Summary
我们描述了一种非侵入性的体内成像协议, 该协议具有简化且具有成本效益的特性, 它利用 l-012 (一种化学发光发光-模拟) 来可视化和量化小鼠切除伤口模型中产生的活性氧物种 (ros)。
Abstract
活性氧 (ros) 的产生是炎症过程的标志, 但过度, 氧化应激广泛涉及各种疾病, 如癌症, 动脉粥样硬化和糖尿病。我们以前已经证明, 核因子 (红血球衍生 2) 类似 2 (Nrf2)/开克样红血球细胞衍生蛋白 1 (keap1) 信号通路导致在糖尿病皮肤伤口愈合过程中的极端 ros 不平衡。由于 ros 水平是伤口愈合进展的重要指标, 具体和准确的定量技术是有价值的。介绍了几种用于测量细胞和组织中 ros 的体外检测方法;但是, 它们只为每个样本提供一个累积测量。最近, 基于蛋白质的指标和成像方式的发展使得能够进行独特的时空分析。l-012 (c13h8 cln4nao2) 是一种发光醇衍生物, 可用于在体内和体外化学发光检测 napdh 氧化酶产生的 ros.l-012 发出的信号比其他荧光探针更强, 并且已被证明对检测 ros 既敏感又可靠。l-012 辅助成像的延时适用性提供了有关炎症过程的宝贵信息, 同时减少了牺牲的需要, 并全面减少了研究动物的数量。在这里, 我们描述了一个协议, 利用 l-012 促进的体内成像量化氧化应激模型的切除伤口愈合使用糖尿病小鼠与局部功能失调 nrf2/keap1。
Introduction
通过炎症过程产生的氧代谢物有助于各种信号级联以及细胞成分的破坏性改变1。利用敏感和特定的技术来测量 ros 是研究炎症过程和描述氧化应激的影响的关键。体内成像是有价值的, 因为它能够提供动态的空间和时间数据在活组织。l-012 是一种合成化学发光探针, 对超氧化物阴离子高度敏感, 在细胞、组织和全血1、2、3、4. 已成功地用于小鼠模型的体内成像, 以研究几种炎症性疾病, 包括关节炎和结肠炎5,6。它尚未被应用于已建立的皮肤伤口愈合模型。测量产生的 ros 对于评估不同条件下伤口愈合的进展同样重要。这种方法的敏感性和非侵入性使其成为研究小鼠模型伤口愈合的一种有前途的技术。
nrf2 是抗氧化反应的主要驱动因素, 也是一种特殊的抗氧化反应元素 (are) 的转录因子, 这些元素是几种抗氧化酶8的启动子区域所共有的。在没有氧化应激的情况下, nrf2 被 keap1 隔离在细胞质中, 从而导致其普遍化和降解。nrf和解1途径的不平衡与不适当的氧化还原稳态和延迟伤口愈合有关, 在氧化应激增加的背景下 9.我们以前已经证明, 抑制 keap1 刺激增加 nrf2 活性, 并促进挽救治疗病理皮肤伤口愈合在糖尿病伤口9。
在这里, 我们描述了一个协议, 利用 l-012 辅助生物发光成像测量 ros 水平在一个切除皮肤伤口愈合模型, 这是至关重要的突出 ros 和伤口愈合之间的联系。这项技术显示了伤口和周围氧化负荷的实时变化。此外, 这种方法可以对影响氧化还原处理的干预措施和机制进行快速评估。在这里, 我们使用keap1 敲除模型来恢复氧化还原稳态, 以评估我们的策略的适用性。因为我们的技术是无创的, 伤口不受干扰, 同一动物可以用于进一步的确认分析的基础上, 组织学或细胞裂解物。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了纽约大学医学院动物护理和使用机构委员会的批准。所有老鼠都被安置在屏障后面, 所有人员都佩戴适当的个人防护设备。
1. 第0天: 小鼠模型的制备
- 对糖尿病小鼠 (leprdb/db) 进行麻醉, 年龄为 8-12周, 吸入2% 异氟醚。确认每只鼠标已使用脚垫夹紧测试进行了适当麻醉。在每只眼睛上涂上无菌的眼部润滑剂, 以防止对干燥的刺激。研究人员在使用异氟烷麻醉动物时, 应遵循其机构兽医人员的指导原则。
