo, el genoma del cloroplasto contiene sólo aproximadamente 100 genes3,4. Por lo tanto, cloroplastos deben importar la mayoría de sus proteínas desde el citosol. De hecho, la mayoría las proteínas del cloroplasto fueron demostradas para ser importadas desde el citosol después traducción4,5,6. Las células vegetales requieren mecanismos específicos para importar proteínas desde el citosol a cloroplastos. Sin embargo, aunque estos mecanismos de importación de proteínas han sido investigados durante las últimas décadas, todavía no completamente entendemos a nivel molecular. Aquí, ofrecemos un método detallado para la preparación de protoplastos y exógeno expresar genes en protoplastos. Este método podría ser útil para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes la importación de la proteína en cloroplastos en detalle.
Importación de proteínas se puede estudiar con muchos enfoques diferentes. Uno de estos métodos implica el uso de un in vitro proteína importación sistema7,8. Usando este acercamiento, en vitro-precursores de la proteína traducida se incuban con cloroplastos purificados en vitro, y se analiza la importación de proteínas por SDS-PAGE seguido por análisis de western blot. La ventaja de este enfoque es que se puede estudiar en detalle cada paso de la importación de la proteína en cloroplastos. Por lo tanto, este método ha sido ampliamente utilizado para definir los componentes de la maquinaria molecular de la proteína importación y diseccionar la información de la secuencia de péptidos de tránsito. Más recientemente, otro enfoque que implica el uso de protoplastos de tejidos de la hoja fue desarrollado y ha convertido en ampliamente utilizado para el estudio de importación de la proteína en cloroplastos9,10. La ventaja de este enfoque es que los protoplastos proporcionan un entorno celular que está más cercano de la de las células intactas que el sistema in vitro . Así, el sistema de protoplasto nos permite abordar muchos aspectos de este proceso, tales como los eventos asociados citosólicas y cómo se determina la especificidad de las señales de orientación. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el uso de protoplastos para estudiar proteínas importación en cloroplastos.
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Protocol
1. crecimiento de las plantas de Arabidopsis
- Preparar 1 L Gamborg B5 (B5) medio al añadir 3,2 g de medio de B5 incluyendo vitaminas, 20 g de sacarosa, 0,5 g de 2-(N-morpholino) etano sulfónico ácido (MES) a aproximadamente 800 mL de agua desionizada y ajustar el pH a 5.7 con hidróxido de potasio (KOH). Agregue más desionizada agua llevar el volumen a 1 L. Añadir 8 g de phytoagar y autoclave por 15 min a 121 ° C.
- Permitir que el medio se enfríe a 55 ° C y vierta 20 – 25 mL del medio B5 en una placa Petri (9 cm de diámetro, 1,5 cm de altura) en un banco limpio. Secar las placas durante 2 – 3 días paquete con envoltura limpia y mantenerlos en el refrigerador hasta su uso.
- Thaliana de Arabidopsis de esterilizar semillas con 1 mL de etanol al 70% (v/v) en un tubo de centrífuga (e-tubo) agitando continuamente durante 2 – 3 minutos quite el sobrenadante, agregar 1 mL de solución de hipoclorito de sodio al 1% (v/v) y agitar continuamente durante 2 – 3 minutos preparar 100 – 150 semillas por caja Petri.
- Eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con 1 mL de agua destilada. Repita este paso x 4. Coloque las semillas esterilizadas a 4 ° C por 3 días sincronizar la germinación de la semilla.
- Sembrar semillas de 100 – 150 en B5 placas utilizando una micropipeta y sellar la placa con cinta quirúrgica.
- Cultivar plantas en un cuarto de crecimiento con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h a 8 h 100 μmol·m-2·s-1 de luminosidad, humedad relativa de 70% y temperatura de 20 ° C durante 2 semanas.
2. preparación del plásmido
Nota: Deben utilizarse plásmidos de alta pureza para la transformación; se recomienda el uso de un kit de purificación de plásmidos comerciales.
- Purificar el plásmido (RBC-nt:GFP) usando un kit de aislamiento de ADN. Para concentrar el ADN, realizar la precipitación del etanol en un tubo de 1,5 mL y disolver el precipitado de DNA en 100 μl de agua destilada. Determinar la concentración del plásmido utilizando un espectrofotómetro a 260 nm. Diluir el plásmido a una concentración final de ~ 2 μg / μl. no el plásmido a-20 ° C hasta su uso.
3. aislamiento de protoplastos
- Preparar las siguientes soluciones.
