Summary
Wir beschreiben eine nicht-invasive in Vivo imaging-Protokoll, das schlanke und kostengünstige, Verwendung von L-012, eine Chemolumineszenz Luminol-Analog, zu visualisieren und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzielte eine excisional Wunde Mausmodell zu quantifizieren.
Abstract
Die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist ein Markenzeichen von entzündlichen Prozessen, aber im Übermaß, oxidativer Stress ist weit verbreitet in verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose und Diabetes beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt, dass Dysfunktion des nuklearen Faktors (2 erythroiden abgeleitet)-wie 2 (Nrf2) / Kelch-ähnliche erythroiden Zelle abgeleitete Protein 1 (Keap-1) Signalisierung Weg führt zu extremen ROS Ungleichgewicht bei kutanen Wundheilung bei Diabetes. Da ROS Ebenen ein wichtiger Indikator für den Verlauf sind der Wundheilung, sind spezifische und genaue Quantifizierung Techniken wertvoll. Mehrere in-vitro- Tests, ROS in Zellen und Geweben zu messen sind beschrieben worden; Sie liefern jedoch nur eine kumulative Einzelmessung pro Probe. Vor kurzem haben die Entwicklung von Protein-basierten Indikatoren und bildgebender Verfahren für einzigartige räumlich-zeitliche Analysen erlaubt. L-012 (C13H8ClN4NaO2) ist ein Luminol-Derivat, das für in Vivo und in Vitro Chemolumineszenz verwendet werden kann Erkennung von ROS von NAPDH Oxidase generiert. L-012 strahlt ein stärkeres Signal als andere fluoreszierenden Sonden und hat gezeigt, dass sowohl empfindlich und zuverlässig für die Erkennung von ROS. Die Zeit verfallen Anwendbarkeit des L-012-erleichtert Imaging liefert wertvolle Informationen über entzündliche Prozesse reduzieren die Notwendigkeit für Opfer und insgesamt senken die Zahl der Studie Tiere. Hier beschreiben wir ein Protokoll, die Verwendung von L-012-erleichtert, in Vivo imaging um zu oxidativen Stress in einem Modell der excisional Wundheilung mit diabetischen Mäusen mit lokal dysfunktionalen Nrf2/Keap1 zu quantifizieren.
Introduction
Sauerstoff-Metabolite erzeugt durch entzündliche Prozesse tragen zu verschiedenen Signalisierung Kaskaden sowie destruktiven Änderung der zellulären Komponenten1. Sensitiver und spezifischer Techniken zur Messung der ROS ist entscheidend für entzündliche Prozesse zu studieren und zu charakterisieren die Effekte von oxidativem Stress. In-Vivo Bildgebung ist wertvoll wegen seiner Fähigkeit, dynamische räumliche und zeitliche Angaben im lebenden Gewebe. L-012 ist eine synthetische Chemilumineszenz-Sonde, die ist sehr empfindlich für Superoxid-Anionen und erzeugt eine höhere Lichtintensität als andere fluoreszierenden Sonden in Zellen, Geweben und Vollblut1,2,3, 4. es hat mehrere entzündliche Erkrankungen, wie Arthritis und Kolitis5,6studieren erfolgreich für die in-Vivo Bildgebung in murinen Modellen eingesetzt. Es ist noch nicht in einer etablierten kutanen Wundheilung Modell eingesetzt werden. Messung von ROS erzeugt ist ebenso relevant für den Verlauf der Wundheilung unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Die Empfindlichkeit und die nicht-invasive Natur dieser Methode macht es eine vielversprechende Technik für Wundheilung in murinen Modellen zu studieren.
Nrf2 ist eine wichtige Triebfeder der antioxidativen Reaktion und ein transcriptional Faktor mit Spezifität für die Antioxidant Response-Element (sind) für den Projektträger Regionen mehrere antioxidative Enzyme8. In Ermangelung von oxidativem Stress ist Nrf2 im Zytoplasma von Keap1, abgesondert, wodurch anschließend seine Ubiquitination und Abbau. Ungleichgewicht des Nrf2/Keap1-Signalwegs hat in ungeeigneten Redox-Homöostase und verzögerte Wundheilung in der Umgebung von erhöhtem oxidativen Stress9verwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Unterdrückung der Keap1 erhöhten Nrf2-Aktivität anregt und fördert Rettung der pathologischen kutanen Wundheilung in diabetischen Wunden9.