- 称重小鼠并记录每只老鼠的体重。通过使用血糖仪记录每只动物的血糖, 确认动物的糖尿病状况。
- 消毒程序工作空间和麻醉设备。使用修剪头发的方法去除老鼠的背发, 然后使用脱毛化妆水来擦拭多余的头发。使用酒精湿巾清洁暴露的皮肤, 两次, 并允许干燥。
- 根据成熟的切除伤口愈合技术 7, 8, 使用无菌10毫米活检的拳打脚踢,创建两个10毫米全厚度伤口延伸通过盘尾肌。在所有生存手术中使用无菌手套。手术前, 高压灭菌器的所有手术器械都放在袋子里, 只在手术领域打开。
- 使用0.5 毫米厚的硅胶片, 带有10毫米圆形切口, 将伤口撕开, 并使用中断的4-0 丝线将支架固定在适当的位置。
- 手术后, 将动物从麻醉中取出, 放在加热垫上, 以促进适当的恢复。值得注意的是, 如果动物体温在手术过程中降低, 动物可能会更早地移动到加热垫, 以最大限度地减少麻醉下的身体热量损失。监控动物, 直到它们醒着和移动。
- 一旦完全恢复, 将动物送回个别笼子, 里面有食物和水 (确保一些食物在笼子的地板上, 以便术后浓缩)。提供切碎的纸巾作为2周的额外嵌套材料。不要将与其他动物一起接受过手术的动物安置在一起, 以防止不良的相互作用和伤口愈合状态的变化。
- 为了术后止痛, 每天两次以 0.1 mg kg 体重的重量注射小鼠, 为期3天。
2. 第1天: keap1 sirna 的制备
注: 在生物安全柜内准备所有处理方法。
- 将37.5μl 的减少血清培养基与 20μm keap1 sirna (si keap 1 ) (250pmol) 结合在冰上的 1.5 ml 微离心管中制备 sirna 稀释。
- 将25μl 的还原血清培养基与25μl 脂质体混合在 1.5 ml 微离心管中制备脂质体稀释。
- 加入 50μl sirna 稀释液滴至50μl 脂质体稀释液滴 (1:1 体积), 然后轻轻混合。
- 在室温下孵化20分钟。
- 在水中加入50μl 的2% 甲基纤维素凝胶, 通过上下移液轻轻混合。
- 用无稽之谈的 si ns (控制)或 sikeap1 (实验) 来对待每一种动物。将凝胶涂在伤口的顶部。用透明的薄膜敷料包裹动物的躯干, 以保持凝胶到位, 保持四肢自由, 保持活动能力。
3. 第3天: l-012 解决方案的准备
注: 在生物安全柜中准备所有试剂。
- 在 1.5 ml 微离心管中, 在浓度为 0.5 mg 100 ml 的 1x pbs 中制备 l-012。
- 手动旋涡微离心管。l-012 不会完全溶解到 pbs 中, 但它应该均匀地悬浮在液体中。注意, 不要试图在水中溶解 l-012, 以避免干扰注射后的生理电解质平衡。
- 使用27g 针将溶液转移到1毫升注射器中。
注: 请务必保护 l-012 溶液不受光线影响。
4. 第3天: 糖尿病伤口的活体成像
- 用吸入2% 异氟醚对小鼠进行麻醉。研究人员在使用异氟烷麻醉动物时, 应遵循其机构兽医人员的指导原则。确认每只鼠标已使用脚垫夹紧测试进行了适当麻醉。在每只眼睛上涂上无菌的眼部润滑剂, 以防止对干燥的刺激。
- 在不干扰伤口的情况下, 轻轻从老鼠身上取出透明的薄膜敷料。
- 将小鼠按各自的顺序放置在成像室中。为了在腔内保持适当的 o2 水平, 请将成像系统流入和感应腔 o2水平设置为 1.0 lp min。
- 成像小鼠的生物发光, 并在注射 l-012 化合物之前在基线拍摄。
- 用酒精擦拭腹部, 并允许干燥。使用27规格的针头, 以每200克体重5毫克的速度进行 l-012 溶液的腹腔注射。例如, 体重20克的小鼠应获得0.5 毫克的 l-012。
- 在 l-012 注射后, 立即将小鼠放回成像室各自的位置。在60分钟的时间里对老鼠进行成像, 每隔 4分钟, 每1分钟成像1分钟。定义10毫米伤口作为感兴趣的区域, 以确定 ros 的水平。
