Summary
Een niet-invasieve in vivo imaging protocol dat is gestroomlijnd en kosteneffectieve, beschrijven we met behulp van L-012, een chemiluminescentie luminol-analoog, om te visualiseren en te kwantificeren van reactieve zuurstof soorten (ROS) gegenereerd in een excisional wond muismodel.
Abstract
De generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is een kenmerk van inflammatoire processen, maar in overmaat, oxidatieve stress is sterk betrokken bij verschillende ziektebeelden zoals kanker, atherosclerose en diabetes. Wij hebben eerder getoond dat disfunctie van de nucleaire factor (erythroid afkomstige 2)-2 (Nrf2) leuk / Kelch-achtige erythroid cel afkomstige eiwit 1 (Keap1) signalering traject leidt tot extreme ROS onbalans tijdens cutane wondgenezing bij diabetes. Aangezien ROS niveaus een belangrijke indicator voor voortgang zijn van wondgenezing, zijn specifieke en nauwkeurige kwantificering technieken waardevol. Verscheidene in vitro tests voor het meten van ROS in cellen en weefsels zijn beschreven; Zij bieden echter slechts een enkele cumulatieve meting per monster. Meer recentelijk hebben de ontwikkeling van indicatoren op basis van eiwitten en beeldvormende modaliteiten toegestaan voor unieke Spatio analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is een derivaat van luminol dat kan worden gebruikt voor zowel in vivo en in vitro chemiluminescentie detectie van ROS gegenereerd door NAPDH-oxidase. L-012 stoot een sterker signaal dan andere tl sondes en heeft aangetoond dat zowel gevoelige en betrouwbare voor het opsporen van ROS. De tijd vervallen toepasselijkheid van L-012-vergemakkelijkt imaging biedt waardevolle informatie over inflammatoire processen terwijl het verminderen van de noodzaak van offer en over het algemeen het aantal studie dieren te verminderen. Hier beschrijven we een protocol met behulp van L-012-vergemakkelijkt in vivo imaging om te kwantificeren oxidatieve stress in een model van excisional wondgenezing met behulp van diabetesmuizen met lokaal disfunctionele Nrf2/Keap1.
Introduction
Zuurstof metabolieten gegenereerd door inflammatoire processen dragen bij aan verschillende signalering cascades evenals destructieve wijziging van cellulaire componenten1. Met behulp van gevoelige en specifieke technieken voor het meten van de ROS is essentieel voor het bestuderen van inflammatoire processen en karakteriseren van de effecten van oxidatieve stress. In vivo imaging is waardevol vanwege de mogelijkheid om dynamische ruimtelijke en temporele gegevens in levend weefsel te verstrekken. L-012 is een synthetische chemiluminescentie sonde die is zeer gevoelig voor superoxide anionen en produceert een hogere lichtintensiteit dan andere tl sondes in cellen, weefsels en bloed1,2,3, 4. het heeft met succes gewerkt voor in vivo imaging in lymfkliertest modellen te bestuderen van de verschillende ontstekingsziekten, met inbegrip van artritis en colitis5,6. Het moet nog worden ingezet in een gevestigde cutane wond genezing model. Meting van ROS gegenereerd is even relevant zijn voor het beoordelen van de voortgang van de wondgenezing onder verschillende omstandigheden. De gevoeligheid en de noninvasive aard van deze methode maakt het een veelbelovende techniek voor het bestuderen van de wondgenezing lymfkliertest modellen.
Nrf2 is een belangrijke motor van de antioxidant-respons en een transcriptionele factor met specificiteit voor de antioxidant respons-element (ARE) gemeenschappelijk aan de promotor gebieden van verschillende antioxidant enzymen8. Bij het ontbreken van oxidatieve stress, is Nrf2 afgezonderd in het cytoplasma door Keap1, waardoor vervolgens haar ubiquitination en afbraak. Onbalans van de Nrf2/Keap1-traject heeft betrokken bij ongepast redox homeostase en vertraagde wondgenezing in de omgeving van verhoogde oxidatieve stress9. Wij hebben eerder aangetoond dat de onderdrukking van de Keap1 verhoogde Nrf2 activiteit stimuleert en bevordert redding van pathologische cutane wondgenezing in diabetische wonden9.
Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van L-012-bijgewoonde bioluminescentie imaging voor het meten van ROS niveaus in een excisional cutane wond genezing model, dat is van cruciaal belang voor het benadrukken van de associatie tussen ROS en wondgenezing. Deze techniek toont real-time wijzigingen in oxidatieve belasting binnen wonden en onmiddellijke periferie. Voorts staat deze methode voor snelle evaluatie van interventies en mechanismen die invloed redox behandeling. Hier gebruiken we een model van Keap1 knockdown voor het herstel van de redox homeostase te evalueren van de toepasbaarheid van onze strategie. Omdat onze techniek niet-invasief is en wonden ongestoord zijn, kan hetzelfde dier worden gebruikt voor verdere bevestigende analyses op basis van histologie of cel lysates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van New York University School of Medicine. Alle muizen bevinden zich achter een barrière en al het personeel passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.
1. dag 0: Voorbereiding van lymfkliertest Model van Excisional wondgenezing
- Anesthetize (Leprdb/db) diabetesmuizen, leeftijd van 8-12 weken, met respiratoire Isofluraan van 2%. Bevestigen dat elke muis heeft zijn goed verdoofd met behulp van de voet pad snuifje test. Steriele oogbeschadigingen en/of smeermiddel toepassen op elk van beide ogen ter voorkoming van irritatie van droogte. Onderzoekers moeten hun institutionele veterinair personeel richtsnoeren volgen wanneer anesthetizing van dieren met behulp van Isofluraan.
- Weeg de muizen en opnemen van het lichaamsgewicht voor elke muis. Bevestig de diabetische status van dieren door de opname van de bloedglucose van elk dier met behulp van een glucometer.
- Desinfecteer procedurele werkruimte en anesthesie apparatuur. Verwijderen van de dorsale haren van de muizen met behulp van een tondeuse, gevolgd door toepassing van haar verwijdering lotion te vegen weg overtollige haren. Gebruik van alcohol doekjes voor het reinigen van de blootgestelde huid, tweemaal, en laten drogen.
- Maak twee 10 mm volledig-dikte wonden uitbreiden via de panniculus carnosus met behulp van steriele 10 mm biopsie stoten volgens een gevestigde excisional wond genezing techniek7,8. Steriele handschoenen gebruiken voor alle overleving chirurgie. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten in zakken voorafgaand aan chirurgie en open alleen op het chirurgische gebied.
- Splint de wonden open met behulp van een 0,5 mm dikke siliconen vel met 10 mm circulaire knipsels en veilige de stents bij het gebruik van de plaats onderbroken 4-0 zijde hechtingen.
- Volgende chirurgie, dieren uit narcose verwijderen en plaatsen op de verwarming pad om goede herstel. Van de nota, als dierlijke lichaamstemperatuur tijdens de procedure daalt, kan het dier worden verplaatst naar de verwarming pad eerder tot een minimum beperken van warmteverlies lichaam onder verdoving. Volgen de dieren totdat ze wakker en mobiele zijn.
- Zodra het volledig is hersteld, terug dieren naar afzonderlijke kooien, met voedsel en water (zorgen voor dat wat te eten is op de vloer van de kooi voor postoperatieve verrijking). Verstrek papiersnippers handdoeken als extra nesten materiaal voor 2 weken. Dieren die ondergaan hebben chirurgie met andere dieren, om te voorkomen dat negatieve interacties en wijzigingen in de status van de genezende wond niet huis.
- Voor verlichting van postoperatieve pijn, injecteren muizen subcutaan met buprenorfine bij 0,1 mg/kg lichaamsgewicht tweemaal per dag, beginnen onmiddellijk na de procedure, voor 3 dagen.
