Summary
Aqui descrevemos um protocolo para expressar proteínas em protoplastas usando o método de transformação mediada por PEG. O método fornece fácil expressão de proteínas de interesse e investigação eficiente de localização da proteína e o processo de importação para as várias condições experimentais in vivo.
Abstract
O cloroplasto é uma organela essencial que é responsável por vários processos celulares em plantas, tais como a fotossíntese e a produção de muitos metabólitos secundários e lipídios. Cloroplastos exigem um grande número de proteínas para estes vários processos fisiológicos. Mais de 95% de proteínas cloroplasto são importados em cloroplastos de citoplasma e núcleo-codificado após a tradução em ribossomas citosólica. Assim, a importação correta ou direcionamento destas proteínas codificadas núcleo cloroplasto de cloroplastos é essencial para o bom funcionamento dos cloroplastos, bem como a célula vegetal. Proteínas codificadas núcleo cloroplasto contém sequências de sinal para o direcionamento específico de cloroplastos. Máquinas moleculares localizadas para o cloroplasto ou citosol reconhecer estes sinais e realizar o processo de importação. Para investigar os mecanismos de importação de proteínas ou segmentação de cloroplastos em vivo, desenvolvemos um método baseado em protoplastos rápido e eficiente para analisar a importação de proteínas em cloroplastos de Arabidopsis. Neste método, usamos protoplastas isolados de tecidos folha de Arabidopsis. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para uso protoplastas para investigar o mecanismo pelo qual as proteínas são importadas em cloroplastos.
Introduction
O cloroplasto é dentre as organelas mais importantes em plantas. Uma das principais funções dos cloroplastos é realizar fotossíntese1. Cloroplastos também realizam muitas outras reações bioquímicas para a produção de ácidos graxos, aminoácidos, nucleotídeos e muitos metabólitos secundários1,2. Para todas estas reacções, cloroplastos exigem um grande número de diferentes tipos de proteínas. No entanto, o genoma do cloroplasto contém apenas cerca de 100 genes3,4. Portanto, cloroplastos devem importar a maioria das suas proteínas do citosol. Na verdade, a maioria das proteínas cloroplasto foram mostrados para ser importadas do citosol após tradução4,5,6. Células vegetais requerem mecanismos específicos para importar proteínas do citosol de cloroplastos. No entanto, apesar desses mecanismos de importação de proteínas têm sido investigados há várias décadas, ainda não compreendemos-los a nível molecular. Aqui, nós fornecemos um método detalhado para preparar protoplastas e exogenamente expressando genes em protoplastas. Esse método pode ser valioso para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes a importação de proteínas em cloroplastos em detalhe.
Importação de proteínas pode ser estudada usando muitas abordagens diferentes. Um destes métodos envolve o uso de um em vitro proteína importação sistema7,8. Usando essa abordagem, em vitro-precursores de proteínas traduzidas são incubados com cloroplastos purificada em vitro, e importação de proteínas é analisada por SDS-PAGE, seguido de análise ocidental do borrão. A vantagem dessa abordagem é que cada passo da importação de proteínas em cloroplastos pode ser estudado em detalhe. Assim, este método foi amplamente utilizado para definir os componentes da maquinaria molecular da proteína importação e dissecar informações de sequência de peptídeos de trânsito. Mais recentemente, foi desenvolvida uma outra abordagem envolvendo o uso de protoplastas de tecidos de folhas e ele tornar-se amplamente utilizados para estudar a importação de proteínas em cloroplastos9,10. A vantagem dessa abordagem é que protoplastas de fornecem um ambiente celular que está mais próximo ao de células intactas, que o sistema in vitro . Assim, o sistema de protoplastos nos permite abordar muitos aspectos adicionais deste processo, tais como os eventos associados citosólico e como a especificidade dos sinais de direcionamento é determinada. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o uso de protoplastas para estudar a importação de proteínas em cloroplastos.