- 手术后, 将动物从麻醉中取出, 放在加热垫上, 以促进适当的恢复。监控动物, 直到它们醒着和移动。
- 一旦完全恢复, 将动物送回单独的笼子, 保持先前在1.6 中描述的相同的术后浓缩环境。不要将与其他动物一起接受过手术的动物安置在一起, 以防止不良的相互作用和伤口愈合状态的变化。
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Representative Results
根据已建立的切除伤口模型 (图 1a) 创建双侧伤口三天后, 糖尿病小鼠被放置在成像室。在注射 l-012 以考虑背景信号之前, 拍摄了初始照片和生物发光量 (图 1 b)。在使用 l-012 溶液进行腹腔注射后, 小鼠被重新定位在腔内, 并在检测到 ros 的伤口区域显示生物发光 (图 1c).选择正确的成像和分析设置后, 如图 2所示, 继续进行成像。在60分钟的时间里, 每隔5分钟记录1分钟的生物发光 (图 3)。这表明了随着时间的推移感兴趣的区域的生物发光饱和度。在我们的动物模型中, 达到完全 l-012 饱和度的最佳成像时间被确定为 50分钟, 之后在生物发光方面没有明显的差异。这段时间将根据所使用的动物模型而有所不同, 应根据大小、动物类型、处理等情况, 针对不同的伤口模型独立确定和优化.
在覆盖图像上绘制一个感兴趣的区域 (roi), 用于量化仅限于糖尿病伤口区域的生物发光 (roi) (图 4)。这些 roi 同样定义为所有伤口, 包括 l-012 注射前 (图 4 a), 以及 l-012 注射后的无稽之谈 sirna 治疗 (图 4A) 和keap1 sirna 治疗小鼠 (图 4A)。生物发光是通过将光强的总数除以面积来计算的。表 1显示了图 4d中所示的计算。无意义的 sirna 治疗的糖尿病伤口有 45 775 11, 1, 1, 649 生物发光-厘米 2, 而keap1 抑制导致 19 19 405 5, 939 生物发光素/厘米 2 (平均 sd)。一名学生的 t 测试显示, 与无稽之谈 sirna 处理的伤口相比, keap1 sirna 处理的伤口的生物发光 (p=0.042 0.042) 显著减少, 与较低的氧化负担和较高的 nrf2 活性有关 (图)为了证实 l-012 在 sins和 sikeap1上观察到的 ros 的相对水平与其他已建立的炎症测量方法相关, 我们分析了10天的伤口组织切片。h & amp; e 染色显示, 与 ns 治疗的伤口相比, sikeap1治疗的伤口的细胞浸润减少, 表明炎症形态减少 (图 5a)。f微小 y 的免疫活性, 一种蛋白质巨噬细胞标记, (红色荧光) 在伤口组织切片显示巨噬细胞减少在si keap1 治疗的伤口相比, si ns 治疗的伤口 (图 5b)。这进一步证明了 l-012 可视化的 ros 水平是准确的, 并与其他已建立的 ros 测量模型相关。关键的是, 应用这项技术并不需要牺牲动物的组织切片, 因为 h & amp; e 和免疫荧光染色的要求。
图 1: 用于成像的实验设置.(a) 糖尿病小鼠使用已建立的切除伤口模型受伤。(b) 生物发光前 l-012 注射的照片基线覆盖。(c) l-012 腹腔内注射后, 将 ros 可视化。b 和 c 的发光刻度请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2:体外成像系统程序中的图像和分析设置。(a) 在采集控制面板 (红色箭头) 上选择 "成像向导"。(b) "生物发光成像" 是所选择的成像模式。(c) 选择 "开放式过滤器" 作为测量技术。(d) 选择的成像主题是 "鼠标", 并选择 "时间序列研究" 选项。