Hier beschreiben wir eine Protokoll, die nutzt L-012-gestützte Biolumineszenz imaging um zu ROS Ebenen in einem excisional kutanen Wunde heilende Modell zu messen, die kritisch für die Hervorhebung der Assoziation zwischen ROS und Wundheilung ist. Diese Technik zeigt Änderungen in Echtzeit oxidativen Belastung innerhalb von Wunden und unmittelbaren Peripherie. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode zur schnellen Beurteilung der Interventionen und Mechanismen dieser Affekt Redox Handhabung. Hier verwenden wir ein Modell des Keap1 Zuschlag für die Wiederherstellung des Redox-Homöostase, um die Anwendbarkeit unserer Strategie zu bewerten. Da unsere Technik nicht-invasiv ist und Wunden ungestört sind, kann das gleiche Tier für weitere bestätigende Analysen auf der Grundlage der Histologie oder Zelle Lysates verwendet werden.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der New York University School of Medicine genehmigt. Alle Mäuse sind hinter einer Schranke untergebracht und alle Mitarbeiter tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung.
1. Tag 0: Vorbereitung der Mausmodell der Excisional Wundheilung
- Diabetiker (LeprDb/Db) Mäuse, im Alter von 8 – 12 Wochen, mit inhalativer 2 % Isofluran zu betäuben. Bestätigen Sie, dass jede Maus hat richtig betäubt worden mit dem Fuß Pad Pinch-Test. Gelten Sie okuläre steriles Gleitmittel für jedes Auge, Reizung von Trockenheit zu verhindern. Forscher sollten ihre institutionellen Tierärzten Richtlinien befolgen, wenn Tiere mit Isofluran zu betäuben.
- Wiegen Sie die Mäuse und zeichnen Sie das Körpergewicht des jede Maus auf. Bestätigen Sie den diabetischen Status der Tiere durch die Aufnahme des Blutzuckers jedes Tieres mit einem Blutzuckermessgerät.
- Prozedurale Arbeitsbereich und Anästhesie Ausrüstung zu desinfizieren. Entfernen Sie dorsalen Haare der Mäuse mit einem Haarschneidegerät gefolgt von der Anwendung von Haarwasser entfernen, entfernt überschüssige Haare zu wischen. Verwenden Sie Alkoholtupfer, um die Haut zweimal reinigen und trocknen lassen.
- Erstellen Sie zwei 10 mm voll-dicke Wunden, die sich durch die Verwendung von sterilen 10 mm Biopsie Schläge nach einem etablierten excisional Wundheilung Technik7,8Panniculus Carnosus. Verwenden Sie sterile Handschuhe für alle überleben Chirurgie. Autoklav alle chirurgischen Instrumente in Säcken vor der Operation und nur in das OP-Feld öffnen.
- Schiene die Wunden öffnen Sie mit einem 0,5 mm dicken Silikon-Blatt mit 10 mm kreisförmigen Ausschnitte und sichern die Stents im Ort mit unterbrochen seidene Fäden 4-0.
- Nach der Operation, Tiere aus der Narkose zu entfernen und auf Heizkissen um ordnungsgemäße Verwertung zu erleichtern. Der Hinweis tierische Körpertemperatur sinkt während des Verfahrens kann das Tier in das Heizkissen früher verschoben werden Körper Wärmeverlust unter Narkose zu minimieren. Überwachen Sie die Tiere, bis sie wach und mobil sind.
- Einmal vollständig erholt, wieder Tiere zu einzelnen Käfigen, mit Nahrung und Wasser (stellen Sie sicher, dass etwas zu Essen auf dem Boden des Käfigs für postoperative Bereicherung ist). Handtücher Papierschnitzel als zusätzliche Nistmaterial für 2 Wochen. Tiere, die mit anderen Tieren, um unerwünschte Interaktionen und Änderungen an heilenden Status Wunde zu verhindern operiert wurden nicht Haus.
- Injizieren Sie für postoperative Schmerzlinderung Mäusen subkutan mit Buprenorphin bei 0,1 mg/kg Körpergewicht zweimal täglich ab sofort nach dem Verfahren, für 3 Tage.