- Preparar la solución de enzima para contener macerozyme 0.25% (p/v), 1.0% (w/v) celulasa, 400 mM D-mannitol, 8 mM cloruro de calcio (CaCl2), 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y 5 mM MES. Ajustar el pH a 5.6 con KOH.
- Filtrar la solución enzimática utilizando una unidad de filtro de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0.45 μm. Alícuota 25 mL de la solución de enzima en tubos cónicos de 50 mL y guardar a-20 ° C. Descongelar la solución de enzima a temperatura ambiente (RT) y mezclar bien antes de usar.
- Preparar una solución de sacarosa de 21% (p/v) disolviendo 21 g de sacarosa en 100 mL de agua desionizada y autoclave la solución.
- Preparar solución de W5 para contener 154 mM cloruro de sodio (NaCl), 125 mM CaCl2, 5 mM de cloruro potásico (KCl), glucosa 5 mM y 1,5 mM MES. Ajustar el pH a 5.6 con KOH y autoclave la solución.
- Preparar solución de MaMg a contener 400 mM D-mannitol, 15 mM cloruro de magnesio (MgCl2) y 5 mM MES. Ajustar el pH a 5.6 con KOH y autoclave la solución.
- Preparar 1 M D-mannitol y 1 M de nitrato de calcio soluciones stock para hacer la solución de PEG. Autoclave de estas soluciones.
- Preparar la solución de enzima para contener macerozyme 0.25% (p/v), 1.0% (w/v) celulasa, 400 mM D-mannitol, 8 mM cloruro de calcio (CaCl2), 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y 5 mM MES. Ajustar el pH a 5.6 con KOH.
- Tejidos de la hoja intacta de 2 semanas de edad las plantas de la cosecha ~ 1 – 2 B5 placas usando un cuchillo quirúrgico y lugar las hojas cosechadas en una 50 mL cónico del tubo que contiene 25 mL de solución de enzima. Coloque el tubo cónico que contiene los enzima solución hoja los tejidos y horizontalmente en un agitador rotatorio con agitación suave en la oscuridad. Se tarda de 8 a 12 h para la completa digestión de los tejidos de la hoja.
- A las 8-12 h después de la incubación, verter la solución de enzima (contiene protoplastos de tejidos de la hoja) en una placa Petri fresca a través de una malla con 140 μm tamaño de poro. Cuidadosamente la solución de enzima que contiene protoplasto sobre 15 mL de solución de sacarosa de 21% (w/v) de la capa y centrifugue a 98 x g por 10 min con la configuración de aceleración y desaceleración más bajo en un rotor que hace pivotar-cubo.
- Utilizando una pipeta Pasteur, cuidadosamente transferir los protoplastos de la capa superior (solución de enzima) y en la interfase entre la solución de enzima y la solución de sacarosa a un tubo cónico de 50 mL que contenga 30 mL de solución de W5. Centrifugar este tubo a 51 x g durante 6 minutos. En esta etapa, protoplastos estará en el sedimento en el fondo del tubo cónico.
- Descartar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta sin perturbar el pellet de protoplastos. Añadir 25 mL de solución de W5 y resuspender suavemente los protoplastos. Incubar la solución protoplasto en el refrigerador de 4 ° C durante al menos 1 h para la estabilización.
4. protoplasto transformación utilizando polietilenglicol
- Preparar un 40% PEG solución mediante la adición de 4 g de PEG 8000, 4 mL de solución de manitol de 1 M, 1 mL de 1 M de Ca (NO3)2y 1,8 mL de agua destilada en un tubo cónico de 50 mL y mezclar bien. PEG se disuelven por calentamiento en un horno de microondas de 20-30 s. lugar 40% solución de PEG en RT para refrescarse.
Nota: El 40% PEG solución se prepara fresco cada vez. Si protoplastos no están peleteados completamente durante la incubación de 4 ° C en el refrigerador, centrífuga el material a 46 x g durante 2 minutos. - Quite el sobrenadante con cuidado pero completamente y agregar solución de MaMg para la pelotilla de protoplasto para producir la concentración de 5 x 106/ml.
Nota: El número de protoplasto se puede determinar por un hemocitómetro vista bajo un microscopio. - Lugar 10 μg de plásmido ADN cada vacío 13 mL tubo de fondo redondo y añadir 300 μL de solución de protoplasto con una pipeta.