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Protocol
1. crescimento de plantas de Arabidopsis
- Preparar 1 L Gamborg B5 (B5) médio, adicionando 3,2 g de B5 médio incluindo vitaminas, 20 g de sacarose, 0,5 g de 2-(N-morpholino) etano sulfônico (MES) para cerca de 800 mL de água desionizada e ajustar o pH a 5.7 com hidróxido de potássio (KOH). Adicione mais água deionizada água traz o volume total de 1 L. adicionar 8 g de phytoagar e autoclave por 15 min a 121 ° C.
- Permita a médio e a arrefecer até 55 ° C e despeje uma placa de Petri (9 cm de diâmetro, 1,5 cm de altura) em uma bancada limpa 20 – 25 mL do meio de B5. Chapas secas por 2 – 3 dias, embale-os com o envoltório limpo e mantê-los em geladeira até o uso.
- Arabidopsis thaliana de esterilizar as sementes com 1 mL de etanol a 70% (v/v) em um tubo de centrifugação (e-tubo) agitando continuamente durante 2-3 min. Retire o sobrenadante, adicionar 1 mL de solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) e agitar continuamente durante 2-3 min. preparar 100 – 150 sementes por placa de Petri.
- Remover os sobrenadantes e lavar as sementes com 1 mL de água destilada. Repita essa etapa x 4. Coloque as sementes esterilizadas a 4 ° C por 3 dias para sincronizar a germinação das sementes.
- 100 – 150 semear em placas de B5 usando uma micropipeta e selar a placa com fita cirúrgica.
- Cultivar plantas em uma sala de crescimento com um ciclo de luz/escuro de 16 h/8 h em 100 µmol·m-2·s-1 de intensidade luminosa, 70% de umidade relativa e temperatura de 20 ° C por 2 semanas.
2. preparação do plasmídeo
Nota: Plasmídeos de alta pureza devem ser usados para a transformação; recomenda-se o uso de um kit de purificação de plasmídeo comercial.
- Purificar o plasmídeo (hemácias-nt:GFP) usando um kit de isolamento do DNA. Para concentrar o DNA, executar a precipitação do álcool etílico em um tubo de 1,5 mL e dissolver o sedimento de DNA em 100 µ l de água destilada. Determinar a concentração do plasmídeo usando um spectrophotometer em 260 nm. Diluir o plasmídeo para uma concentração final de ~ 2 µ g / µ l. Mantenha o plasmídeo a-20 º C até o uso.
3. isolamento de protoplastas
- Prepare as seguintes soluções.
- Preparar a solução de enzima para conter macerozyme de 0,25% (p/v), celulase de 1,0% (p/v), D-manitol, 8 mM de cloreto de cálcio (CaCl2), 0,1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA), de 400 mM e 5 mM MES. Ajuste o pH a 5.6 com KOH.
- Filtre a solução enzimática, utilizando uma unidade de filtro de acetato de celulose com um tamanho de poro de 0,45 μm. Alíquota 25 mL da solução de enzima em tubos de Erlenmeyer de 50 mL e manter a-20 ° C. Descongelar a solução enzimática em temperatura ambiente (RT) e misture bem antes de usar.
- Prepare uma solução de sacarose de 21% (p/v) dissolvendo-se 21 g de sacarose em 100 mL de água desionizada e autoclave a solução.
- Prepare a solução de W5 para conter 154 mM de cloreto de sódio (NaCl), 125 mM CaCl2, 5mm de cloreto de potássio (KCl), glicose de 5 mM e 1,5 mM MES. Ajuste o pH a 5.6 com KOH e autoclave a solução.
- Preparar MaMg solução para conter o D-manitol, 15 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), de 400 mM e 5 mM MES. Ajuste o pH a 5.6 com KOH e autoclave a solução.
- Prepare 1 M D-manitol e 1 M de nitrato de cálcio estoque soluções para fazer a solução de PEG. Autoclave essas soluções.