2. Tag 1: Vorbereitung der Keap1 siRNA
Hinweis: Bereiten Sie alle Behandlungen innerhalb eines Biosafety Kabinett.
- Bereiten Sie SiRNA Verdünnung durch die Kombination von 37,5 µL reduzierte Serum-Medium mit 12,5 µL von 20 µM Keap1 SiRNA (SiKeap1) (250 Pmol) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
- Bereiten Sie Liposomen-Verdünnung durch die Kombination von 25 µL reduzierte Serum Medium mit 25 µL Liposomen-Mix in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch vor.
- 50 µL Liposomen Verdünnung tropfenweise (1:1-Volume) 50 µL der SiRNA Verdünnung hinzu, und mischen Sie vorsichtig.
- 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 50 µL 2 % Methylcellulose Gel in Wasser hinzufügen und Mischen von Pipettieren rauf und runter.
- Jedes Tier mit entweder ein Unsinn SiNS (Kontrolle) zu behandeln oder SiKeap1 (experimentell). Tragen Sie das Gel an die Spitze der Wunde. Wickeln Sie das Tier Torso mit Klarsichtfolie Dressing, Gel, beizubehalten halten die Gliedmaßen frei, um die Beweglichkeit zu erhalten.
3. Tag 3: Vorbereitung der L-012 Lösung
Hinweis: Bereiten Sie alle Reagenzien in eine biologische Kabinett.
- Bereiten Sie in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch L-012 mit 1 X PBS-Puffer in einer Konzentration von 0,5 mg/100 mL.
- Manuell den Microcentrifuge Schlauch Wirbel. Die L-012 löst vollständig in die PBS, sich nicht aber es gleichmäßig in der Flüssigkeit ausgesetzt werden sollte. Beachten ist versuchen Sie nicht, L-012 in Wasser zur Vermeidung von störenden physiologische Elektrolythaushalt nach der Injektion zu lösen.
- Übertragen Sie die Lösung in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 27 G.
Hinweis: Achten Sie darauf, die L-012 Lösung vor Licht zu schützen.
4. Tag 3: In-Vivo Bildgebung diabetische Wunden
- Mäuse mit inhalativer 2 % Isofluran zu betäuben. Forscher sollten ihre institutionellen Tierärzten Richtlinien befolgen, wenn Tiere mit Isofluran zu betäuben. Bestätigen Sie, dass jede Maus hat richtig betäubt worden mit dem Fuß Pad Pinch-Test. Gelten Sie okuläre steriles Gleitmittel für jedes Auge, Reizung von Trockenheit zu verhindern.
- Entfernen Sie vorsichtig die Klarsichtfolie Dressing von den Mäusen ohne zu stören die Wunden.
- Legen Sie die Mäuse in der bildgebenden Kammer in ihrer jeweiligen Bestellungen. Um richtige O2 Ebenen in der Kammer zu halten, imaging System-Zufluss und Induktion Kammer O2 Ebenen bis 1,0 L/min eingestellt.
- Bild die Mäuse für die Biolumineszenz und Foto bei Studienbeginn vor der Injektion der L-012 Verbindung.
- Den Bauch mit Alkoholtupfer abwischen und trocknen lassen. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion der L-012 Lösung auf 5 mg pro 200 g Körpergewicht mit einer 27-Gauge-Nadel. Beispielsweise sollte eine Maus mit einem Gewicht von 20 g 0,5 mg des L-012 erhalten.
- Unmittelbar nach der Injektion L-012 legen die Mäuse wieder an den jeweiligen Standorten in der bildgebenden Kammer. Bild der Mäuse im Laufe von 60 Minuten, 1 Minute im 4-Minuten-Takt. Definieren Sie die 10-mm-Wunde als die Region von Interesse für die Bemessung von ROS.
- Nach der Operation, Tiere aus der Narkose zu entfernen und auf Heizkissen um ordnungsgemäße Verwertung zu erleichtern. Überwachen Sie die Tiere, bis sie wach und mobil sind.
- Einmal vollständig erholt, wieder Tiere in einzelne Käfige, die gleichen postoperativen Bereicherung Umwelt zuvor in 1.6 beschrieben. Tiere, die mit anderen Tieren, um unerwünschte Interaktionen und Änderungen an heilenden Status Wunde zu verhindern operiert wurden nicht Haus.