输入段的总数和段之间的延迟时间。(e) 选择 "获取序列" 以进行成像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:体内ros 成像的纵向研究.糖尿病小鼠在60分钟的时间里, 用 l-012 腹腔注射 l-012, 在60分钟的时间里, 每隔5分钟对糖尿病小鼠进行1分钟的成像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 定量生物发光.l-012 注射前糖尿病创面 (a) 的生物发光覆盖照片, l-012 注射后用sins 治疗伤口的照片, l-012 注射后用 sikeap1 治疗伤口的照片 (c)。(d) 将 sins 和 si keap 1 治疗伤口的平均生物发光除以 roi 表面积的定量.黄色圆圈: 投资回报率。数据表示为均值±标准偏差;*p & lt; 0.05, ncs4。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: ros 与免疫组织化学染色的相关性.(a) 糖尿病创面组织切片10天的 h & amp; e 染色显示, 与 sins-1治疗的伤口相比, ssi keap1 治疗的伤口的炎症形态减少的证据表明细胞浸润减少。(b) f480 免疫荧光 (红色) 显示, 与 sins-ac处理的创面相比, 西 keap1 治疗的创面切片中的巨噬细胞数量在10天内有所减少。请点击这里查看此图的较大版本.
| Roi | 四 | 总计计数 | 平均计数 | stdev 计数 | 面积 [cm²] | 国家/地区共计 | 平均面积 |
| 投资回报率1 | Ns | 9.38E+03 | 1.14E+02 | 3.85E+01 | 2.48 e-01 | 3.78E+04 | 4.58E+04 |
| 投资回报率2 | Ns | 4.68E+03 | 5.37E+01 | 3.13E+01 | 2.63e-01 | 1.78E+04 | |
| 投资回报率3 | Ns | 1.72E+04 | 2.18E+02 | 1.54E+02 | 2.39 e-01 | 7.20E+04 | |
| 投资回报率4 | Ns | 1.24E+04 | 1.68E+02 | 8.41E+01 | 2.24 e-01 | 5.55E+04 | |
| 投资回报率5 | keap1 | 3.21E+03 | 3.41E+01 | 2.76E+01 | 2.84e-01 | 1.13E+04 | 1.94E+04 |
| 投资回报率6 | keap1 | 2.56E+03 | 2.88E+01 | 1.06E+01 | 2.69e-01 | 9.52E+03 | |
| 投资回报率7 | keap1 | 4.92E+03 | 6.48E+01 | 5.03E+01 | 2.30 e-01 | 2.14E+04 | |
| 投资回报率8 | keap1 | 8.34E+03 | 1.07E+02 | 5.25E+01 | 2.36 e-01 | 3.54E+04 |
表 1: 对已定义的 roi 进行定量生物发光.生物发光是为每个投资回报率测量的, 并相对于表面积进行标准化。对平均值、标准偏差和标准误差的计算进行了相应的计算。roi 1、2、3和4代表 sins 治疗的糖尿病创伤的生物重复伤的 roi, roi 5、6、7和8代表 sikeap1治疗的糖尿病创伤的生物重复的 roi。
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Discussion