Nota: El extremo de la punta de la pipeta debe cortarse. Cuando se muestrean protoplastos, la solución que contiene protoplasto debe suspendida antes de pipeteo para que el mismo número de protoplastos se agrega a cada tubo. - Mezclar el plásmido de DNA con protoplastos girando suavemente los tubos y añadir 300 μL de 40% solución de PEG con una pipeta. Mezcle suavemente pero completamente girando los tubos e incubar 30 min a temperatura ambiente; inclinar el tubo casi horizontalmente y girarlo varias veces.
- Añadir 1 mL de solución de W5 y mezclar suavemente pero completamente girando el tubo con la mano de una manera similar. Incubar la muestra durante 10 min a temperatura ambiente.
- Repita este paso dos veces más utilizando 1,5 mL y 2 mL de solución de W5, respectivamente. Incubar durante 30 min después de la última adición de solución de W5.
- Centrifugue a 46 x g durante 4 min descartar el sobrenadante y añadir 2 mL de solución de W5. Mezclar suavemente pero completamente. Incubar a 22 ° C en una cámara oscura.
5. Análisis de la importación de la proteína en cloroplastos
Nota: Después de la transformación mediada por PEG de protoplastos, tiempo de incubación oscila entre 8 a 24 h.
-
Microscopía de fluorescencia
- Lugar 10 μl de la solución de protoplasto en un cristal diapositiva usando una pipeta con una punta cortada y con cuidado cubrir con un cubreobjetos para evitar dañar los protoplastos.
- Lugar la diapositiva en el escenario de un microscopio de fluorescencia equipado con filtro de excitación/emisión establece para la observación de la proteína verde fluorescente (GFP) y auto-fluorescencia de la clorofila.
- Capturar imágenes con un imágenes de cámara y el proceso de enfriado dispositivo de carga acoplada (CCD) utilizando un software de edición de imágenes para producir imágenes en falso color.
-
Immunoblotting y extracción de proteínas totales
- Preparar el tampón de desnaturalización que contiene dodecylsulfate del sodio de 2,5% (p/v) (SDS) y 2% (v/v) 2-Mercaptoetanol.
Nota: La importación de proteínas en cloroplastos puede cuantificarse midiendo el grado de péptido de tránsito procesamiento mediante el análisis de immunoblot usando anticuerpo anti-GFP. - Transferencia de protoplastos en un tubo de centrífuga y centrifugar a 46 x g durante 4 minutos.
- Quite el sobrenadante y agregar 80 μl de tampón de desnaturalización. Vortex vigorosamente durante 5 s y de añadir 5 x buffer de la muestra de SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 0,5 M TDT, SDS 10% (w/v), azul de bromofenol 0.05% (w/v) y 50% (v/v) de glicerol). Mezclar bien y hervir durante 10 minutos.
- Sujetos de esta muestra de proteína y estándar SDS-PAGE immunoblotting con anticuerpo anti-GFP.
- Preparar el tampón de desnaturalización que contiene dodecylsulfate del sodio de 2,5% (p/v) (SDS) y 2% (v/v) 2-Mercaptoetanol.
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Representative Results
La importación de proteínas en los cloroplastos se puede examinar utilizando dos métodos: microscopía y immunoblot análisis de fluorescencia después de SDS-PAGE-mediado separación. Aquí, utilizamos gr-nt:GFP, una fusión construir la codificación de los residuos del aminoácido N-terminal 79 de glóbulos rojos que contiene el péptido de tránsito fusionado a GFP. Cuando las proteínas son importadas en cloroplastos, las señales de fluorescencia verde de la proteína diana gr-nt:GFP deben combinar con las señales fluorescentes rojo de auto fluorescencia de la clorofila, ya examinadas por microscopía de fluorescencia (figura 1). La estrecha coincidencia de las dos señales indica proteína importación en cloroplastos. A menudo las señales GFP se extienden a lo largo de los cloroplastos o se concentra en el centro de cloroplastos, con débil señales difusas a lo largo de los cloroplastos, dependiendo de la proteína individual. La importación de proteínas se puede confirmar por el análisis de immunoblot usando el anticuerpo de la GFP. Proteínas totales son preparadas a partir de protoplastos y separadas por SDS-PAGE seguido por análisis de Western blot (figura 2). En la mayoría de los casos, dos bandas de proteínas deben observarse en el immunoblot si una proteína estuviera correctamente importada en cloroplastos: la banda superior corresponde al precursor largometraje y la banda inferior de la forma procesada después de la importación en cloroplastos. Debe aumentar la cantidad de la forma procesada de la proteína de una manera dependiente del tiempo. Estos resultados implicarían que la proteína de los glóbulos rojos-nt:GFP se importa en cloroplastos en Arabidopsis protoplastos. Por otra parte, la relación de la forma procesada de la cantidad total de proteínas expresadas (la forma procesada más precursor) puede utilizarse como una medida de la eficacia de la importación. Si es necesario, los cloroplastos pueden ser purificados de protoplastos cuidadosamente sometidas a lisis, y proteínas de la fracción de cloroplasto pueden ser analizadas por western blot para confirmar aún más la importación de proteínas en cloroplastos.