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Representative Results
In der bildgebenden Kammer befinden sich drei Tage nach dem Erstellen der bilateralen Wunden nach einem etablierten excisional Wunde Modell (Abbildung 1A), diabetische Mäusen. Eine erste Foto und ein Maß für die Biolumineszenz sind vor der Injektion des L-012 ergriffen, um Hintergrundsignal (Abbildung 1 b) zu berücksichtigen. Nach intraperitonealer Injektion mit der L-012-Lösung, die Mäuse werden neu positioniert, in der Kammer und Biolumineszenz wird visualisiert, in Bereichen der Wunde wo ROS erkannt wird (Abbildung 1). Nach der Auswahl der richtigen Bildgebung und Analyseeinstellungen wie in Abbildung 2dargestellt, fahren Sie fort mit Bildgebung. Die Biolumineszenz wird 1 Minute lang im 5-Minuten-Takt im Laufe von 60 Minuten (Abbildung 3) aufgezeichnet. Dies zeigt die Biolumineszenz Sättigung des Interessenbereichs im Laufe der Zeit. In unserer Tiermodell war optimale Bildgebung Zeit vollständige L-012 Sättigung erreichen entschlossen, 50 min, nach denen keinen bemerkenswerten Unterschied in der Biolumineszenz geschätzt wurde. Diese Zeit variiert je nach Tier Modell genutzt und sollten unabhängig ermittelt und optimiert für unterschiedliche Wunde Modelle je nach Größe, Tierart, Behandlung, etc.
Eine Region of Interest (ROI) für die Zwecke der Quantifizierung der Biolumineszenz, die auf die diabetische Wundgebiet beschränkt wird auf das Overlay-Bild (Abbildung 4) gezeichnet. Diese ROIs gelten ebenso für alle Wunden einschließlich vor L-012 Injektion (Abb. 4A) und nach L-012 Injektion in Unsinn SiRNA behandelt (Abbildung 4 b) und Keap1 SiRNA-behandelten Mäusen (Abbildung 4). Biolumineszenz wurde die Gesamtanzahl der Lichtintensität durch die Fläche dividiert. Tabelle 1 zeigt die Berechnungen, die in Abbildung 4dargestellt. Die Unsinn SiRNA behandelten diabetischen Wunden hatte 45.775 11.649 Biolumineszenz/cm2, während Keap1 Unterdrückung 19.405 5.939 Biolumineszenz/cm2 (mittlere SD) geführt. Ein Student t-Test zeigte eine deutlich verminderte Biolumineszenz (p = 0,042) in die Keap1 SiRNA behandelten Wunde im Vergleich zu den Unsinn SiRNA behandelten Wunde, korrelieren mit geringeren oxidativen Belastung mit höherer Nrf2-Aktivität (Abbildung 4D). zu bestätigen, dass die relativen Pegel der ROS visualisiert durch L-012 aufNS Si und SiKeap1 korrelieren mit anderen etablierten Messen Entzündung, wir 10 Tage analysierten Wunde Gewebeschnitten. H & E Flecken zeigten reduziert zelluläre Infiltration in der SiKeap1-behandelt Wunden im Gegensatz zu SiNS-behandelt sind, unter Angabe reduziert entzündlichen Morphologie (Abb. 5A). Immunoreactivity von F4/80, ein Protein-Makrophagen-Marker (rote Fluoreszenz) auf Wunde Gewebeschnitte offenbart reduziert Makrophagen in SiKeap1 behandelt Wunden im Vergleich zu SiNS-Wunden (Abb. 5 b) behandelt. Dies zeigt weiter, dass die ROS visualisiert durch L-012 präzise und korrelieren mit anderen etablierten ROS Messmodellen liegen. Kritisch, die Anwendung dieser Technik nicht erforderlich Einbußen bei den Tieren für Gewebeschnitte da für H & E und Immunfluoreszenz-Färbung notwendig ist.
