Summary
Descriviamo un non-invasiva in vivo imaging protocol che è semplice e conveniente, utilizzando L-012, un a chemiluminescenza luminol-analogico, per visualizzare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate in un modello murino di excisional ferita.
Abstract
La generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è una caratteristica dei processi infiammatori, ma in eccesso, lo sforzo ossidativo è ampiamente implicato in varie patologie come il cancro, aterosclerosi e diabete. Precedentemente abbiamo indicato che la disfunzione del fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2)-come 2 (Nrf2) / degli eritrociti Kelch-come cellula-derivato proteina 1 (Keap1) segnalazione sentiero conduce ad estremo squilibrio ROS durante cutanea delle ferite in diabete. Poiché i livelli di ROS sono un importante indicatore di progressione della guarigione delle ferite, tecniche specifiche e accurata quantificazione sono preziosi. Sono stati descritti diversi saggi in vitro per misurare il ROS in cellule e tessuti; Tuttavia, essi forniscono solo una singola misurazione cumulativa per campione. Più recentemente, hanno consentito lo sviluppo di indicatori basati su proteine e modalità di imaging uniche analisi spazio-temporale. L-012 (C13H8ClN4NaO2) è un derivato di luminol che può essere utilizzato per sia in vivo che in vitro chemiluminescente rilevamento di ROS generati dall'ossidasi di NAPDH. L-012 emette un segnale più forte rispetto altre sonde fluorescenti e ha dimostrato di essere sensibile e affidabile per la rilevazione di ROS. L'applicabilità del lasso di tempo del L-012-facilitato imaging fornisce informazioni preziose sui processi infiammatori, riducendo la necessità del sacrificio e nel complesso riducendo il numero di animali di studio. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza L-012-facilitato in vivo imaging per quantificare lo sforzo ossidativo in un modello di excisional cicatrizzazione utilizzando topi diabetici con localmente disfunzionale Nrf2/Keap1.
Introduction
I metaboliti dell'ossigeno generati attraverso processi infiammatori contribuiscono a diverse cascate di segnalazione così come alterazione distruttiva delle componenti cellulari1. Utilizzando tecniche sensibili e specifiche per misurare il ROS è fondamentale per lo studio dei processi infiammatori e caratterizzare gli effetti dello stress ossidativo. In vivo imaging è prezioso a causa della sua capacità di fornire dati dinamici spaziali e temporali nel tessuto vivente. L-012 è una sonda chemiluminescente sintetica che è altamente sensibile per gli anioni superossido e produce un'intensità luminosa rispetto altre sonde fluorescenti in cellule, tessuti e sangue intero1,2,3, 4. è stato impiegato con successo per l'imaging in vivo in modelli murini per lo studio di parecchie malattie infiammatorie, tra cui l'artrite e colite5,6. Deve ancora essere impiegato in un modello di cicatrizzazione cutanea stabilita. Misura del ROS generati sono altrettanto rilevante per valutare la progressione della guarigione della ferita in condizioni diverse. La sensibilità e la natura non invadente di questo metodo rende una tecnica promettente per lo studio della guarigione delle ferite attraverso modelli murini.
Nrf2 è delle principali cause della risposta antiossidante e un fattore trascrizionale con specificità per l'elemento di risposta antiossidante (ARE) comune per le regioni promotrici di diversi antiossidanti enzimi8. In assenza di stress ossidativo, Nrf2 è sequestrato nel citoplasma di Keap1, che successivamente causa sua ubiquitinazione e degradazione. Squilibrio del pathway Nrf2/Keap1 è stato implicato nella omeostasi redox inappropriati e ritardata guarigione delle ferite nella regolazione di sforzo ossidativo aumentato9. Precedentemente abbiamo indicato che la soppressione di Keap1 stimola l'attività aumentata di Nrf2 e promuove il salvataggio di guarigione arrotolata cutanea patologica nei diabetici ferite9.
Qui descriviamo un protocollo che utilizza L-012-assistita bioluminescenza imaging per misurare i livelli di ROS in un modello di guarigione della ferita cutanea escissionale, che è fondamentale per evidenziare l'associazione tra ROS e la guarigione della ferita. Questa tecnica viene illustrato le modifiche in tempo reale in carico ossidativo all'interno di ferite e immediata periferia. Inoltre, questo metodo consente rapida valutazione degli interventi e meccanismi che influenzano la gestione delle redox. Qui usiamo un modello di atterramento Keap1 per il ripristino dell'omeostasi redox per valutare l'applicabilità della nostra strategia. Perché la nostra tecnica è non invasiva e ferite sono indisturbate, lo stesso animale può essere utilizzato per ulteriori analisi di conferma sulla base di istologia o cella lisati.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della New York University School of Medicine. Tutti i topi sono alloggiati dietro una barriera e tutto il personale indossano adeguati dispositivi di protezione personale.
