Summary
Nous décrivons une non invasif en vivo imagerie protocole c’est facile et économique, utilisant L-012, un analogue de luminol chimiluminescence, de visualiser et de quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) générés dans un modèle murin excisionnelle enroulé.
Abstract
La génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est une caractéristique des processus inflammatoires, mais en excès, stress oxydatif est largement impliqué dans diverses pathologies comme le cancer, l’athérosclérose et le diabète. Nous avons déjà montré que la dysfonction du facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes)-comme 2 (Nrf2) / érythroïdes Kelch-comme culture cellulaire protéines 1 (Keap1) signalisation voie conduit à extrême déséquilibre ROS lors cutanée la cicatrisation chez les diabétiques. Étant donné que les niveaux ROS sont un indicateur important de la progression de la cicatrisation des plaies, des techniques de quantification précises et exactes sont précieux. Plusieurs essais in vitro pour mesurer des ROS dans les cellules et les tissus ont été décrites ; Toutefois, ils fournissent uniquement une seule mesure cumulative par échantillon. Plus récemment, ont permis le développement d’indicateurs de base de protéines et de modalités d’imagerie unique analyse spatio-temporelle. L-012 (C13H8ClN4NaO2) est un dérivé de luminol qui peut servir à la fois in vivo et in vitro par chimiluminescence détection de ROS générées par l’oxydase de NADPH. L-012 émet un signal plus fort que les autres sondes fluorescentes et s’est avéré être sensible et fiable pour la détection de ROS. L’applicabilité de laps de temps de L-012-facilité d’imagerie fournit des renseignements précieux sur les processus inflammatoires tout en réduisant la nécessité pour le sacrifice et dans l’ensemble le nombre d’animaux de l’étude. Nous décrivons ici un protocole utilisant L-012-facilité in vivo d’imagerie afin de quantifier le stress oxydatif dans un modèle de cicatrisation excisionnelle utilisant des souris diabétiques avec localement dysfonctionnel Nrf2/Keap1.
Introduction
Métabolites d’oxygène générés par le biais de processus inflammatoires contribuent à différentes cascades de signalisation ainsi qu’altération destructive des composants cellulaires1. Utilisant des techniques sensibles et spécifiques pour mesurer le ROS est essentiel pour l’étude des processus inflammatoires et de caractériser les effets du stress oxydatif. L’imagerie in vivo est précieux en raison de sa capacité à fournir des données dynamiques spatiales et temporelles dans les tissus vivants. L-012 est une sonde chimioluminescente synthétique qui est hautement sensible pour les anions superoxydes et produit une intensité lumineuse plus élevée que les autres sondes fluorescentes dans les cellules, de tissus et de sang total1,2,3, 4. il a été avec succès employé pour l’imagerie in vivo dans des modèles murins pour étudier plusieurs maladies inflammatoires, y compris l’arthrite et la colite5,6. Il n’a pas encore devant être utilisés dans une modèle de cicatrisation cutanée établie. Mesure de ROS généré est également pertinent évaluer la progression de la cicatrisation des plaies dans des conditions différentes. La sensibilité et le caractère non invasif de cette méthode en fait une technique prometteuse pour étudier la cicatrisation dans les modèles murins.
Nrf2 est un facteur déterminant de la réponse de l’antioxydant et un facteur de transcription avec une spécificité pour l’élément de réponse antioxydante (ARE) commun pour les régions promotrices de plusieurs d’enzymes antioxydantes8. En l’absence de stress oxydatif, Nrf2 est séquestré dans le cytoplasme par Keap1, ce qui provoque par la suite son ubiquitination et la dégradation. Déséquilibre de la voie Nrf2/Keap1 a été impliquée dans l’homéostasie redox inapproprié et cicatrisation retardée dans le cadre d’une augmentation du stress oxydatif,9. Nous avons déjà montré que la suppression de Keap1 stimule l’augmentation de l’activité Nrf2 et favorise des plaies de sauvetage de la guérison des plaies cutanées pathologiques chez les diabétiques9.
Nous décrivons ici un protocole qui utilise L-012 a contribué bioluminescence d’imagerie pour mesurer les concentrations ROS dans un modèle de guérison excisionnelle plaie cutanée, ce qui est essentiel pour mettre en évidence l’association entre les BR et la cicatrisation des plaies. Cette technique montre des changements en temps réel fardeau oxydant dans les plaies et de la périphérie immédiate. En outre, cette méthode permet pour une évaluation rapide des interventions et des mécanismes de cette manipulation de redox affect. Ici, nous utilisons un modèle de knockdown Keap1 pour la restauration de l’homéostasie redox pour évaluer l’applicabilité de notre stratégie. Parce que notre technique est non invasive et blessures sont intacts, le même animal peut être utilisé pour approfondir les analyses confirmatoires sur la base de lysats histologie ou de la cellule.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de New York University School of Medicine. Toutes les souris sont logés derrière une barrière et tout le personnel de porte un équipement de protection individuelle approprié.
