Summary
Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.
Abstract
Il cloroplasto è un organulo essenziale che è responsabile di vari processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi e la produzione di molti metaboliti secondari e di lipidi. Cloroplasti richiedono un gran numero di proteine per questi vari processi fisiologici. Oltre il 95% delle proteine del cloroplasto sono nucleo-codificato e importati in cloroplasti dal cytosol dopo traduzione sui ribosomi citosolici. Così, targeting di queste proteine di nucleo-codificato cloroplasto a cloroplasti o l'importazione corretta è essenziale per il corretto funzionamento di cloroplasti, come pure la cellula della pianta. Nucleo-codificato cloroplasto proteine contengono sequenze di segnale per il targeting specifico di cloroplasti. Macchinario molecolare localizzata al cloroplasto o citosol riconoscere questi segnali ed eseguire il processo di importazione. Per studiare i meccanismi di importazione di proteina o targeting per cloroplasti in vivo, abbiamo sviluppato un metodo basato su protoplasti rapido, efficiente per analizzare la proteina importazione in cloroplasti di Arabidopsis. In questo metodo, usiamo protoplasti isolati dai tessuti fogliari di Arabidopsis. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di protoplasti per studiare il meccanismo mediante il quale le proteine vengono importate in cloroplasti.
Introduction
Il cloroplasto è uno degli organelli più importanti nelle piante. Una delle funzioni principali dei cloroplasti è di svolgere la fotosintesi1. I cloroplasti svolgono anche molte altre reazioni biochimiche per la produzione di acidi grassi, aminoacidi, nucleotidi e numerosi metaboliti secondari1,2. Per tutte queste reazioni, cloroplasti richiedono un gran numero di diversi tipi di proteine. Tuttavia, il genoma del cloroplasto contiene solo circa 100 geni3,4. Di conseguenza, cloroplasti necessario importare la maggior parte delle loro proteine dal cytosol. Infatti, la maggior parte delle proteine del cloroplasto sono stata indicata per essere importati dal cytosol dopo traduzione4,5,6. Cellule vegetali richiedono meccanismi specifici per l'importazione di proteine dal cytosol ai cloroplasti. Tuttavia, anche se questi meccanismi di importazione di proteina sono stati studiati per i parecchi decenni passati, ancora non completamente capiamo loro a livello molecolare. Qui, forniamo un metodo dettagliato per la preparazione di protoplasti ed esogenicamente che esprimono i geni in protoplasti. Questo metodo potrebbe essere prezioso per chiarire i meccanismi molecolari alla base di importazione di proteina in cloroplasti in dettaglio.
Importazione di proteine possa essere studiati utilizzando molti approcci diversi. Uno di questi metodi prevede l'utilizzo di un in vitro della proteina importazione sistema7,8. Utilizzando questo approccio, in vitro-tradotta proteine precursori vengono incubati con cloroplasti purificata in vitro, e importazione di proteina è analizzata da SDS-PAGE seguita da analisi western blot. Il vantaggio di questo approccio è che ogni passaggio dell'importazione di proteina in cloroplasti possa essere studiata in dettaglio. Pertanto, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per definire i componenti del macchinario molecolare della proteina importazione e dissezionare informazioni di sequenza per i peptidi di transito. Più recentemente, è stato sviluppato un altro approccio che coinvolge l'uso dei protoplasti da tessuti fogliari e si è diffuso per lo studio di proteine importazione in cloroplasti9,10. Il vantaggio di questo approccio è che i protoplasti forniscono un ambiente cellulare che è più vicino a quella di cellule intatte rispetto al sistema in vitro . Così, il sistema di protoplasti permette di affrontare molti altri aspetti di questo processo, come gli eventi associati citosolici e come viene determinata la specificità dei segnali di targeting. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'uso dei protoplasti di studiare proteine importazione in cloroplasti.