Figura 1. En vivo la localización de GFP fusionada para el péptido de tránsito de los glóbulos rojos a cloroplastos.
Imágenes fueron tomadas 18 h después de la transformación bajo un microscopio de fluorescencia. Verde (un), rojo (b), combinado (c) y brillante (d) las etiquetas indican GFP imagen, imagen de clorofila, una imagen combinada de las dos señales e imagen de campo claro, respectivamente. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Mancha blanca /negra occidental análisis de glóbulos rojos-nt:GFP para investigar la importación de la proteína en cloroplastos.
Extractos proteicos totales fueron preparados a partir de protoplastos y separados por 10% (p/v) de SDS-PAGE seguido por análisis de western blot utilizando anticuerpos anti-GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Proporcionamos un protocolo detallado para el uso de protoplastos de Arabidopsis para estudiar proteínas importación en cloroplastos. Este método es de gran alcance para investigar el proceso de importación de proteínas. Esta técnica simple y versátil es útil para examinar la focalización de las proteínas de carga previsto a cloroplastos. Usando este método, protoplastos están preparados de tejidos de hojas de Arabidopsis11,12 que puede obtenerse de plantas en muchos diferentes etapas de crecimiento desde muy temprano hasta las hojas completamente maduras. Sin embargo, se debe tener cuidado al cultivo de plantas utilizadas para la preparación del protoplasto. Uno debe utilizar plantas muy sanas, como protoplastos preparados a partir de plantas sanas pueden soportar los muchos pasos implicados en la transformación mediada por PEG. Otra precaución importante es usar soluciones frescas. Cambios leves en las concentraciones de las soluciones pueden dañar grandemente los protoplastos, puesto que son frágiles y muy sensibles a la presión osmótica.
Hemos estado utilizando protoplastos para estudiar proteínas importación en cloroplastos9,13,14. Basado en estos estudios, hemos sido capaces de diseccionar los motivos de secuencia en varios péptidos de tránsito. Además, utilizamos protoplastos para identificar las señales de selección (la región positivamente cargada que flanqueaban el c-terminal del dominio transmembrana) de proteínas destinadas a la membrana de la envoltura externa del cloroplasto15. Del mismo modo, utilizamos protoplastos para investigar la importación de proteínas en la mitocondria10. Una vez más, hemos sido capaces de identificar muchos motivos de secuencia crítica en las presequences de proteínas mitocondriales. Además, las proteínas de membrana externa de las mitocondrias también contienen una región positivamente cargada que flanquea el dominio transmembrana como su focalización de la señal15. Estas señales dirigida a compartan un alto grado de similitud en la composición de aminoácidos. De hecho, se mistargeted las proteínas del cloroplasto mitocondria durante en vitro importación experimentos16. Sin embargo, cloroplasto y proteínas mitocondriales son específicamente importadas en su objetivo de organelos en vivo. Así, los protoplastos pueden utilizarse para aclarar los mecanismos subyacentes de cómo objetivo la especificidad se determina entre cloroplastos y mitocondrias.
Protoplastos representan un sistema ideal para el análisis de la importación de proteínas en cloroplastos en vivo. Sin embargo, una salvedad es que los protoplastos pueden ser bajo condiciones de fuerte estrés como hiriendo a estrés. Por lo tanto, no podemos descartar la posibilidad de que dicha tensión puede afectar el proceso de importación. Así, en algunos casos, los resultados deben ser interpretados con precaución cuando se usan protoplastos para experimentos de importación de proteínas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo se llevó a cabo con los apoyos del programa de investigación cooperativo para la agricultura ciencia y tecnología de desarrollo (proyecto no. PJ010953012018), administración de Desarrollo Rural y la beca de la Fundación Nacional de investigación (Corea) financiado por el Ministerio de ciencia y las TIC (Nº 2016R1E1A1A02922014), República de Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
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