1. jour 0 : La préparation d’un modèle murin de cicatrisation excisionnelle
- Anesthésier les souris diabétiques de (Leprdb/db), âgés de 8 à 12 semaines, à l’inhalation isoflurane de 2 %. Confirmer que chaque souris a été correctement anesthésiés en utilisant le test du pincement pad pied. Appliquer un lubrifiant oculaire stérile à chaque œil pour éviter les irritations de la sécheresse. Chercheurs devraient suivre les directives de leur personnel vétérinaire institutionnels lorsque anesthésier les animaux l’isoflurane.
- Pesez les souris et consignez le poids corporel de chaque souris. Confirmer l’état diabétique des animaux en enregistrant le glucose dans le sang de chaque animal à l’aide d’un glucomètre.
- Une désinfection procédure équipement workspace et anesthésie. Enlever les poils dorsaux des souris à l’aide d’une tondeuse à cheveux, suivi par l’application de la lotion d’enlèvement de cheveux pour essuyer les cheveux trop loin. Utilisez des lingettes d’alcool pour nettoyer la peau exposée, deux fois et laisser pour sécher.
- Créer deux plaies de pleine épaisseur 10 mm, qui s’étend à travers la panniculus carnosus à l’aide de poinçons de biopsie stérile 10 mm selon un technique7,8cicatrisation excisionnelle bien établi. Utiliser des gants stériles pour la chirurgie de survie tous. Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans des sacs avant chirurgie et ouvert que dans le champ opératoire.
- Les plaies ouverte à l’aide d’une feuille de silicone épaisseur 0,5 mm avec découpes circulaires de 10 mm et fixer les stents en place à l’aide de l’attelle interrompu sutures soie 4-0.
- Après une chirurgie, exclure les animaux de l’anesthésie et placer sur le coussin pour faciliter la récupération correcte chauffant. À noter, si la température de corps animal diminue au cours de la procédure, l’animal peut-être être déplacé pour le coussin chauffant plus tôt afin de minimiser la perte de chaleur corporelle sous anesthésie. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils sont éveillés et mobiles.
- Une fois complètement rétabli, revenir animaux en cages individuelles, contenant de nourriture et eau (s’assurer que de la nourriture est sur le plancher de la cage pour l’enrichissement post-opératoire). Fournir des serviettes de papier déchiqueté d’autres matériaux de nidification pendant 2 semaines. Maison pas les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale avec d’autres animaux, afin d’éviter des interactions indésirables et les modifications de statut guérison de blessure.
- Pour soulager la douleur postopératoire, injecter des souris par voie sous-cutanée avec la buprénorphine à 0,1 mg/kg de poids corporel deux fois par jour, commençant immédiatement après la procédure, pendant 3 jours.
2. jour 1 : Préparation du siRNA Keap1
NOTE : Préparer tous les traitements à l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique.
- Préparer la dilution de siARN en combinant 37,5 µL de milieu de sérum réduit avec 12,5 µL de 20 µM Keap1 siARN (siKeap1) (250 pmol) dans un tube de microtubes de 1,5 mL sur la glace.
- Préparer la dilution de liposome en combinant 25 µL de milieu de sérum réduit à 25 µL du mélange de liposome dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
- Ajouter 50 µL de la dilution de siARN dans 50 µL liposome dilution goutte à goutte (volume 1:1) et mélanger doucement.
- Incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
- Ajouter 50 µL de gel de méthylcellulose 2 % dans l’eau et mélanger doucement en pipettant également de haut en bas.
- Traiter chaque animal avec soit un is de non-sensNS (contrôle) ou TRKeap1 (expérimental). Appliquez le gel sur la partie supérieure de la plaie. Enrouler du torse de l’animal avec la vinaigrette de film transparent pour garder le gel en place, maintenir les membres libres de maintenir la mobilité.
3. jour 3 : Préparation de la Solution L-012
NOTE : Préparer tous les réactifs dans une coffret de biosécurité.
- Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, préparer L-012 dans 1 X PBS à une concentration de 0,5 mg/100 mL.
- Manuellement le tube de microcentrifuge vortex. Le L-012 ne pas complètement se dissout dans le PBS, mais il devrait être suspendu uniformément dans le liquide. À noter, ne pas tenter de dissoudre L-012 dans l’eau pour éviter l’inquiétante équilibre physiologique électrolyte après injection.