测量 ros 的常用技术受到需要组织提取或类似侵入性技术的复杂协议的限制。近年来, 氧化应激的测量是在创新成像方式的基础上报告的, 从而允许对 9、10、11进行时空评估。l-012 作为相对于发光醇、露西根宁和 mcla1,4 的化学发光探针, 具有多种优点。该化合物无毒, 易于吸收, 与发光醇或类似探针12相比, 具有更强的生物发光.关键的是, l-012 可以安全地连续多次进行纵向分析, 而不会对动物模型6产生任何不利影响或伤害。这一战略需要有限的特别培训, 大多数研究实验室随时可以获得必要的设备, 使其成为一个广泛获得的协议。
为了获得最佳用途, 我们建议正确更新试剂, 防止光线照射, 以避免降解。通过支架置入使伤口人性化, 可以让小鼠伤口通过迁移和再上皮化而愈合, 而不是通过明显的收缩。缝合线应该放置在三分之二的方式通过支架周边, 以确保伤口边缘到位。用透明的薄膜敷料包裹小鼠后, 凝胶应用, 确保局部治疗保持在原来的位置。为了防止小鼠自残, 这可能会混淆结果, 苦味喷雾可应用于周围和缝合结, 以防止叮咬。l-012 在 pbs 中的溶解度有限, 但将通过重复移液形成悬浮液。这些故障排除措施可确保不同伤口的一致性, 消除用户间的可变性, 同时保持动物的舒适性。由于这种技术依赖于将溶液的腹腔注射到动物模型中, 因此有几个动物固有的干扰因素是无法控制的。例如, 不能决定局部血流以及随后将 l-012 吸收和定位到感兴趣的区域。但是, 可以通过使用动物作为其自身的内部控制来缓解此变量, 以便使用 sins 处理一个伤口, 使用 sikeap1处理另一个伤口。
我们报告了一种策略的效用, 在皮肤伤口愈合模型中的 ros 体内研究。在我们目前的研究中, 用keap1 sirna 治疗伤口可以减少氧化负担, 这证实了我们对 nrf2/keap1 途径对抗氧化处理的意义的理解。虽然这种方法允许进行定量分析, 但也有一些重要的局限性。虽然 l-012 是高度敏感的, 它不是特定的 ros, 并已被证明也对活性氮物种6反应。进一步分析与目标探针和免疫检测为基础的方法补充了这种方法, 通过增强特异性和细胞下定位的ros 相关13。提出的 l-012 基生物发光机理是通过过氧化物酶与 h2o212 的活性, 通过分子氧氧化l-012.这限制了这一技术在研究与过氧化物酶相互作用的抗氧化酶抑制剂方面的应用。更详细的分析旨在具体量化除超氧化物阴离子或活性氮种代谢物以外的 ros, 目前的策略是不可能的。
鉴于 l-012 对广泛检测 ros 的敏感性高, 它很容易适应各种皮肤伤口愈合和其他组织模型。我们已经证明了这种技术的权宜之计, 以评估氧化还原的意义, 有针对性的疗法对糖尿病伤口, 如 rta 408 和脂肽肽交付的keap1 sirna 14,15。鉴于该协议的显著优势, 在应用类似的策略, 通过体外方法、有重点的解剖和有机体在更深的隔间内研究 ros 方面, 具有巨大的未来潜力。
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Disclosures
我们没有要报告的披露。
Acknowledgments
我们感谢纽约大学医学院的临床前成像核心, 并特别感谢奥兰多阿里斯蒂萨瓦尔和优素福扎姆·瓦德吉里。核心是由 laura 和 isaac perlmutter 癌症中心支持赠款 nihci nhci 5p30ca016087 和 nibib 生物医学技术资源中心 grant nih p41 eb017183 部分支持的共享资源。这项工作得到了美国糖尿病协会 "阻止糖尿病之路" (原案 1-16-ace-08) 和纽约大学应用研究支助基金对 p. r. 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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