Summary
ここでプロトプ ラストにペグを介した変換法を用いた蛋白質を表現するプロトコルについて述べる。メソッドが、興味の蛋白質、蛋白質のローカリゼーション、種々 の実験条件のインポート プロセスの効率的な調査の簡単な表現を提供します体内。
Abstract
葉緑体は、光合成など多くの二次代謝と脂質の生産植物の様々 な細胞プロセスを担当する重要な細胞小器官です。葉緑体は、これらの様々 な生理学的なプロセスの多数の蛋白質を必要とします。以上葉緑体タンパク質の 95% は、核でエンコードされ、細胞質から、葉緑体にインポートをゾル性細胞質のリボソームで翻訳後です。したがって、適切なインポートまたはこれら核葉緑体タンパク質が葉緑体にターゲットは葉緑体として植物細胞の適切な機能にとって不可欠です。核葉緑体タンパク質の解析には、葉緑体に特定の対象信号シーケンスが含まれています。葉緑体や細胞質に局在する分子機械はこれらの信号を認識し、インポート処理を実施します。タンパク質インポートまたは体内の葉緑体にターゲットのメカニズムを調べるためには、シロイヌナズナの葉緑体への蛋白質輸送を分析するための迅速で効率的な原形質体ベースの方法を開発しました。このメソッドでは、シロイヌナズナの葉組織から分離したプロトプ ラストを使用します。ここでは、プロトプ ラストを使用して、タンパク質が葉緑体にインポートされる機構を調査するための詳しいプロトコルを提供します。
Introduction
葉緑体は植物の最も重要な器官のひとつです。1光合成を行う葉緑体の主な機能の 1 つです。葉緑体は、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチドおよび多数の二次代謝産物1,2の生産のための他の多くの生化学的反応をまた運ぶ。これらの反応のすべてについて、葉緑体は多数の異なる種類のタンパク質を必要とします。しかし、葉緑体ゲノムにはだけおよそ 100 遺伝子3,4が含まれています。したがって、葉緑体は細胞質からのタンパク質の大部分をインポートする必要があります。実際には、ほとんどの葉緑体タンパク質翻訳4,5,6後に細胞質からインポートすることが示されました。植物細胞の葉緑体細胞質から蛋白質にインポートする特定のメカニズムが必要です。しかし、これらのタンパク質インポート メカニズムが過去数十年間検討されてきたがまだ完全にかわからないそれら分子レベルで。ここでは、プロトプ ラストを準備し、外因プロトプ ラストの遺伝子を表現するため詳細な方法を提供します。このメソッドは、詳細に葉緑体への蛋白質輸送の分子機構を解明するための貴重な可能性があります。
タンパク質インポートは、さまざまなアプローチを使用して学ぶことができます。これらのメソッドの 1 つの in vitroタンパク質インポート システム7,8の使用が含まれます。生体外で、このアプローチを使用して-翻訳された蛋白質の前駆物質は体外純化クロロプ ラストと孵化させる、タンパク質インポートは西部のしみの分析に続いて SDS-PAGE によって分析されます。このアプローチの利点は、葉緑体へのタンパク質インポートの各手順の詳細に学ぶことができますです。したがって、このメソッドは、広く使用されてタンパク質インポート分子機械のコンポーネントを定義し、輸送ペプチド シーケンス情報を解剖します。最近では、葉組織からのプロトプ ラストの使用を含む別のアプローチを開発し、葉緑体9,10への蛋白質輸送を研究する広く使用となっています。このアプローチの利点は、プロトプ ラスト培養システムよりもそのまま細胞に近い細胞環境を提供することです。したがって、プロトプ ラスト システムでは、関連するゾル性細胞質のイベントとターゲット信号の特異性を決定する方法など、このプロセスの多くの追加の側面に対処することが出来ます。ここでは、プロトプ ラストの葉緑体への蛋白質輸送を研究に使用するための詳細なプロトコルを提案する.