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Protocol
1. la crescita di piante di Arabidopsis
- Preparare 1 L Gamborg B5 (B5) medio aggiungendo 3,2 g di B5 medio tra cui vitamine, 20 g di saccarosio, 0,5 g di 2-(N-morpholino) etano acido solfonico (MES) a circa 800 mL di acqua deionizzata e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungi più deionizzata acqua portare il volume totale a 1 L. aggiungere 8 g di phytoagar e autoclave per 15 min a 121 ° C.
- Lasci che il media raffreddare fino a 55 ° C e versare 20 – 25 mL di terreno B5 in una capsula Petri (diametro 9 cm, 1.5 cm di altezza) presso un banco pulito. Asciugare le piastre per 2 – 3 giorni, comprimerle con involucro pulito e tenerli in frigorifero fino all'uso.
- Sterilizzare Arabidopsis thaliana semi con 1 mL di etanolo al 70% (v/v) in una provetta da centrifuga (e-tubo) agitando continuamente per 2 – 3 minuti rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di soluzione di ipoclorito di sodio 1% (v/v) e agitare continuamente per 2 – 3 min. 100 preparare – 150 semi per piastra di Petri.
- I surnatanti di rimuovere e lavare i semi con 1 mL di acqua distillata. Ripetere questo passaggio 4x. Mettere i semi sterilizzati a 4 ° C per 3 giorni sincronizzare la germinazione del seme.
- Seminare i semi di 100 – 150 su B5 piastre utilizzando una micropipetta e sigillare la piastra con nastro chirurgico.
- Crescere le piante in una stanza di crescita con un ciclo di luce/buio di 16 h/8 h a 100 µmol·m p-2-1 intensità della luce, 70% di umidità relativa e temperatura di 20 ° C per 2 settimane.
2. preparazione del plasmide
Nota: Plasmidi di elevata purezza devono essere utilizzati per la trasformazione; è consigliato l'uso di un kit di purificazione del plasmide commerciale.
- Purificare il plasmide (RbcS-nt:GFP) utilizzando un kit di isolamento del DNA. Per concentrare gli sforzi del DNA, eseguire precipitazione dell'etanolo in una provetta da 1,5 mL e dissolva la pallina del DNA in 100 µ l di acqua distillata. Determinare la concentrazione del plasmide utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm. Diluire il plasmide ad una concentrazione finale di ~ 2 µ g / µ l. mantenere il plasmide a-20 ° C fino all'utilizzo.
3. isolamento di protoplasti
- Preparare le seguenti soluzioni.
- Preparare la soluzione di enzima per contenere 0.25% (p/v) macerozyme, cellulasi 1,0% (p/v), 400 mM D-mannitolo, cloruro di calcio di 8 mM (CaCl2), 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) e 5 mM MES. Regolare il pH a 5.6 con KOH.
- Filtrare la soluzione di enzima utilizzando un'unità di filtro di acetato di cellulosa con una dimensione dei pori di 0.45 μm. Aliquotare 25 mL della soluzione enzimatica in provette coniche da 50 mL e mantenere a-20 ° C. Scongelare la soluzione enzimatica a temperatura ambiente (TA) e mescolare bene prima dell'uso.
- Preparare una soluzione di saccarosio del 21% (p/v) sciogliendo 21 g di saccarosio in 100 mL di acqua deionizzata e autoclave la soluzione.
- Preparare soluzione W5 per contenere 154 mM di cloruro di sodio (NaCl), 125 mM CaCl2, 5mm potassio cloruro (KCl), glucosio di 5 mM e 1,5 mM MES. Regolare il pH a 5.6 con KOH ed autoclave la soluzione.
- Preparare la soluzione di Marco per contenere 400 mM D-mannitolo, cloruro di magnesio (MgCl2), 15 mM e 5 mM MES. Regolare il pH a 5.6 con KOH ed autoclave la soluzione.
- Preparare 1 M D-mannitolo e 1m nitrato di calcio stock soluzioni per rendere la soluzione di PEG. Autoclave queste soluzioni.
- Preparare la soluzione di enzima per contenere 0.25% (p/v) macerozyme, cellulasi 1,0% (p/v), 400 mM D-mannitolo, cloruro di calcio di 8 mM (CaCl2), 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) e 5 mM MES. Regolare il pH a 5.6 con KOH.