2. dag 1: Voorbereiding van Keap1 siRNA
Opmerking: Bereiden alle behandelingen binnen een kabinet bioveiligheid.
- SiRNA verdunning door het combineren van 37,5 µL van verminderde serum medium met 12,5 µL van 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) in een 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs bereiden.
- Maak liposoom verdunning door het combineren van 25 µL van verminderde serum medium met 25 µL van liposoom mix in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
- Voeg 50 µL van siRNA verdunning met 50 µL liposoom verdunning dropwise (1:1 deel), en zachtjes meng.
- Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 50 µL van 2% methylcellulose gel in water en meng zachtjes op en neer waarbij eveneens.
- Behandelen van elk dier kan beschikken over beide een onzin siNS (control) of siKeap1 (experimenteel). Het toepassen van de gel op de bovenkant van de wond. Wikkel de romp van het dier met doorzichtige folie dressing gel in plaats te houden, houden de ledematen vrij te houden van de mobiliteit.
3. dag 3: Bereiding van L-012 oplossing
Opmerking: Bereiden alle reagentia in een kabinet bioveiligheid.
- Bereiden in een 1,5 mL microcentrifuge buis, L-012 in 1 X PBS met een concentratie van 0,5 mg/100 mL.
- Handmatig vortex de microcentrifuge buis. De L-012 doet niet volledig oplossen in het PBS, maar het dient gelijkmatig in de vloeistof te worden geschorst. Van de nota, probeer niet te ontbinden L-012 in water Voorkom verontrustende fysiologische elektrolyt balans na injectie.
- Breng de oplossing kwantitatief over in een spuit van 1 mL met behulp van een naald 27 G.
Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing van de L-012 beschermen tegen licht.
4. dag 3: In Vivo Imaging van diabetische wonden
- Anesthetize muizen met respiratoire Isofluraan van 2%. Onderzoekers moeten hun institutionele veterinair personeel richtsnoeren volgen wanneer anesthetizing van dieren met behulp van Isofluraan. Bevestigen dat elke muis heeft zijn goed verdoofd met behulp van de voet pad snuifje test. Steriele oogbeschadigingen en/of smeermiddel toepassen op elk van beide ogen ter voorkoming van irritatie van droogte.
- Zachtjes verwijderen de transparante film dressing van de muizen zonder verstoring van de wonden.
- De muizen in de beeldvorming kamer in hun respectieve bestellingen plaatsen. Ingesteld om te handhaven juiste O2 niveaus in de zaal, de imaging systeem-instroom en de inductie kamer O2 niveaus op 1,0 L/min.
- Het imago van de muizen voor bioluminescentie en foto op basislijn vóór injectie van L-012 compound.
- Veeg de buik met alcohol doekjes en laten drogen. Het uitvoeren van een intraperitoneale injectie van de oplossing van de L-012 met 5 mg per lichaamsgewicht van 200 g met behulp van een naald 27-gauge. Bijvoorbeeld, moet een muis met een gewicht van 20 g 0.5 mg L-012 ontvangen.
- Onmiddellijk na de L-012, elektronische injectie, zet de muizen weer hun respectieve plaatsen in de beeldvorming zaal. Het imago van de muizen in de loop van 60 minuten, 1 minuut met tussenpozen van 4 minuten. De 10-mm wond definiëren als de regio van belang voor het bepalen van de mate van ROS.
- Volgende chirurgie, dieren uit narcose verwijderen en plaatsen op de verwarming pad om goede herstel. Volgen de dieren totdat ze wakker en mobiele zijn.