- Transvaser la solution dans une seringue de 1 mL à l’aide d’une aiguille de 27 G.
Remarque : Veillez à protéger la solution de L-012 de lumière.
4. jour 3 : In Vivo imagerie des plaies diabétiques
- Anesthésier la souris à l’isoflurane par inhalation de 2 %. Chercheurs devraient suivre les directives de leur personnel vétérinaire institutionnels lorsque anesthésier les animaux l’isoflurane. Confirmer que chaque souris a été correctement anesthésiés en utilisant le test du pincement pad pied. Appliquer un lubrifiant oculaire stérile à chaque œil pour éviter les irritations de la sécheresse.
- Retirez délicatement le pansement transparent film des souris sans déranger les blessures.
- Placez les souris dans la chambre d’imagerie dans leurs ordres respectifs. Pour maintenir des niveaux de2 O appropriés dans la chambre, définir l’entrée de système d’imagerie et les niveaux de2 chambre O induction à 1,0 L/min.
- Les souris pour bioluminescence et photographie au départ avant injection de L-012 composé de l’image.
- Essuyez l’abdomen avec des lingettes d’alcool et laisser pour sécher. Effectuer une injection intrapéritonéale de la solution de L-012 à 5 mg par poids de 200 g à l’aide d’une aiguille de calibre 27. Par exemple, une souris pesant 20 g devraient recevoir 0,5 mg de L-012.
- Immédiatement après l’injection de L-012, replacez les souris dans leur emplacement respectif dans la salle d’imagerie. L’image des souris au cours de 60 minutes, pendant 1 minute à intervalles de 4 minutes. Définir la plaie 10 mm dans la région d’intérêt pour déterminer le niveau de ROS.
- Après une chirurgie, exclure les animaux de l’anesthésie et placer sur le coussin pour faciliter la récupération correcte chauffant. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils sont éveillés et mobiles.
- Une fois complètement rétabli, revenir animaux en cages individuelles, maintenance de l’environnement d’enrichissement post-opératoire même décrit précédemment au point 1.6. Maison pas les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale avec d’autres animaux, afin d’éviter des interactions indésirables et les modifications de statut guérison de blessure.
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Representative Results
Trois jours après la création des plaies bilatéraux selon un modèle établi plaie excisionnelle (Figure 1 a), les souris diabétiques sont placés dans la salle d’imagerie. Une photographie initiale et une mesure de bioluminescence sont prises avant l’injection de L-012 pour tenir compte des signaux de fond (Figure 1 b). Suite à une injection intrapéritonéale avec la solution de L-012, les souris sont repositionnés dans la chambre et bioluminescence est visualisé dans les zones de la plaie où le ROS est détectée (Figure 1). Après avoir sélectionné l’imagerie correct et les paramètres d’analyse tel qu’indiqué dans la Figure 2, aller de l’avant avec l’imagerie. Bioluminescence est enregistrée pendant une minute à intervalles de 5 minutes au cours de 60 minutes (Figure 3). Cela démontre la saturation de la bioluminescence de la région d’intérêt au fil du temps. Dans notre modèle animal, période d’imagerie optimale pour atteindre la saturation complète de L-012 a été déterminé à 50 min, après quoi aucune différence notable dans la bioluminescence a été appréciée. Cette fois sera différente selon l’animal modèle utilisé et devrait être indépendamment déterminé et optimisé pour faire varier la plaie modèles selon la taille, type d’animal, traitement, etc.
Une région d’intérêt (ROI) afin de quantifier la bioluminescence limité à la région de la plaie diabétique est attirée sur l’image de superposition (Figure 4). Ces ROIs sont définis de la même manière pour toutes les plaies, y compris avant l’injection de L-012 (Figure 4 a) et après l’injection de L-012 dans le non-sens imprégnées de siARN (Figure 4 b) et Keap1 siARN chez les souris traitées (Figure 4). Bioluminescence a été calculé en divisant les valeurs totales de l’intensité lumineuse de la région. Le tableau 1 montre les calculs sous forme graphiques en Figure 4. Les plaies diabétiques traités siARN non-sens avaient 45 775 11 649 bioluminescence/cm2, tandis que répression Keap1 a 19 405 5 939 bioluminescence/cm2 (SD moyenne). Un test de Student t-ont démontré une bioluminescence une baisse significative (p = 0,042) dans le Keap1 imprégnées de siARN enroulé par rapport à l’absurdité imprégnées de siARN enroulée, corrélant avec fardeau oxydant plus faible avec une plus forte activité Nrf2 (Figure 4D). pour confirmer que les niveaux relatifs de ROS visualisés par L-012 sur siNS et siKeap1 sont en relation étroite avec d’autres moyens établis de mesurer l’inflammation, nous avons analysé les 10 jours de la blessure des sections de tissu. H & E de taches montrent réduit l’infiltration cellulaire à l’ésKeap1-traités plaies contrairement à siNS-celles traitées, ce qui indique réduit la morphologie inflammatoire (Figure 5 a). Immunoréactivité de F4/80, un marqueur de macrophage de protéine, (fluorescence rouge) sur la plaie des sections de tissu a révélé réduit les blessures de macrophages à l’ésKeap1 traités par rapport à siNS-traitement des plaies (Figure 5 b). De plus, cela démontre que les niveaux ROS visualisés par L-012 sont exactes et corréler avec les autres modèles de mesure de ROS établis. Critique, appliqué cette technique a fait nécessite pas sacrifier les animaux pour des coupes de tissus que celle exigée pour H & E et immunofluorescence souillant.