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Protocol
1. シロイヌナズナ植物の成長
- 1 L Gamborg B5 を準備 (B5) 媒体 B5 培地の 3.2 g を追加することによってビタミン、糖 20 g、0.5 g を脱イオン水の約 800 mL 2-(N-morpholino) エタン スルホン酸 (MES) の水酸化カリウム (KOH) と 5.7 を pH 調整など。追加より脱イオン水は 1 l. 追加 8 グラム、phytoagar、121 ° C で 15 分間オートクレーブに総量をもたらす
- 55 ° C まで冷却し、クリーン ベンチでシャーレ (直径 9 cm、高さ 1.5 cm) に B5 培地の 20-25 mL を注ぐに許可します。2-3 日間板を乾燥、クリーンなラップでそれらをパック、使用するまで冷蔵庫に保管してください。
- シロイヌナズナを用いた滅菌 70% (v/v) エタノール 2-3 分間継続的に揺れによる遠心分離機管 (電子管) での 1 ml 種子上澄みを除去、1% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウム溶液の 1 mL を追加し、2-3 分間継続的に振る準備 100-シャーレ 150 種。
- 培養上清を削除し、1 mL の蒸留水と種子を洗浄します。4 x この手順を繰り返します。種子の発芽を同期する 3 日間の 4 ° C で滅菌の種子を置きます。
- マイクロ ピペットを使用して B5 版に 100-150 種をまくし、サージカル テープでプレートをシールします。
- 2 週間 100 µmol·m-2·s-1光強度があり、70% の相対湿度、温度 20 ° C で 16/8 h/明暗サイクルの成長部屋の植物を育てます。
2. プラスミッドの準備
注: 変換の高純度プラスミッドが使用する必要があります。市販のプラスミド精製キットの使用をお勧めします。
- プラスミッドの浄化 (赤血球-nt:GFP) DNA 分離キットを使用しています。DNA を集中するには、1.5 mL チューブのエタノール沈殿を行うし、蒸留水を 100 μ L の DNA ペレットを溶解します。260 分光光度計を使用してプラスミッドの濃度を決定する nm。最終的な集中にプラスミドを希釈 〜 2 μ g/μ L。 使用するまで-20 ° C でプラスミッドを維持。
3. プロトプ ラストの単離
- 以下のソリューションを準備します。
- 0.25% (w/v) macerozyme, 1.0% (w/v) セルラーゼ, 400 mM 8 mM 塩化カルシウム (CaCl2), 0.1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA)、D-マンニトールを含む酵素液を準備し、5 mM MES。島の 5.6 に pH を調整します。
- 0.45 μ m 孔径のセルロース アセテート フィルター ユニットを使用して酵素液をフィルター処理します。50 mL の円錐管に-20 ° C で酵素液の分注 25 mL常温 (RT) 酵素液を解凍し、使用前によく混ぜます。
- 21% (w/v) ショ糖液 100 mL の脱イオン水のオートクレーブにショ糖の 21 g を溶解することによりソリューションを準備します。
- 1.5 mM MES、5 mM グルコース 5 mM 塩化カリウム (KCl) 125 mM CaCl2154 mM 塩化ナトリウム (NaCl) の格納する W5 ソリューションを準備します。5.6 コとオートクレーブ ソリューションに pH を調整します。
- 400 mM 15 mM 塩化マグネシウム (MgCl2)、D-マンニトールを格納する MaMg ソリューションを準備し、5 mM MES。5.6 コとオートクレーブ ソリューションに pH を調整します。
- 止め釘の解決する 1 M D-マンニトールと 1 M 硝酸カルシウム貯蔵液を準備します。オートクレーブこれらのソリューション。
- 0.25% (w/v) macerozyme, 1.0% (w/v) セルラーゼ, 400 mM 8 mM 塩化カルシウム (CaCl2), 0.1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA)、D-マンニトールを含む酵素液を準備し、5 mM MES。島の 5.6 に pH を調整します。
- 収穫から 2 週間古い植物からそのまま葉組織 ~ メスと場所を使用して 1-2 B5 板収穫された葉の 50 mL のコニカル チューブ含む酵素溶液 25 mL。暗闇の中で穏やかな攪拌とシェーカーに水平に酵素ソリューションと葉組織を含む円錐管を配置します。葉組織の完全消化のための 8-12 時間かかります。
- 孵化後 8-12 時間で 140 μ m 孔径メッシュを通して新鮮なペトリ皿に (葉組織からのプロトプ ラストを含む) 酵素液を注ぐ。慎重に 21% (w/v) ショ糖溶液 15 mL 上にプロトプ ラストを含む酵素液を層し、スイング バケツの回転子を最も低い加速度と減速度設定と 10 分のための 98 × g で遠心分離機します。
- パスツール ピペットを使用して、慎重にプロトプ ラスト最上位層 (酵素液) から間および転送インターフェイスで酵素液とショ糖液 W5 溶液 30 mL を含む 50 mL の円錐管に。6 分 51 x g でこのチューブを遠心します。この段階でプロトプ ラストは円錐管の下部にペレットになります。