1. giorno 0: Preparazione del modello murino di Excisional cicatrizzazione
- Anestetizzare topi diabetici (Leprdb/db), età compresa tra 8 – 12 settimane, con inhalational 2% isoflurane. Confermare che ogni mouse ha stato adeguatamente anestetizzato usando il piede pad pinch test. Applicare il lubrificante oculare sterile per ogni occhio per prevenire l'irritazione, secchezza. I ricercatori dovrebbero seguire linee guida del loro personale veterinario istituzionale quando anestetizzare gli animali utilizzando isoflurano.
- Pesare i topi e registrare il peso corporeo di ogni mouse. Confermare lo stato diabetico di animali registrando il glucosio di anima di ogni animale usando un glucometer.
- Disinfettare procedurali workspace e anestesia attrezzature. Rimuovere i peli dorsali dei topi utilizzando un tagliacapelli, seguita dall'applicazione di lozione per capelli rimozione per spazzare via i capelli in eccesso. Utilizzare salviettine imbevute di alcool per pulire la pelle esposta, due volte e lasciare per asciugare.
- Creare due ferite di pieno-spessore 10 mm che si estende attraverso il carnosus del pannicolo usando pugni biopsia sterile 10 mm secondo una consolidata di excisional cicatrizzazione tecnica7,8. Utilizzare guanti sterili per tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in sacchetti prima di chirurgia e aperto solo in campo chirurgico.
- Stecca le ferite aprono con un foglio di silicone spessa 0,5 mm con ritagli circolari di 10 mm e fissare gli stents in luogo utilizzando interrotti suture seta 4-0.
- Dopo chirurgia, rimuovere gli animali dall'anestesia e posizionare il cuscinetto per facilitare il corretto recupero di riscaldamento. Di nota, se la temperatura corporea degli animali diminuisce durante la procedura, l'animale deve essere manovrata al termocuscino all'inizio per minimizzare perdita di calore del corpo nell'ambito dell'anestesia. Monitorare gli animali fino a quando sono sveglio e mobile.
- Una volta completamente recuperato, tornare animali gabbie individuali, forniti di cibo e acqua (garantire che qualche cibo è il pavimento della gabbia per arricchimento post-operatorio). Forniscono gli asciugamani di carta tagliuzzata come ulteriore materiale di nidificazione per 2 settimane. Non casa animali che hanno subito la chirurgia con altri animali, per evitare interazioni avverse e modifiche a ferire lo stato di guarigione.
- Per alleviare il dolore post-operatorio, iniettare topi per via sottocutanea con buprenorfina a 0,1 mg/kg di peso corporeo due volte al giorno, a partire immediatamente dopo la procedura, per 3 giorni.
2. giorno 1: Preparazione di Keap1 siRNA
Nota: Preparare tutti i trattamenti all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Preparare la diluizione di siRNA combinando 37,5 µ l di siero riduttore terreno con 12,5 µ l di 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.
- Preparare la diluizione di liposomi combinando 25 µ l di siero riduttore terreno con 25 µ l di miscela di liposomi in una microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 50 µ l della diluizione di siRNA 50 µ l liposoma della diluizione goccia a goccia (1:1 in volume) e mescolare delicatamente.
- Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 50 µ l di gel 2% metilcellulosa in acqua e miscelare delicatamente pipettando su e giù.
- Trattare ogni animale con entrambi un si di assurditàNS (controllo) o siKeap1 (sperimentale). Applicare il gel sulla parte superiore della ferita. Avvolgere il tronco dell'animale con condimento di pellicola trasparente per mantenere il gel sul posto, mantenendo gli arti liberi di mantenere la mobilità.
3. giorno 3: Preparazione della soluzione L-012
Nota: Preparare tutti i reagenti in una cappa di biosicurezza.
- In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, preparare L-012 in 1X PBS a una concentrazione di 0,5 mg/100 mL.
- Vortice manualmente il tubo del microcentrifuge. Il L-012 non si scioglie completamente in PBS, tuttavia esso dovrebbe essere uniformemente sospeso nel liquido. Di nota, non tentare di sciogliere L-012 in acqua per evitare inquietante equilibrio fisiologico dell'elettrolito dopo l'iniezione.
- Trasferire la soluzione in una siringa da 1 mL, utilizzando un ago da 27 G.