Figure 1 : montage expérimental pour l’imagerie. (A) des souris diabétiques sont blessés en utilisant un modèle de plaie excisionnelle établies. (B), une superposition de base de photographie avec l’injection de pré-L-012 de bioluminescence. (C) suite à une injection intrapéritonéale avec L-012, ROS est visualisé. Échelle de luminescence pour B et C. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Image et l’analyse des paramètres in vitro programme système d’imagerie. (A), sélectionnez « Imaging Assistant » sur le panneau de contrôle de l’Acquisition (flèche rouge). (B) « Imagerie Bioluminescence » est le mode d’imagerie sélectionné. (C) « ouvrir le filtre » est sélectionné comme la technique de mesure. (D) imagerie sujet sélectionné est « la souris » et l’option « time series étude » est sélectionnée. Le nombre total de segments et de temps de retard entre segments est entré. (E) sélectionnez « séquence d’acquérir » de procéder à l’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : études longitudinales de l’imagerie in vivo ROS. Des souris diabétiques sont imagés pour 1 minute après une injection intrapéritonéale avec L-012 à 5 minutes des intervalles au cours de 60 min. Red circles : retour sur investissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : quantification de bioluminescence. Photographies avec superposition de bioluminescence des plaies diabétiques (A) avant l’injection de L-012, (B) avec des plaies traitement avec péchés après injection de L-012 et (C) avec des plaies traitées avec TRKeap1 après injection de L-012. (D) la Quantification de la bioluminescence moyenne divisée par la superficie de la ROIs pour les péchés et siKeap1 traité plaies. Jaune de cercles : retour sur investissement. Données sont représentées sous forme de déviation de mean±standard ; p < 0,05, n = 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : ROS corrélations avec les taches immunohistochemical. Les taches (A) H & E de diabétique plaie des sections de tissu à 10 jours montrent infiltrat cellulaire réduite comme preuve de la morphologie inflammatoire réduite dans le siKeap1 traités plaies par rapport à la siNS -soignés plaies. (B) F4/80 par immunofluorescence (rouge) montre une diminution du nombre de macrophages à l’ésKeap1 traités plaies sections à 10 jours par rapport à leur siNS -soignés homologues. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| RETOUR SUR INVESTISSEMENT | Si | Comptages totaux | Comtes de AVG | Comtes de StDev | Zone [cm²] | Comtes/surface totale | Comtes/superficie moyenne |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| RETOUR SUR INVESTISSEMENT 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| RETOUR SUR INVESTISSEMENT 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| RETOUR SUR INVESTISSEMENT 4 | NS | 1,24 + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| ROI 5 | KEAP1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| RETOUR SUR INVESTISSEMENT 6 | KEAP1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| RETOUR SUR INVESTISSEMENT 7 | KEAP1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | KEAP1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tableau 1 : quantification de bioluminescence pour défini ROIs. Bioluminescence est mesurée pour chaque ROI et standardisé par rapport à la superficie. Calculs de moyenne, écart-type et écart-type sont calculés en conséquence. ROI 1, 2, 3 et 4 représentent ROI des suites de blessures de répétitions biologiques des péchés traitement plaies diabétiques et ROI 5, 6, 7 et 8 représentent ROIs de répétitions biologiques de TRKeap1 traitement plaies diabétiques.