- Zodra het volledig is hersteld, terug dieren naar afzonderlijke kooien, behoud van de zelfde post-operatieve verrijking omgeving eerder beschreven in 1.6. Dieren die ondergaan hebben chirurgie met andere dieren, om te voorkomen dat negatieve interacties en wijzigingen in de status van de genezende wond niet huis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drie dagen na het maken van bilaterale wonden volgens een gevestigde excisional wond model (figuur 1A), bevinden diabetesmuizen zich in de beeldvorming zaal. Een eerste foto en een zekere mate van bioluminescentie worden genomen vóór injectie van L-012 voor achtergrond signaal (figuur 1B). Na intraperitoneale injectie met de oplossing van de L-012, de muizen worden verplaatst in de kamer en bioluminescentie is gevisualiseerd in gebieden van de wond waar de ROS wordt gedetecteerd (Figuur 1 c). Na het selecteren van de juiste beeldvorming en analyse instellingen zoals aangegeven in Figuur 2, gaat u verder met beeldvorming. Bioluminescentie wordt geregistreerd voor 1 minuut 5 minuten tussenpozen in de loop van 60 minuten (Figuur 3). Hieruit blijkt de Bioluminescentie verzadiging van de regio van belang na verloop van tijd. In onze diermodel, werd optimale imaging tijd tot volledige verzadiging van de L-012 bepaald als 50 min, waarna geen opmerkelijk verschil in bioluminescentie werd gewaardeerd. Ditmaal zal verschillen afhankelijk van het dier model gebruikt en moet worden onafhankelijk bepaald en geoptimaliseerd voor uiteenlopende wond modellen afhankelijk van grootte, dierlijke type, behandeling, enz.
Een gebied van belang (ROI) met het oog op het kwantificeren van de Bioluminescentie beperkt tot het gebied van diabetische wond wordt op het overlaybeeld (Figuur 4) getekend. Deze ROIs zijn op dezelfde manier gedefinieerd voor alle wonden met inbegrip van vóór L-012 injectie (figuur 4A), en na L-012 injectie in onzin siRNA-behandeld (figuur 4B) en Keap1 siRNA-behandelde muizen (figuur 4C). Bioluminescentie werd berekend door de totale graven van lichtintensiteit door het gebied. Tabel 1 toont de berekeningen opgenomen in een grafiek in Figuur 4 d. De onzin siRNA-behandelde diabetische wonden had 45,775 11,649 bioluminescentie/cm2, terwijl Keap1 onderdrukking in 19,405 5,939 bioluminescentie/cm2 (gemiddelde SD resulteerde). Een Student t-test toonde een aanzienlijk verminderde bioluminescentie (p = 0.042) in de Keap1 siRNA-behandelde wond in vergelijking met de onzin siRNA-behandelde wond, correleren met lagere oxidatieve belasting met hogere Nrf2 activiteit (figuur 4 D). om te bevestigen dat het relatieve niveau van ROS gevisualiseerd door L-012 siNS en siKeap1 correlaat met andere gevestigde middelen om ontsteking te meten, we geanalyseerd 10 dag wond weefselsecties. H & E vlekken toonde verminderde cellulaire infiltratie in siKeap1-behandeld wonden in tegenstelling tot siNS-behandelde degenen, die aangeeft verminderd inflammatoire morfologie (figuur 5A). Immunoreactivity van F4/80, een eiwit macrofaag marker, (rode fluorescentie) op de wond weefselsecties geopenbaard verminderd macrofagen inKeap1 si behandeld wonden in vergelijking met siNS-behandeld wonden (figuur 5B). Dit blijkt verder dat de niveaus van de ROS gevisualiseerd door L-012 nauwkeurig en correlate met andere gevestigde ROS meting modellen zijn. Kritisch, deed toepassen van deze techniek niet vergen te offeren van dieren voor weefselsecties zoals is vereist voor H & E en immunofluorescentie kleuring.