Nota: Assicurarsi di proteggere la soluzione L-012 dalla luce.
4. 3 ° giorno: In Vivo Imaging delle ferite diabetiche
- Anestetizzare topi con inhalational 2% isoflurane. I ricercatori dovrebbero seguire linee guida del loro personale veterinario istituzionale quando anestetizzare gli animali utilizzando isoflurano. Confermare che ogni mouse ha stato adeguatamente anestetizzato usando il piede pad pinch test. Applicare il lubrificante oculare sterile per ogni occhio per prevenire l'irritazione, secchezza.
- Rimuovere delicatamente la medicazione di pellicola trasparente dai topi senza disturbare le ferite.
- Porre i topi nella camera imaging nei loro rispettivi ordini. Per mantenere livelli adeguati di2 O nella camera, impostare l'afflusso di sistema imaging e i livelli di2 camera O induzione a 1,0 L/min.
- I topi per bioluminescenza e fotografia alla linea di base prima dell'iniezione di L-012 composto di immagine.
- Pulire l'addome con salviettine imbevute di alcool e lasciare per asciugare. Eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione L-012 a 5 mg per peso corporeo 200g utilizzando un ago calibro 27. Ad esempio, un mouse peso 20 grammi dovrebbe ricevere 0,5 mg di L-012.
- Immediatamente dopo l'iniezione di L-012, rimettere i topi nelle rispettive posizioni nella camera di imaging. Immagine i topi nell'arco di 60 minuti, per 1 minuto a intervalli di 4 minuti. Definire la ferita di 10 mm come la regione di interesse per determinare il livello di ROS.
- Dopo chirurgia, rimuovere gli animali dall'anestesia e posizionare il cuscinetto per facilitare il corretto recupero di riscaldamento. Monitorare gli animali fino a quando sono sveglio e mobile.
- Una volta completamente recuperato, tornare animali gabbie individuali, mantenendo lo stesso ambiente di post-operatorio arricchimento precedentemente descritto nel punto 1.6. Non casa animali che hanno subito la chirurgia con altri animali, per evitare interazioni avverse e modifiche a ferire lo stato di guarigione.
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Representative Results
Tre giorni dopo la creazione di ferite bilaterale secondo un modello stabilito ferita excisional (Figura 1A), topi diabetici sono posizionati nella camera di imaging. Una fotografia iniziale e una misura della bioluminescenza sono tenuti prima dell'iniezione di L-012 al segnale di fondo (Figura 1B). A seguito di iniezione intraperitoneale con la soluzione di L-012, i topi vengono riposizionati nella camera e bioluminescenza è visualizzata nelle aree della ferita dove viene rilevato ROS (Figura 1). Dopo aver selezionato il corretto imaging e l'analisi delle impostazioni come indicato nella Figura 2, procedono con formazione immagine. Bioluminescenza è registrata per 1 minuto a intervalli di 5 minuti nell'arco di 60 minuti (Figura 3). Questo dimostra la saturazione di bioluminescenza della regione di interesse nel corso del tempo. Nel nostro modello animale, imaging ottima tempo per raggiungere la completa saturazione di L-012 è stata determinata per essere 50 min, dopo di che è stato apprezzato nessuna differenza notevole nella bioluminescenza. Questa volta sarà diverso a seconda dell'animale modello utilizzato e dovrebbe essere autonomamente determinato e ottimizzato per diversi modelli di ferita a seconda della dimensione, tipo di animale, trattamento, ecc.
Una regione di interesse (ROI) allo scopo di quantificare la bioluminescenza limitata all'area della ferita diabetica viene disegnata l'immagine di sovrapposizione (Figura 4). Questi ROIs sono definite allo stesso modo per tutte le ferite tra cui prima dell'iniezione di L-012 (Figura 4A) e dopo l'iniezione di L-012 in sciocchezze siRNA-trattati (Figura 4B) e Keap1 topi trattati con siRNA (Figura 4). Bioluminescenza è stato calcolato dividendo il numero totale di intensità della luce per la zona. La tabella 1 Mostra i calcoli rappresentati graficamente nella Figura 4. Le ferite diabetici trattati con siRNA sciocchezze avevano 45.775 11.649 bioluminescenza/cm2, mentre Keap1 soppressione ha provocato 19.405 5.939 bioluminescenza/cm2 (media SD). Un test di Student t-ha dimostrato una bioluminescenza significativamente in diminuzione (p = 0,042) nella Keap1 siRNA-trattati ferita rispetto l'assurdità siRNA-trattati ferita, correlando con basso carico ossidativo con più alta attività di Nrf2 (Figura 4 D). per confermare che i relativi livelli di ROS visualizzata da L-012 su siNS e siKeap1 correlano con altri mezzi previsti per misurare l'infiammazione, abbiamo analizzato 10 giorno ferita sezioni di tessuto. H & E le macchie hanno mostrato ridotta infiltrazione cellulare a siKeap1-trattati ferite Contrariamente siNS-quelli trattati, che indica ridotto infiammatoria morfologia (Figura 5A). Il immunoreactivity di F4/80, un indicatore del macrofago di proteina, (fluorescenza rossa) su sezioni di tessuto della ferita ha rivelato ridotto ferite di macrofagi a siKeap1 trattati rispetto siNS-trattati ferite (figura 5B). Questo dimostra ulteriormente che i livelli ROS visualizzati da L-012 sono accurate e correlano con altri modelli di misurazione di ROS consolidati. Criticamente, applicando questa tecnica ha fatto non necessitano di sacrificare gli animali per le sezioni di tessuto come è richiesto per H & E e colorazione di immunofluorescenza.