- Raccolta tessuti fogliari intatto da 2 settimane-vecchio piante da ~ 1 – 2 B5 piastre utilizzando un coltello chirurgico e posto le foglie raccolte in un 50 mL conica tubo da 25 mL di soluzione degli enzimi. Posizionare il tubo conico contenente i tessuti di soluzione e foglia di enzima orizzontalmente su un agitatore rotante con movimentazione delicata al buio. Ci vogliono 8 – 12 h per digestione completa dei tessuti fogliari.
- A 8 – 12 h dopo l'incubazione, versare la soluzione di enzima (contenente protoplasti rilasciati da tessuti fogliari) in una capsula Petri fresco attraverso una maglia con 140 µm dei pori. Attentamente la soluzione di enzima del protoplasto-contenenti in cima 15 mL di soluzione di saccarosio al 21% (p/v) di strato e centrifugare esso a 98 x g per 10 min con le impostazioni più basse di accelerazione e decelerazione in un rotore basculante.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire con cautela i protoplasti dallo strato superiore (soluzione enzimatica) e all'interfaccia tra l'enzima soluzione e la soluzione di saccarosio di una provetta conica da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di W5. Centrifugare la provetta a 51 x g per 6 min. In questa fase, protoplasti sarà nel pellet nella parte inferiore del tubo conico.
- Scartare il surnatante con attenzione usando una pipetta senza disturbare il pellet di protoplasti. Aggiungere 25 mL di soluzione di W5 e Risospendere delicatamente i protoplasti. Incubare la soluzione del protoplasto in un frigorifero a 4 ° C per almeno 1 h per la stabilizzazione.
4. protoplasti trasformazione utilizzando polietilene glicole
- Preparare un 40% PEG soluzione aggiungendo 4 g di PEG 8000, 4 mL di soluzione di mannitolo 1 M, 1 mL di 1 M Ca (NO3)2e 1,8 mL di acqua distillata in una provetta conica da 50 mL e mescolare bene. Sciogliere PEG di riscaldamento nel forno a microonde per 20 – 30 s. posto il 40% soluzione di PEG a RT per rinfrescarsi.
Nota: Il 40% di PEG soluzione deve essere preparata fresca ogni volta. Se protoplasti non sono pellettati completamente durante l'incubazione di 4 ° C in frigorifero, centrifugare il materiale a 46 x g per 2 min. - Rimuovere il surnatante con attenzione ma completamente ed aggiungere la soluzione di Marco al pellet di protoplasti di cedere la concentrazione di 5 x 106/ml.
Nota: Il numero di protoplasti può essere determinato da un emocitometro visualizzato al microscopio. - Posto 10 µ g di DNA plasmidico, ogni vuoto mL 13 round-fondo tubo e aggiungere 300 µ l di soluzione di protoplasti utilizzando una pipetta.
Nota: L'estremità della punta della pipetta deve essere tagliata. Ogni volta che vengono campionati protoplasti, la soluzione contenente protoplasti dovrebbe essere risospese destra prima di pipettaggio affinché lo stesso numero di protoplasti viene aggiunto in ogni provetta. - Mescolare il DNA del plasmide con protoplasti ruotando delicatamente i tubi e immediatamente aggiungere 300 µ l di 40% PEG soluzione utilizzando una pipetta. Agitare delicatamente ma completamente ruotando tubi ed incubare per 30 min a temperatura ambiente; inclinare il tubo in posizione quasi orizzontale e ruotare più volte.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di W5 e agitare delicatamente ma completamente ruotando il tubo a mano in un modo simile. Incubare il campione per 10 min a temperatura ambiente.
- Ripetere questo passaggio due volte utilizzando più 1,5 mL e 2 mL di soluzione di W5, rispettivamente. Incubare per 30 min dopo l'aggiunta finale di W5 soluzione.