- Preparar a solução de enzima para conter macerozyme de 0,25% (p/v), celulase de 1,0% (p/v), D-manitol, 8 mM de cloreto de cálcio (CaCl2), 0,1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA), de 400 mM e 5 mM MES. Ajuste o pH a 5.6 com KOH.
- Colheita de tecidos intactos folha de 2 semanas de idade plantas de ~ 1 – 2 placas de B5 usando uma faca cirúrgica e coloque as folhas colhidas em um Erlenmeyer de 50 mL tubo contendo 25 mL da solução de enzima. Coloque o tubo cônico contendo os enzima solução folha os tecidos e horizontalmente em um agitador rotativo com agitação suave no escuro. Demora 8 – 12 h para a digestão completa dos tecidos da folha.
- A 8-12 h após a incubação, despeje a solução de enzima (contendo protoplastas liberados dos tecidos da folha) em um prato de Petri fresco através de uma malha com tamanho de poro 140 µm. Cuidadosamente a solução de enzima contendo protoplastos em cima de 15 mL de solução de sacarose de 21% (p/v) de camada e centrifugue a 98 x g por 10 min com as configurações de aceleração e desaceleração menores em um rotor balançando-balde.
- Com uma pipeta Pasteur, transferi com cuidado os protoplastas da camada mais superior (solução enzimática) e na interface entre a solução de sacarose e solução enzimática para um tubo cônico de 50 mL, contendo 30 mL de solução de W5. Centrifugar este tubo a 51 x g, durante 6 min. Nesta fase, o protoplastas será na pelota no fundo do tubo cónico.
- Desprezar o sobrenadante, cuidadosamente, usando uma pipeta sem perturbar o sedimento protoplastas. Adicionar 25 mL de solução de W5 e ressuspender delicadamente os protoplastas. Incube a solução de protoplastos no frigorífico durante pelo menos 1 h para estabilização de 4 ° C.
4. protoplastos transformação usando polietileno glicol
- Preparar um 40% PEG solução adicionando 4G de PEG 8000, 4 mL de solução de manitol 1 M, 1 mL de 1 M Ca (NO3)2e 1,8 mL de água destilada em um tubo cónico de 50 mL e misture bem. Dissolver o PEG por aquecimento em um forno de microondas para s. lugar de 20 a 30 a 40% solução de PEG em RT para refrigerar para baixo.
Nota: Os 40% PEG solução deve ser preparada na hora cada vez. Se os protoplastas não são peletizados completamente durante a incubação de 4 ° C no refrigerador, centrifugar o material a 46 x g por 2 min. - Remover o sobrenadante, cuidadosamente, mas completamente e adicionar solução MaMg ao pellet de protoplastos para produzir a concentração de 5 x 106/mL.
Nota: O número de protoplastos pode ser determinado por um hemocytometer visto sob um microscópio. - Lugar de 10 µ g do ADN do plasmídeo cada mL 13 vazio fundo redondo tubo e adicionar 300 µ l de solução de protoplastos utilizando uma pipeta.
Nota: O fim da ponta da pipeta deve ser cortado. Sempre que os protoplastas são amostrados, a solução contendo protoplastos deve ser resuspended antes de pipetagem para que o mesmo número de protoplastas é adicionado a cada tubo. - Misture o plasmídeo com protoplastas rodando suavemente os tubos e imediatamente adicionar 300 µ l de 40% solução de PEG, com uma pipeta. Misture delicadamente mas completamente girando tubos e incube durante 30 min à temperatura ambiente; Incline o tubo quase horizontalmente e girá-lo várias vezes.
- Adicionar 1 mL de solução de W5 e misture delicadamente mas completamente girando o tubo à mão de forma semelhante. Incube a amostra durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Repita essa etapa duas vezes mais usando 1,5 mL e 2 mL de solução de W5, respectivamente. Incube durante 30 min após a adição final de solução W5.