Figura 1: set-up sperimentale per l'imaging. (A) topi diabetici sono feriti utilizzando un modello di ferita di excisional stabilito. (B) una sovrapposizione della linea di base di fotografia con iniezione pre-L-012 bioluminescenza. (C) a seguito di iniezione intraperitoneale con L-012, ROS è visualizzata. Scala di luminescenza per B e C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Impostazioni di immagine e analisi in vitro programma sistema di imaging. (A) selezionare "Imaging guidata" sul pannello di controllo di acquisizione (freccia rossa). (B) "Bioluminescenza Imaging" è la modalità di imaging selezionata. (C) "filtro aperto" è selezionato come la tecnica di misurazione. (D) Imaging soggetto selezionato è "mouse" e viene selezionata l'opzione "tempo studio di serie". Il numero totale di segmenti e tempo di ritardo tra i segmenti è di input. (E) selezionare "sequenza di acquisire" per procedere con la formazione immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: studi longitudinali di in vivo imaging ROS. Topi diabetici sono Imaging per 1 minuto dopo l'iniezione intraperitoneale con L-012 alle 5 minuti intervalli nel corso di 60 min. Red circles: ROI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: quantificazione bioluminescenza. Fotografie con sovrapposizione di bioluminescenza delle ferite diabetiche (A) prima dell'iniezione di L-012, (B) con ferite trattati con peccati dopo l'iniezione di L-012 e (C) con le ferite trattate con siKeap1 dopo l'iniezione di L-012. (D) quantificazione della bioluminescenza medio diviso per area di superficie della ROIs per peccati e siKeap1 ferite trattate. Giallo cerchi: ROI. I dati sono rappresentati come deviazione di mean±standard; p < 0.05, n = 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: ROS correlazioni con le macchie di immunohistochemical. (A) H & E macchie di diabetico sezioni di tessuto della ferita alle 10 giorni ha mostrato ridotta cellulare si infiltrano in come prova della morfologia ridotta infiammatoria nel siKeap1 trattati ferite rispetto siNS -trattate le ferite. (B) F4/80 l'immunofluorescenza (rosso) ha mostrato la riduzione del numero dei macrofagi a siKeap1 trattati ferita sezioni alle 10 giorni rispetto ai loro siNS -trattate controparti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| ROI | si | Conteggi totali | Conteggi di AVG | StDev conteggi | Area [cm ²] | Conteggi/superficie totale | Conteggi/area media |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| ROI 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| ROI 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| ROI 4 | NS | 1.24 E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| ROI 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13 E + 04 | 1.94E + 04 |
| ROI 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| ROI 7 | Keap1 | 4.92 E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30 E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tabella 1: quantificazione bioluminescenza per definito ROIs. Bioluminescenza è misurato per ogni ROI e standardizzata relativa superficie. Calcolo di media, deviazione standard, errore standard e è calcolata di conseguenza. ROI 1, 2, 3 e 4 rappresentano ROI dalle ferite del biologici ripetizioni dei peccati considerati diabetiche ferite e ROI 5, 6, 7 e 8 rappresentano ROIs da ripetizioni biologici di siKeap1 trattato le ferite diabetiche.