- プロトプ ラストのペレットを乱すことがなく慎重にピペットを使用して上澄みを廃棄します。W5 溶液 25 mL を追加し、そっとプロトプ ラストを再懸濁します。安定化のため、少なくとも 1 時間のための 4 ° C 冷蔵庫でプロトプ ラスト ソリューションを孵化させなさい。
4 ポリエチレング リコールを用いたプロトプ ラスト変換
- 準備 40 %50 mL の円錐管にペグの 8000 の 4 g、1 M のマンニトール溶液 4 mL、1 M Ca (3)2, 1 mL、1.8 mL の蒸留水を追加することによってソリューションをペグし、よく混ぜます。ペグを 40 %20-30 米位の電子レンジで加熱することによって溶かす常温冷却のための止め釘の解決。
注: 40% たてたびに止め釘の解決を準備する必要があります。プロトプ ラストは、完全に冷蔵庫で 4 ° C の孵化の間にペレットない場合、2 分 46 x g で材料を遠心します。 - 上清を慎重に完全に削除し、MaMg ソリューションを屈する 5 x 106/mL の濃度原形質体の餌に追加します。
注: プロトプ ラストの数は、顕微鏡下で見る検定によって決定できます。 - 場所 10 μ g のプラスミド DNA 各空 13 mL 丸底チューブとプロトプ ラスト ソリューション ピペットを使用しての 300 μ L を追加します。
注: ピペット チップの最後は切断する必要があります。プロトプ ラストをサンプリングするたびにプロトプ ラスト含有溶液はピペッティング プロトプ ラストの同じ数を各管に追加する前に再停止する必要があります。 - 軽くチューブを回転させることによりプロトプ ラストでプラスミド DNA を混合し、すぐに 40% の 300 μ L を追加ピペットを使用して止め釘の解決。チューブを回転させることにより完全になく優しくをミックスし、部屋の温度で 30 分間インキュベートチューブをほぼ水平方向に傾き、数回回します。
- W5 溶液 1 mL を加え、同様の方法で手でチューブを回転させることにより優しくが完全を混ぜます。室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。
- 2 回以上で 1.5 mL と W5 溶液 2 mL それぞれこの手順を繰り返します。W5 ソリューションの最終的な付加の後で 30 分間インキュベートします。
- 4 分破棄上清 46 x g で遠心し、W5 溶液 2 mL を追加します。優しく、完全に混ぜます。暗い区域の 22 ° C で孵化させなさい。
5. 葉緑体への蛋白質輸送の解析
注: 後のプロトプ ラスト培養時間範囲は 8 から 24 h の PEG-仲介された変形。
-
蛍光顕微鏡
- プロトプ ラストを損傷を避けるため coverslip でトリミングされたヒントと慎重にピペットを使用してスライド グラス上でプロトプ ラスト ソリューションの場所 10 μ L をカバーします。
- 緑色蛍光タンパク質 (GFP) とクロロフィルの自家蛍光を観察するため励起/蛍光フィルターを搭載した蛍光顕微鏡のステージ上のスライドの場所を設定します。
- 冷却電荷結合素子 (CCD) カメラと処理画像を擬似カラー画像を生成する画像編集ソフトウェアを使用してイメージをキャプチャします。
-
総蛋白質の抽出および免疫ブロット
- 2.5% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) や 2% (v/v) 2-メルカプトエタノールを含む変性バッファーを準備します。
注: 輸送ペプチド抗 GFP 抗体を用いたイムノブロット分析を介して処理の程度を測定することにより葉緑体への蛋白質輸送を定量化することができます。 - 遠心分離機管と 46 x g で 4 分間遠心にプロトプ ラストを転送します。
- 上澄みを除去し、変性バッファーの 80 μ L を追加します。積極的に渦 5 s、SDS サンプルバッファー (250 mM Tris Cl (pH 6.8)、0.5 M DTT、10% (w/v) SDS、0.05% (w/v) ブロモフェノール ブルー、50% (v/v) グリセロール) × 5 を追加。よく混合し、10 分煮る。
- この蛋白質のサンプルを標準の SDS-PAGE および抗 GFP 抗体と免疫ブロット対象します。
- 2.5% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) や 2% (v/v) 2-メルカプトエタノールを含む変性バッファーを準備します。
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Representative Results