- Centrifugare a 46 x g per 4 min. scartare il sopranatante e aggiungere 2 mL di soluzione di W5. Mescolare delicatamente ma completamente. Incubare a 22 ° C in una camera oscura.
5. analisi dell'importazione della proteina in cloroplasti
Nota: Dopo la trasformazione PEG-mediata dei protoplasti, tempo di incubazione varia da 8 a 24 h.
-
Microscopia a fluorescenza
- Posto 10 µ l della soluzione del protoplasto su un vetro di diapositiva utilizzando una pipetta con punta tagliata e attentamente coprire con un vetrino coprioggetto per evitare di danneggiare i protoplasti.
- Posto il vetrino sul palco di un microscopio a fluorescenza equipaggiato con filtro di eccitazione/emissione imposta per l'osservazione della proteina fluorescente verde (GFP) e auto-fluorescenza della clorofilla.
- Acquisizione di immagini con un raffreddato charge coupled device (CCD) fotocamera e processo di immagini utilizzando un software di fotoritocco per produrre immagini di pseudo-colore.
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Immunoblotting e l'estrazione di proteine totali
- Preparare il tampone di denaturazione contenente 2,5% (p/v) sodio dodecilsolfato (SDS) e 2-mercaptoetanolo 2% (v/v).
Nota: Importazione di proteina in cloroplasti può essere quantificato misurando il grado di peptide di transito l'elaborazione tramite l'analisi di immunoblot usando l'anticorpo anti-GFP. - Trasferire i protoplasti in una provetta da centrifuga e centrifugare a 46 x g per 4 min.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 80 µ l di tampone di denaturazione. Vigorosamente vortex per 5 s e aggiungere 5 x tampone del campione SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0.5 M DTT, SDS 10% (p/v), blu di bromofenolo 0,05% (p/v) e 50% (v/v) glicerolo). Mescolare bene e far bollire per 10 min.
- Sottoporre questo campione della proteina a standard SDS-PAGE e immunoblotting con anticorpo anti-GFP.
- Preparare il tampone di denaturazione contenente 2,5% (p/v) sodio dodecilsolfato (SDS) e 2-mercaptoetanolo 2% (v/v).
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Representative Results
L'importazione di proteine in cloroplasti può essere esaminato mediante due approcci: analisi di microscopia e immunoblot di fluorescenza dopo separazione SDS-pagina-mediata. Qui, abbiamo usato RbcS-nt:GFP, una fusione costruire codifica i 79 residui dell'amminoacido N-terminale di RbcS contenente il peptide di transito fuso alla GFP. Quando proteine vengono importate in cloroplasti, i segnali di fluorescenza verde da proteina bersaglio RbcS-nt:GFP dovrebbe fondersi con i segnali fluorescenti rossi da auto-fluorescenza della clorofilla, come esaminato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1). La stretta sovrapposizione dei due segnali indica l'importazione della proteina in cloroplasti. Spesso i segnali GFP sono sparsi durante i cloroplasti o sono concentrati al centro dei cloroplasti, con segnali debolmente diffusi in tutto i cloroplasti, a seconda delle singole proteine. L'importazione delle proteine può essere confermata dall'analisi del immunoblot usando GFP anticorpo. Proteine totali sono preparate da protoplasti e separate da SDS-PAGE seguita da analisi Western blot (Figura 2). Nella maggior parte dei casi, due bande proteiche dovrebbero essere osservati nel immunoblot se una proteina è stato correttamente importata in cloroplasti: la banda superiore corrisponde al full-length precursore e la banda inferiore al modulo elaborato dopo l'importazione in cloroplasti. L'importo del modulo trasformato della proteina dovrebbe aumentare in maniera dipendente dal tempo. Tali risultati implicherebbe che la proteina RbcS-nt:GFP viene importato in cloroplasti in protoplasti di Arabidopsis. Inoltre, il rapporto tra il modulo elaborato per l'importo totale delle proteine espresse (la forma trasformato più precursore) utilizzabile come una misura dell'efficienza di importazione. Se necessario, i cloroplasti possono essere purificati da protoplasti delicatamente lisati e proteine dalla frazione cloroplasto possono essere analizzate mediante western blotting per confermare ulteriormente l'importazione delle proteine in cloroplasti.