Figuur 1: experimentele opstelling voor imaging. (A) diabetesmuizen raken gewond met behulp van een gevestigde excisional wond-model. (B) een basislijn overlay van foto met bioluminescentie pre-L-012 injectie. (C) na intraperitoneale injectie met L-012, ROS is gevisualiseerd. Luminescentie schaal voor B en C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Beeld en analyse instellingen in in vitro imaging systeemprogramma. (A) Selecteer "Imaging Wizard" op het bedieningspaneel van de overname (rode pijl). (B) "Imaging bioluminescentie" is de beeldvorming mode geselecteerd. (C) "Open filter" is geselecteerd als de meettechniek. (D) Imaging onderwerp geselecteerd is "muis" en de "time-serie studie" optie is geselecteerd. Het totale aantal segmenten en vertragingstijd tussen segmenten wordt ingevoerd. (E) Selecteer "verwerven Sequence" om verder te gaan met beeldvorming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: longitudinale studies voor in vivo ROS imaging. Diabetesmuizen zijn beeld voor 1 minuut na intraperitoneale injectie met L-012 op 5 minuten intervallen in de loop van 60 min. rode cirkels: ROI. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: kwantificeren van de Bioluminescentie. Foto's met bioluminescentie overlay van diabetische wonden (A) vóór L-012 injectie, (B) met wonden behandeld met zonden na L-012 injectie, en (C) wonden behandeld met siKeap1 na L-012 injectie. (D) kwantificering van gemiddelde bioluminescentie gedeeld door de oppervlakte van de ROI voor zonden en siKeap1 behandelde wonden. Gele cirkels: ROI. Gegevens worden weergegeven als mean±standard afwijking; p < 0,05, n = 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: ROS correlaties met immunohistochemische vlekken. (A) H & E vlekken van diabetische wond weefselsecties tien dagen toonde verminderde cellulaire infiltreren als bewijs van verminderde inflammatoire morfologie in de siKeap1 behandeld wonden in vergelijking met de siNS -wonden behandeld. (B) F4/80 immunofluorescentie (rood) toonde verminderde aantal macrofagen in siKeap1 behandeld wond secties tien dagen in vergelijking met hun siNS -behandeld tegenhangers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| ROI | si | Totaal graven | AVG graven | STDEV graven | Gebied [cm²] | Tellingen/oppervlakte | Gemiddelde graven/oppervlakte |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| ROI 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| ROI 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| ROI 4 | NS | 1.24E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| ROI 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| ROI 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| ROI 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tabel 1: kwantificeren van de Bioluminescentie voor gedefinieerd ROIs. Bioluminescentie is gemeten voor elke ROI en gestandaardiseerd ten opzichte van de oppervlakte. Berekeningen voor gemiddelde, de standaardafwijking en de standaardfout worden dienovereenkomstig berekend. ROI 1, 2, 3 en 4 vertegenwoordigen ROI uit wonden van biologische herhalingen van zonden behandeld diabetische wonden en ROI 5, 6, 7 en 8 vertegenwoordigen ROIs van biologische herhalingen van siKeap1 behandeld diabetische wonden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gemeenschappelijke technieken voor het meten van ROS hebben beperkt gebleven door complexe protocollen waarvoor weefsel extractie of vergelijkbare invasieve technieken. In de afgelopen jaren zijn de metingen van oxidatieve stress gemeld op basis van innovatieve beeldvormende modaliteiten, waardoor voor Spatio evaluaties9,10,11. L-012 heeft een aantal voordelen als een chemiluminescentie sonde ten opzichte van luminol, lucigenin en MCLA1,4. De compound is niet giftig, gemakkelijk geabsorbeerd en heeft veel sterker bioluminescentie in vergelijking met luminol of soortgelijke sondes12. Kritisch, L-012 kan worden veilig beheerd meerdere malen in het continuüm voor longitudinale analyse zonder nadelige gevolgen of schade aan dier6modellen. Deze strategie vereist beperkte speciale opleiding, en de noodzakelijke apparatuur is beschikbaar in de meeste onderzoekslaboratoria, waardoor het een breed toegankelijke protocol.