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Discussion
Tecniche comuni per la misurazione di ROS sono state limitate tramite protocolli complessi che richiedono l'estrazione di tessuto o allo stesso modo le tecniche invasive. Negli ultimi anni, le misure dello sforzo ossidativo sono state segnalate sulla base di modalità di imaging innovative, consentendo in tal modo per valutazioni spatiotemporal9,10,11. L-012 ha diversi vantaggi come una sonda chemiluminescente rispetto al luminol, lucigenin e MCLA1,4. Il composto è non tossico, facilmente assorbito, e ha molto più forte bioluminescenza rispetto al luminol o simili sonde12. Criticamente, danno all'animale modelli6o L-012 può essere somministrata più volte nel continuum per analisi longitudinale senza effetti negativi. Questa strategia richiede una limitata formazione speciale, e l'attrezzatura necessaria è prontamente disponibile nella maggior parte dei laboratori di ricerca, rendendolo un protocollo ampiamente accessibile.
Per un uso ottimale, suggeriamo che i reagenti essere correttamente aggiornati e protetti dalla luce per evitare il degrado. Umanizzare le ferite attraverso stenting consente murine ferite di guarire attraverso la migrazione e la riepitelizzazione, al contrario di significativa contrazione. Suture devono essere posizionate due terzi del cammino attraverso il perimetro di stent per fissare i bordi della ferita in luogo. Confezionamento di topi con pellicola trasparente medicazione dopo applicazione di gel garantisce che i trattamenti topici rimangono in posto. Per evitare ferite inflitte nei topi, che possono confondere i risultati, sapore amaro spray può essere applicato ai nodi periferici e sutura per scoraggiare mordere. L-012 ha limitato solubilità in PBS, ma si forma una sospensione di pipettaggio ripetitivo della soluzione. Misure di risoluzione dei problemi garantire la coerenza tra diverse ferite, eliminando la variabilità inter-utente pur mantenendo il comfort degli animali. Poiché questa tecnica si basa sull'iniezione intraperitoneale di una soluzione in un modello animale, esistono diversi fattori d'interferenza inerente agli animali che non possono essere controllati. Ad esempio, il flusso sanguigno locale e conseguente assorbimento e localizzazione di L-012 per le aree di interesse non può essere dettate. Tuttavia, questa variabile può essere mitigata attraverso l'uso di un animale come un proprio controllo interno tale che una ferita può essere trattata con siNS e l'altra con il siKeap1.
Segnaliamo sull'utilità di una strategia per lo Studio in vivo di ROS in un modello di cicatrizzazione cutanea. Nel nostro studio presente, trattamento delle ferite con siRNA Keap1 ha provocato la diminuzione carico ossidativo che conferma la nostra comprensione del significato del Nrf2 / viaKeap1 per antiossidante di movimentazione. Mentre questo metodo consente una analisi quantitativa, ci sono una serie di limitazioni importanti. Mentre L-012 è altamente sensibile, esso non è specifico per ROS e ha dimostrato di reagire anche a di specie reattive dell'azoto6. Ulteriore analisi con sonde mirati e metodi basati su test immunologico completano questo approccio attraverso una maggiore specificità e localizzazione subcellulare di ROS correla13. Il meccanismo proposto per L-012-based bioluminescenza coinvolge l'ossidazione di L-012 dall'ossigeno molecolare attraverso l'attività di perossidasi in combinazione con H2O212. Questo limita l'utilizzo di questa tecnica per lo studio di inibitori dell'enzima antiossidante che interagiscono con perossidasi. Un'analisi più dettagliata si intende specificamente quantificare ROS diverso da quello dell'anione superossido o metaboliti di specie reattive dell'azoto non è possibile con l'attuale strategia.
Data l'elevata sensibilità del L-012 per la rilevazione di ROS in linea di massima, è facilmente adattabile per la guarigione della ferita cutanea vari e altri modelli di tessuto. Abbiamo dimostrato la convenienza di questa tecnica per valutare le implicazioni di redox di terapeutica mirata alle ferite diabetiche come RTA 408 e la consegna di lipoproteoplex di Keap1 siRNA14,15. Dato i significativi punti di forza di questo protocollo, c'è immenso potenziale futuro nell'applicare simili strategie per lo studio di ROS nei raggruppamenti più profonde attraverso approcci ex vivo , concentrato le dissezioni e organoids.
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Disclosures
Non abbiamo alcuna informativa al rapporto.
Acknowledgments
Siamo grati al nucleo Imaging preclinico presso la NYU School of Medicine, con un ringraziamento speciale Aristizabal Orlando e Youssef Zaim Wadghiri. Il nucleo è una risorsa condivisa parzialmente supportata da Laura e Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087 e NIBIB Biomedical Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Questo lavoro è stato sostenuto dall'associazione americana del diabete "Pathway per fermare il diabete" D.C. [concessione numero 1-16-ACE-08] e al NYU applicato ricerca supporto fondo di P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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