Abbildung 1: Versuchsaufbau für die Abbilderstellung. (A) diabetischen Mäusen sind anhand eines etablierten excisional Wunde verletzt. (B) ein Grundlinie Überlagerung der Fotografie mit Biolumineszenz Pre-L-012-Injektion. (C) nach intraperitonealer Injektion mit L-012 ROS visualisiert. Lumineszenz-Skala für B und C. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Einstellungen für Bild und Analyse in in-vitro- imaging-Systemprogramm. (A) wählen Sie "Imaging Wizard" auf dem Erwerb Bedienfeld (roter Pfeil). (B) "Biolumineszenz Imaging" ist der bildgebenden Modus ausgewählt. (C) "offene Filter" wird als die Messtechnik ausgewählt. (D) Bildgebung gewähltes Thema ist "mouse" und "time Serie Studie" aktiviert ist. Die Gesamtzahl der Segmente und Verzögerungszeit zwischen Segmenten eingegeben wird. (E) wählen Sie "erwerben Sequence" zum Fortsetzen der Bildgebung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Längsschnittstudien von in Vivo ROS Bildgebung. Diabetische Mäusen werden abgebildet, für 1 Minute nach intraperitonealer Injektion mit L-012 in 5 Minuten Intervallen im Laufe von 60 min. rote Kreise: ROI. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Quantifizierung der Biolumineszenz. Fotos mit Biolumineszenz Testblatt der diabetischen Wunden (A) vor der L-012 Injektion, (B) mit Wunden behandelt mit Sünden nach L-012 Injektion, und (C) mit Wunden mit SiKeap1 nach L-012 Injektion behandelt. (D) Quantifizierung der durchschnittliche Biolumineszenz geteilt durch die Fläche des ROIs für Sünden und SiKeap1 behandelten Wunden. Gelbe Kreise: ROI. Daten werden als Mean±standard Abweichung dargestellt; p < 0,05, n = 4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: ROS Korrelationen mit immunhistochemischen Flecken. (A) H & E Flecken diabetischen Wunde Gewebeschnitte an 10 Tagen zeigte reduzierte zelluläre Infiltrat als Beweis für reduzierte entzündliche Morphologie in der SiKeap1 behandelt Wunden im Vergleich zu den SiNS -Wunden behandelt. (B) F4/80 Immunfluoreszenz (rot) zeigten verringerte Anzahl von Makrophagen in SiKeap1 behandelt Wunde Abschnitte 10 Tage im Vergleich zu ihren SiNS -Pendants behandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| ROI | Si | Insgesamt zählt | AVG zählt | STABW zählt | Bereich [cm ²] | Gesamtfläche zählt | Durchschnittliche Anzahl/Fläche |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| ROI 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| ROI 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| ROI 4 | NS | 1.24E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| ROI 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| ROI 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| ROI 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tabelle 1: Quantifizierung der Biolumineszenz für ROIs definiert. Biolumineszenz ist für jede ROI gemessen und im Vergleich zu Fläche standardisiert. Berechnungen für Mittelwert, Standardabweichung und Standardfehler werden entsprechend berechnet. ROI 1, 2, 3 und 4 stellen ROI aus den Wunden der biologischen Wiederholungen von Sünden behandelt, diabetische Wunden und ROI-5, 6, 7 und 8 Stellen ROIs aus biologischen Wiederholungen des SiKeap1 behandelt diabetische Wunden.
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Discussion
Gängige Techniken zur Messung von ROS haben durch komplexe Protokolle erfordern Gewebe Extraktion oder ähnlich invasive Techniken beschränkt wurde. In den letzten Jahren wurden Messungen von oxidativem Stress auf der Grundlage innovativer bildgebender Verfahren, wodurch für räumlich-zeitliche Einschätzungen9,10,11beschrieben. L-012 hat mehrere Vorteile als Chemilumineszenz Sonde relativ Luminol, Lucigenin und MCLA1,4. Die Verbindung ist nicht toxisch, leicht absorbiert und hat viel stärker Biolumineszenz verglichen mit Luminol oder ähnliche Sonden12. Kritisch, L-012 kann sicher mehrfach verabreicht werden, im Kontinuum für Längsschnittanalyse ohne Nebenwirkungen oder Schäden an Tier-Modelle6. Diese Strategie erfordert begrenzt Spezialausbildung und die notwendige Ausrüstung ist leicht zugänglich in den meisten Forschungslabors, so dass es eine allgemein zugängliche Protokoll.