Voor optimaal gebruik, is het raadzaam dat de reagentia worden goed up to date en beschermd tegen licht te voorkomen aantasting. Humanisering van wonden door stenting voorziet lymfkliertest wonden te genezen door middel van migratie en opnieuw epithelialization, in tegenstelling tot door aanzienlijke inkrimping. Hechtingen moeten tweederde van de weg door de stent omtrek teneinde wond randen in plaats worden geplaatst. Muizen met doorzichtige folie dressing nadat gel applicatie zorgt ervoor dat actuele behandelingen in plaats blijven het te verpakken. Om te voorkomen dat zichzelf toegebrachte wonden in de muizen, die resultaten verwarren kunnen, kan bittere smaak spray worden toegepast op de periferie en hechtdraad knopen om te ontmoedigen bijten. L-012 heeft een beperkte oplosbaarheid in PBS maar zullen vormen een schorsing door repetitieve pipetteren van de oplossing. Bovenstaande maatregelen voor probleemoplossing samenhang in het geheel verschillende wonden, elimineren van Inter gebruiker variabiliteit met behoud van dierlijke comfort. Aangezien deze techniek is gebaseerd op de intraperitoneale injectie van een oplossing in een dierlijk model, zijn er verschillende storende factoren die inherent zijn aan de dieren die niet kunnen worden gecontroleerd. Bijvoorbeeld, de lokale doorbloeding en de daaropvolgende absorptie en de lokalisatie van L-012 tot de gebieden van belang niet kunnen worden gedicteerd. Deze variabele kan echter worden verzacht door het gebruik van een dier, zoals haar eigen interne controle zodanig dat een wond kan worden behandeld met siNS en de andere met de siKeap1.
Wij rapporteren over het nut van een strategie voor het in vivo onderzoek van ROS in een cutane wond genezing model. In onze huidige studie, behandeling van wonden met Keap1 siRNA geleid tot verminderde oxidatieve last die onze interpretatie van de betekenis van de Nrf2 bevestigt /Keap1 traject voor antioxidant behandeling. Hoewel deze methode geschikt is voor kwantitatieve analyse, zijn er een aantal belangrijke beperkingen. Terwijl L-012 hoogst-gevoelig is, het is niet specifiek voor ROS en heeft aangetoond dat ook reageren op reactieve stikstof soorten6. Nadere analyse met gerichte sondes en immunoassay gebaseerde methoden als aanvulling op deze aanpak door middel van verbeterde specificiteit en subcellular localisatie van ROS correlaten13. Het voorgestelde mechanisme voor L-012-gebaseerde bioluminescentie omvat de oxidatie van L-012 door moleculaire zuurstof door de activiteit van peroxidase in combinatie met H2O212. Dit beperkt het gebruik van deze techniek voor het bestuderen van de anti-oxidant enzym remmers die met peroxidase samenwerken. Meer gedetailleerde analyse wordt specifiek willen kwantificeren ROS dan superoxide anion of reactieve stikstof soorten metabolieten is niet mogelijk met de huidige strategie.
Gezien de hoge gevoeligheid van L-012 voor het opsporen van ROS in grote lijnen, is het gemakkelijk aanpasbaar voor verschillende cutane wondgenezing en andere modellen van weefsel. We hebben aangetoond dat de opportuniteit van deze techniek voor de beoordeling van de gevolgen van de redox van gerichte therapeutics op diabetische wonden zoals RTA 408 en de lipoproteoplex levering van Keap1 siRNA14,15. Gezien de belangrijke sterke punten van dit protocol, is er enorm potentieel voor de toekomst bij de toepassing van soortgelijke strategieën voor het bestuderen van ROS binnen dieper compartimenten via ex vivo benaderingen, gerichte ontledingen en organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen onthullingen aan verslag.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan de preklinische Imaging Core aan de NYU School of Medicine, met speciale dank aan Orlando Aristizabal en Youssef Zaim Wadghiri. De kern is een gedeelde bron slechts gedeeltelijk ondersteund door de Laura en Isaac Perlmutter Cancer Center ondersteuning Grant NIH/NCI 5P30CA016087 en NIBIB biomedische technologie Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Dit werk werd gesteund door de American Diabetes Association "Traject te stoppen-Diabetes" D.C. [subsidie nummer 1-16-ACE-08] en de NYU toegepast onderzoek Steunfonds aan P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