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Discussion
Les techniques courantes de mesure de ROS ont été limités par des protocoles complexes nécessitant une extraction de tissu ou de la même façon des techniques invasives. Ces dernières années, les mesures du stress oxydatif ont été signalés sur la base de modalités d’imagerie innovantes, permettant ainsi à des évaluations spatio-temporelles9,10,11. L-012 présente plusieurs avantages comme une sonde chimioluminescente par rapport au luminol, lucigénine et MCLA1,4. Le composé est non-toxique, facilement absorbé, et a beaucoup plus fort bioluminescence par rapport au luminol ou similaires sondes12. Critique, L-012 peut être administré sans danger plusieurs fois dans le continuum pour analyse longitudinale sans effets indésirables ou de mal aux animaux modèles6. Cette stratégie nécessite une formation spéciale limitée, et l’équipement nécessaire est facilement disponible dans la plupart des laboratoires de recherche, ce qui en fait un protocole largement accessible.
Pour une utilisation optimale, nous suggérons que les réactifs être correctement à jour et protégé de la lumière pour éviter la dégradation. Humanisation des plaies par la pose d’un stent permet murines plaies à guérir grâce à la migration et la ré-épithélialisation, par opposition à par contraction significative. Les sutures doivent être placés les deux tiers de la façon par le périmètre de l’endoprothèse pour garantir des bords de la plaie en place. Emballage des souris avec un film transparent s’habiller après que l’application de gel s’assure que les traitements topiques restent en place. Pour empêcher les blessures auto-infligées chez les souris, qui peuvent entraîner des résultats, goût amer de pulvérisation peut être appliquée aux périphérie et suture noeuds pour décourager les mordre. L-012 a peu solubles dans du PBS, mais constituera une suspension par pipetage répétitives de la solution. Ces mesures de dépannage assurer la cohérence des blessures différentes, éliminant la variabilité inter-utilisateur tout en conservant le confort animal. Puisque cette technique repose sur l’injection intrapéritonéale d’une solution dans un modèle animal, il y a plusieurs facteurs interférents inhérente aux animaux qui ne peut être contrôlés. Par exemple, la circulation sanguine locale et absorption ultérieure et la localisation des L-012 dans les zones d’intérêt ne peuvent être dictées. Toutefois, cette variable peut être atténuée par l’utilisation d’un animal comme son propre contrôle interne telle qu’une blessure peut être traitée avec siNS et l’autre avec l’isKeap1.
Nous rapportons sur l’utilité d’une stratégie pour l’étude in vivo des ROS dans un modèle de cicatrisation cutané. Dans notre étude, traitement des plaies avec siARN Keap1 a entraîné une diminution fardeau oxydant qui confirme notre compréhension de la signification de le Nrf2 / manutentionKeap1 voie d’antioxydant. Bien que cette méthode permette d’analyse quantitative, il y a un certain nombre de limitations importantes. Alors que L-012 est très sensible, il n’est pas spécifique pour ROS et s’est avéré aussi réagir à l’azote réactif espèces6. Une analyse plus approfondie avec les sondes ciblées et méthodes de dosage immunologique compléter cette approche par le biais de spécificité accrue et la localisation sous-cellulaire des ROS corrélats13. Le mécanisme proposé pour la base de L-012 bioluminescence implique l’oxydation des L-012 par l’oxygène moléculaire à travers l’activité de la peroxydase en combinaison avec H2O212. Cela limite l’utilisation de cette technique pour l’étude des inhibiteurs de l’enzyme antioxydante qui interagissent avec la peroxydase. Une analyse plus détaillée destiné à spécifiquement quantifier ROS autres que l’anion superoxyde ou métabolites d’espèces réactives d’azote n’est pas possible avec la stratégie actuelle.
Compte tenu de la forte sensibilité de L-012 pour la détection des ROS largement, il est facilement adaptable pour la guérison des plaies cutanées diverses et autres modèles de tissus. Nous avons démontré l’utilité de cette technique pour évaluer les implications d’oxydo-réduction de thérapies ciblées pour les plaies diabétiques comme RTA 408 et la livraison de lipoproteoplex de Keap1 siARN14,15. Étant donné les forces importantes du présent protocole, il est immense potentiel futur dans l’application de stratégies similaires pour l’étude des ROS dans des compartiments plus profonds à travers des approches ex vivo , dissection ciblée et organoïdes.
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Disclosures
Nous n’avons aucune divulgation au rapport.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants au noyau d’imagerie préclinique à l’école de médecine de l’Université de New York, avec remerciements à Orlando Aristizabal et Youssef Zaim Wadghiri. Le noyau est une ressource partagée, partiellement pris en charge par la 5P30CA016087 Laura et Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI et ingénierie biomédicale Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Ce travail a été soutenu par l’American Diabetes Association « Voie à arrêter le diabète » à D.C. [numéro de licence 1-16-ACE-08] et le NYU appliqué recherche Fonds d’appui à P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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