Figura 1. Localizzazione in vivo di GFP fuso al peptide di transito di RbcS in cloroplasti.
Immagini sono state scattate 18 h dopo la trasformazione con un microscopio a fluorescenza. Verde (un), rosso (b), unite (c) e luminoso (d) le etichette indicano GFP immagine, immagine di clorofilla, un immagine risultante dalla fusione dei due segnali e luminoso campo immagine, rispettivamente. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Analisi di Western blot di RbcS-nt:GFP per indagare l'importazione di proteine in cloroplasti.
Gli estratti proteici totali sono stati preparati da protoplasti e separati da 10% (p/v) SDS-PAGE, seguita da analisi western blot con anticorpi anti-GFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l'uso dei protoplasti di Arabidopsis per studiare la proteina importazione in cloroplasti. Questo metodo è potente per studiare il processo di importazione di proteine. Questa tecnica semplice, versatile è utile per esaminare il targeting delle proteine del carico previsto di cloroplasti. Utilizzando questo metodo, protoplasti vengono preparati da tessuti fogliari di Arabidopsis11,12 , che può essere ottenuto da piante in molte fasi differenti di sviluppo che vanno da molto presto a foglie completamente mature. Tuttavia, è necessario prestare attenzione quando la coltivazione di piante utilizzate per la preparazione del protoplasto. Uno dovrebbe usare piante molto sane, come protoplasti preparati da piante sane in grado di sopportare i molti passaggi di trasformazione mediata da PEG. Un'altra precauzione importante è quello di utilizzare soluzioni fresche. Lievi variazioni nelle concentrazioni delle soluzioni possono danneggiare notevolmente i protoplasti, dal momento che sono fragili e molto sensibili alla pressione osmotica.
Utilizziamo i protoplasti di studiare proteine importazione in cloroplasti9,13,14. Sulla base di questi studi, siamo stati in grado di sezionare i motivi di sequenza in vari peptidi di transito. Inoltre, abbiamo usato i protoplasti per identificare i segnali di targeting (la regione di carica positiva che fiancheggiano il C-terminale del dominio transmembrana) delle proteine mirati alla membrana del cloroplasto15busta esterna. Allo stesso modo, abbiamo usato i protoplasti per studiare importazione di proteine nei mitocondri10. Ancora una volta, siamo stati in grado di identificare molti motivi di sequenza critica in presequences delle proteine mitocondriali. Inoltre, le proteine della membrana esterna dei mitocondri contengono anche una regione di carica positiva che fiancheggia il dominio transmembrana come loro destinazione segnale15. Questi segnali di targeting condividono un elevato grado di somiglianza nella composizione aminoacidica. Infatti, proteine cloroplasto erano mistargeted ai mitocondri durante in vitro esperimenti di importazione16. Tuttavia, il cloroplasto e proteine mitocondriali sono appositamente importati nella loro destinazione organelli in vivo. Così, protoplasti possono essere utilizzati per delucidare i meccanismi alla base come specificità di targeting è determinato tra cloroplasti e mitocondri.
Protoplasti rappresentano un sistema ideale per analizzare l'importazione delle proteine in cloroplasti in vivo. Tuttavia, un avvertimento è che i protoplasti possono essere in condizioni di forte stress ad esempio ferendo lo stress. Così, non possiamo escludere la possibilità che tale lo stress può influenzare il processo di importazione. Così, in alcuni casi, i risultati devono essere interpretati con cautela quando protoplasti vengono utilizzati per esperimenti di importazione di proteine.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato effettuato con il supporto del programma di ricerca cooperativa per la scienza l'agricoltura e lo sviluppo della tecnologia (progetto n ° PJ010953012018), gestione dello sviluppo rurale e la concessione di National Research Foundation (Corea), finanziato dal Ministero della scienza e ICT (n. 2016R1E1A1A02922014), Repubblica di Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
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