- Centrifugar a 46 x g, durante 4 min. descartar o sobrenadante e adicionar 2 mL de solução de W5. Misture delicadamente mas completamente. Incube a 22 ° C, numa câmara escura.
5. análise da proteína importação para cloroplastos
Nota: Após transformação mediada por PEG de protoplastas, tempo de incubação varia de 8 a 24 h.
-
Microscopia de fluorescência
- Lugar de 10 µ l da solução de protoplastos em um vidro de slide usando uma pipeta com uma ponta aparada e cuidadosamente cobrir com uma lamela para não danificar os protoplastas.
- Lugar do slide no palco de um microscópio de fluorescência, equipado com filtro de excitação/emissão define para observar a proteína verde fluorescente (GFP) e autofluorescência da clorofila.
- Capture imagens com uma câmera e processo de refrigeração dispositivo de carga acoplada (CCD) imagens usando um software de edição de imagem para produzir imagens coloridas de pseudo.
-
Extração de proteínas totais e immunoblotting
- Prepare o tampão de desnaturação contendo 2,5% (p/v) dodecylsulfate de sódio (SDS) e 2% (v/v) 2-Mercaptoetanol.
Nota: Importação de proteínas em cloroplastos pode ser quantificada através da medição do grau de peptídeo de trânsito através de immunoblot análise usando anticorpo anti-GFP de processamento. - Transferência de protoplastas em um tubo de centrífuga e centrifugar 46 x g por 4 min.
- Remover o sobrenadante e adicionar 80 µ l de tampão de desnaturação. Vórtice vigorosamente por 5 s e adicionar 5 x tampão de amostra SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DTT, SDS 10% (p/v), azul de bromofenol 0,05% (p/v) e 50% (v/v) glicerol). Misture bem e deixe ferver por 10 min.
- Esta amostra de proteína, sujeitas ao padrão SDS-PAGE e immunoblotting com anticorpos anti-GFP.
- Prepare o tampão de desnaturação contendo 2,5% (p/v) dodecylsulfate de sódio (SDS) e 2% (v/v) 2-Mercaptoetanol.
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Representative Results
A importação de proteínas em cloroplastos pode ser examinada usando duas abordagens: análise de microscopia e immunoblot fluorescência após separação SDS-Página-mediada. Aqui, usamos hemácias-nt:GFP, uma fusão construir codificação os 79 resíduos de aminoácidos N-terminal de hemácias contendo o peptídeo de trânsito fundido a GFP. Quando as proteínas são importadas em cloroplastos, fluorescência verde sinaliza da proteína alvo hemácias-nt:GFP deve mesclar com os sinais fluorescentes vermelhos de clorofila autofluorescência, como examinado por microscopia de fluorescência (Figura 1). A sobreposição de perto dos dois sinais indica a importação de proteínas em cloroplastos. Muitas vezes os sinais GFP espalhados por todo os cloroplastos ou estão concentrados no centro dos cloroplastos, com sinais difusos fracamente durante todo os cloroplastos, dependendo da proteína individual. A importação de proteínas pode ser confirmada pela análise de immunoblot usando anticorpo GFP. Proteínas totais são preparadas a partir de protoplastas e separadas por SDS-PAGE, seguido de análise ocidental do borrão (Figura 2). Na maioria dos casos, duas bandas de proteína devem ser observadas no immunoblot se uma proteína foi correctamente importada no cloroplastos: a banda superior corresponde o precursor completo e a banda inferior ao formulário processado após a importação em cloroplastos. A quantidade de formulário processado da proteína deve aumentar de forma tempo-dependente. Tais resultados implicaria que a proteína hemácias-nt:GFP é importado em cloroplastos em protoplastas de Arabidopsis. Além disso, a relação do formulário transformado para a quantidade total de proteínas expressas (o formulário processado mais precursor) pode ser usada como uma medida da eficiência de importação. Se necessário, os cloroplastos podem ser purificados de suavemente lisados protoplastas, e proteínas da fracção cloroplasto podem ser analisadas pela mancha ocidental para confirmar ainda mais a importação de proteínas em cloroplastos.