葉緑体へのタンパク質のインポートは 2 つの方法を使用して調べることができます: SDS ページを介した分離後の蛍光顕微鏡とイムノブロット分析。ここで、赤血球を使用-nt:GFP、融合は、GFP を融合した輸送ペプチドを含む赤血球の 79 の N 末端アミノ酸残基のエンコーディングを構築します。ターゲット蛋白質赤血球からの信号は緑色蛍光タンパク質を葉緑体へインポートするとき-nt:GFP からクロロフィル自家蛍光レッド蛍光シグナルが合併と蛍光顕微鏡 (図 1)。2 つの信号の近くの重なりは、葉緑体へのタンパク質インポートを示します。しばしば GFP シグナルは葉緑体全体に広がっているまたは個々 の蛋白質によって、葉緑体中弱拡散信号と葉緑体の中心に集中しています。蛋白質の輸入は、GFP 抗体を用いたイムノ プロット解析で確認できます。プロトプ ラストから調製した血清総蛋白および西部のしみの分析 (図 2) に続いて SDS-PAGE によって分離が。ほとんどの場合、2 つのタンパク バンドを守らなければなりません、イムノブロットでタンパク質が葉緑体に正しくインポートされなかった場合: 葉緑体へのインポート後フルレングスの前駆体と処理済みのフォームに低いバンドに対応する上部バンド。蛋白質の処理済みのフォームが時間依存的に増加する必要があります。このような結果はことをほのめかすだろう蛋白質赤血球-nt:GFP はシロイヌナズナのプロトプ ラスト中の葉緑体にインポートされます。さらに、(処理済みのフォーム プラス前駆体) に表現された蛋白質の総量を処理形式の比は、インポート効率の目安として使用できます。必要に応じて、優しく分離プロトプ ラストから葉緑体を浄化することが、さらに葉緑体へのタンパク質のインポートを確認するウェスタンブロッティングによって葉緑体成分からタンパク質を分析できます。
図 1。体内の GFP の局在は、葉緑体に赤血球輸送ペプチド融合。
蛍光顕微鏡下で変換後 18 時間に撮影されました。緑 (、)、赤 (b)、結合された (c)、および明るい (d) ラベルは、GFP イメージ、クロロフィル イメージ、2 つの信号の結合されたイメージおよび明るいフィールド画像をそれぞれ示します。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。赤血球の西部のしみの分析-葉緑体への蛋白質輸送を調査する nt:GFP。
総蛋白抽出物は、プロトプ ラストから準備され、抗 GFP 抗体を用いたウエスタンブロット法によって 10% (w/v), SDS-PAGE によって分離します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
プロトプ ラストの葉緑体への蛋白質輸送を研究するシロイヌナズナの使用のための詳しいプロトコルを提供しました。このメソッドは、強力なタンパク質インポート プロセスを調査するため。このシンプルで汎用性の高いテクニック、予定された貨物タンパク質が葉緑体にターゲットを調べるのに役立ちます。このメソッドを使用すると、プロトプ ラストから非常に早く完全に成熟した葉に至るまで多くの異なる生育段階での植物から得ることができるシロイヌナズナ11,12の葉組織から用意しています。ただし、成長する植物のプロトプ ラストの調製に使用するとき注意が必要があります。健康な植物から調製したプロトプ ラストは、ペグ-仲介された変形に関与する多くのステップを耐えることができます 1 つは、非常に健全な植物を使用ください。別の重要な予防策は、新鮮なソリューションを使用することです。ソリューションの濃度のわずかな変化は、彼らは壊れやすく、浸透圧に非常に敏感であるので大きく、プロトプ ラストを損傷することが。
葉緑体9,13,14への蛋白質輸送を研究するのにプロトプ ラストを使用しています。これらの研究に基づき、様々 な輸送ペプチドの配列モチーフを解剖することができました。また、ターゲット信号の (正荷電の領域は、膜貫通ドメインの C 末端の側面) を識別するプロトプ ラストを用いて葉緑体15外部エンベロープ膜を対象とした蛋白質の。同様に、我々 はミトコンドリア10への蛋白質輸送を調査するのにプロトプ ラストを使用しました。再び、我々 はミトコンドリア蛋白質の presequences の多くの重要なシーケンス モチーフを識別することができた。さらに、ミトコンドリアの外膜タンパク質は、膜貫通ドメインのターゲット信号15の側面正荷電領域も含まれます。これらのターゲット信号を共有のアミノ酸組成の類似性が高い。確かに、葉緑体タンパク質がミトコンドリアに体外インポート実験16の間に mistargeted いた。ただし、葉緑体とミトコンドリア蛋白質のターゲット細胞小器官の生体にインポートされていません。したがって、プロトプ ラストは葉緑体とミトコンドリアのターゲット特異性を決定する方法の基礎となる機構を解明する使用できます。
プロトプ ラストは、体内の葉緑体タンパク質のインポートを分析するための理想的なシステムを表しています。ただし、一つ注意点はストレスを負傷など強いストレス条件下におけるプロトプ ラストがあります。したがって、このようなストレスは、インポート プロセスに影響を与える可能性があります可能性を排除できません。したがって、特定のケースで結果解釈すべき注意のプロトプ ラストは蛋白質のインポートに使用する場合。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事は農業科学技術開発プロジェクト号共同研究プログラムの支援で実施されました。PJ010953012018)、農村開発行政と科学省と ICT (第 2016R1E1A1A02922014)、によって資金を供給国立研究財団 (韓国) グラント韓国。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
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