Für eine optimale Nutzung empfehlen wir Reagenzien werden richtig auf dem neuesten Stand und geschützt vor Licht, Verschlechterung zu vermeiden. Humanisierung von Wunden durch Stenting ermöglicht murinen Wundheilung durch Migration und erneute Epithelisierung, im Gegensatz zu durch deutliche Kontraktion. Nähte sollten zwei Drittel des Weges durch den Stent Umfang Wundränder im Ort sichern platziert werden. Umwickeln Mäuse mit Klarsichtfolie dressing nach Gel Anwendung sorgt dafür, dass topische Behandlungen in Kraft bleiben. Um selbst zugefügte Wunden bei den Mäusen zu verhindern, die Ergebnisse zu verwirren kann, kann an der Peripherie und Naht Knoten zu beißen entmutigen Bitter schmeckenden Spray angewendet werden. L-012 hat eine begrenzte Löslichkeit in PBS, sondern bildet eine Suspension von sich wiederholenden Pipettieren der Lösung. Diese Maßnahmen zur Fehlerbehebung Kohärenz über verschiedene Wunden, Beseitigung von Inter Benutzer Variabilität unter Beibehaltung Tierkomfort. Da diese Technik stützt sich auf die intraperitoneale Injektion einer Lösung in einem Tiermodell, gibt es mehrere Störfaktoren, die den Tieren, die nicht kontrolliert werden können. Beispielsweise können nicht lokale Durchblutung und anschließende Absorption und Lokalisierung von L-012 auf die Bereiche des Interesses diktiert werden. Diese Variable kann jedoch durch den Einsatz eines Tieres gemildert werden, wie eine eigene interne Kontrolle so, dass eine Wunde mit SiNS und andererseits mit der SiKeap1behandelt werden kann.
Wir berichten über den Nutzen einer Strategie für die in-Vivo -Studie von ROS in einer kutanen Wundheilung Modell. In unserem vorliegenden Studie führte die Behandlung von Wunden mit Keap1 SiRNA verminderte oxidative Belastung, die unser Verständnis von der Bedeutung der Nrf2 bestätigt /Keap1 Weg für antioxidative handling. Während diese Methode zur quantitativen Analyse ermöglicht, gibt es eine Reihe von wichtigen Einschränkungen. Während L-012 sehr empfindlich ist, es ist nicht spezifisch für ROS und hat gezeigt, dass auch auf reaktiven Stickstoff Arten6reagieren. Weitere Analysen mit gezielten Sonden und Immunoassay-basierte Methoden ergänzen diesen Ansatz durch erhöhte Spezifität und subzelluläre Lokalisation der ROS Korrelate13. Der vorgeschlagene Mechanismus für L-012-basierte Biolumineszenz beinhaltet die Oxidation von L-012 durch molekularen Sauerstoff durch die Tätigkeit von Peroxidase in Kombination mit H2O212. Dies schränkt die Verwendung dieser Technik für das Studium Antioxidans Enzyminhibitoren, die mit Peroxidase interagieren. Eine detailliertere Analyse sollen speziell ROS als Superoxid-Anion zu quantifizieren oder reaktiven Stickstoff Arten Metaboliten ist nicht mit der aktuellen Strategie möglich.
Angesichts die hohe Empfindlichkeit des L-012 zur Erkennung von ROS im großen und ganzen ist es bereitwillig anpassungsfähig für verschiedene kutanen Wundheilung und andere Gewebemodelle. Wir haben die Zweckmäßigkeit dieser Technik für die Beurteilung die Redox-Auswirkungen der gezielte Therapie diabetischer Wunden wie RTA 408 und die Lipoproteoplex Lieferung Keap1 SiRNA14,15gezeigt. Da die wesentlichen Stärken dieses Protokolls, gibt es immens großes Potential bei der Anwendung der ähnlicher Strategien für das Studium von ROS in tiefer Fächer durch Ex Vivo Ansätze, fokussierte Sezierungen und Organellen.
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Disclosures
Wir haben keine Angaben zu berichten.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die präklinische Imaging Core an der New York University School of Medicine, mit besonderem Dank an Orlando Aristizabal und Youssef Zaim Wadghiri. Der Kern ist eine gemeinsam genutzte Ressource, teilweise unterstützt von Laura und Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087 und NIBIB Biomedizinische Technologie Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Diese Arbeit wurde unterstützt von der American Diabetes Association "Weg zu stoppen Diabetes" D.C. [Grant-Nummer 1-16-ACE-08] und NYU angewendet Unterstützung Forschungsfonds, P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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