Figura 1. Localização na vivo de GFP fundidos para o peptídeo de trânsito hemácias de cloroplastos.
Imagens foram tomadas 18 h após transformação sob um microscópio de fluorescência. Verde (um), vermelho (b), mesclado (c) e brilhante (d) rótulos indicam GFP imagem, clorofila, uma imagem mesclada de dois sinais e imagem de campo claro, respectivamente. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise ocidental do borrão de hemácias-nt:GFP para investigar importação de proteínas em cloroplastos.
Extratos de proteínas totais foram preparados a partir de protoplastas e separados por 10% (p/v) SDS-PAGE, seguido de análise ocidental do borrão usando anticorpo anti-GFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de protoplastas de Arabidopsis para estudar a importação de proteínas em cloroplastos. Este método é muito poderoso para investigar o processo de importação de proteínas. Esta técnica simples e versátil é útil para examinar o direcionamento das proteínas de carga pretendida para os cloroplastos. Usando esse método, protoplastas são preparados a partir de tecidos de folha de Arabidopsis11,12 , que podem ser obtidos de plantas em vários estágios de crescimento diferentes desde muito cedo até folhas totalmente maduras. No entanto, deve ter cuidado ao cultivo de plantas usadas para preparação de protoplastos. Deve-se usar plantas muito saudáveis, como protoplastas, preparados a partir de plantas saudáveis podem suportar muitas etapas envolvidas na transformação mediada por PEG. Outra precaução importante é a utilização de soluções novas. Pequenas alterações nas concentrações das soluções grandemente podem danificar os protoplastas, já que eles são frágeis e muito sensíveis à pressão osmótica.
Temos vindo a utilizar protoplastas para estudar a importação de proteínas em cloroplastos9,13,14. Baseado nestes estudos, fomos capazes de dissecar os motivos da sequência de diversos peptídeos de trânsito. Além disso, usamos protoplastas para identificar os sinais de direcionamentos (região carregada positivamente, flanqueando o C-terminal do domínio transmembrana) de proteínas direcionadas à membrana do cloroplasto15envelope exterior. Da mesma forma, nós costumávamos protoplastas para investigar importação de proteínas para as mitocôndrias10. Mais uma vez, fomos capazes de identificar muitos motivos de sequência crítica nos presequences de proteínas mitocondriais. Além disso, as proteínas da membrana externa das mitocôndrias contêm também uma região carregada positivamente, flanqueando o domínio transmembranar como seu direcionamento de sinal15. Estes sinais de direcionamentos compartilham um alto grau de similaridade na composição de aminoácidos. Na verdade, proteínas cloroplasto foram mistargeted à mitocôndria durante em vitro importação experimentos16. No entanto, cloroplasto e proteínas mitocondriais são especificamente importadas em seu alvo organelas em vivo. Assim, protoplastas podem ser usados para elucidar os mecanismos subjacentes como direcionamento a especificidade é determinado entre cloroplastos e mitocôndrias.
Os protoplastas representam um sistema ideal para a análise da importação de proteínas em cloroplastos na vivo. No entanto, uma ressalva é que os protoplastas podem ser sob condições de forte estresse como ferindo o stress. Assim, não podemos descartar a possibilidade que tal estresse pode afetar o processo de importação. Assim, em certos casos, os resultados devem ser interpretados com cautela quando os protoplastas são utilizados para experiências de importação de proteínas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi realizado com o suporte do programa de pesquisa cooperativa para a agricultura ciência e tecnologia de desenvolvimento (projeto n. º PJ010953012018), administração de Desenvolvimento Rural e a concessão da Fundação Nacional de pesquisa (Coreia) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (n º 2016R1E1A1A02922014), República da Coreia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
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