Summary
Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.
Abstract
A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é uma característica dos processos inflamatórios, mas em excesso, estresse oxidativo é amplamente envolvido em várias patologias como câncer, aterosclerose e diabetes. Mostramos anteriormente que a disfunção do fator Nuclear (eritroide-derivado 2)-tipo 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como derivado de células proteína 1 (Keap1) sinalização percurso leva ao extremo desequilíbrio ROS durante cutânea cicatrização em diabetes. Desde que os níveis ROS são um importante indicador da progressão da cicatrização, técnicas de quantificação específica e precisos são valiosas. Têm sido descritos vários ensaios em vitro para medir ROS em células e tecidos; no entanto, eles apenas fornecem uma única medida cumulativa por amostra. Mais recentemente, o desenvolvimento de indicadores baseados em proteína e as modalidades de imagem permitiram análises spatiotemporal exclusivas. L-012 (C13H8ClN4NaO2) é um derivado de luminol que pode ser usado tanto em vivo e em vitro quimioluminescente deteção de ROS gerado pelo oxidase NAPDH. L-012 emite um sinal mais forte do que outras sondas fluorescentes e tem se mostrado sensível e confiável para a detecção de ROS. A aplicabilidade de lapso de tempo de L-012-facilitou a imagem fornece informações valiosas sobre processos inflamatórios, reduzindo a necessidade de sacrifício e globalmente, reduzindo o número de animais de estudo. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando L-012-facilitado na vivo por imagens para quantificar o estresse oxidativo em um modelo de cicatrização de feridas excisional usando ratos diabéticos com localmente disfuncional Nrf2/Keap1.
Introduction
Metabólitos de oxigênio gerados através de processos inflamatórios contribuam para diversas cascatas de sinalização, bem como alteração destrutiva de componentes celulares1. Utilizando técnicas sensíveis e específicas para medir ROS é crítico para estudar processos inflamatórios e caracterizar os efeitos do estresse oxidativo. Imagem latente na vivo é valioso devido à sua capacidade para fornecer dados de dinâmicos espaciais e temporais em tecido vivo. L-012 é uma sonda quimioluminescente sintética que é altamente sensível para ânions superóxido e produz uma intensidade de luz mais elevada do que outras sondas fluorescentes em células, tecidos e sangue total1,2,3, 4. tem sido empregado com sucesso para a imagem latente na vivo em modelos murino para estudar várias doenças inflamatórias, incluindo artrite e colite5,6. Ainda tem que ser empregado numa ferida cutânea estabelecida modelo de cura. Medição de ROS gerado é igualmente relevante para avaliar a progressão da cicatrização de feridas em condições diferentes. A sensibilidade e a natureza não-invasiva deste método torna uma técnica promissora para estudar a cicatrização de feridas em modelos murino.
Nrf2 é um grande condutor da resposta antioxidante e um fator transcricional com especificidade para o elemento de resposta antioxidante (são) comum às regiões promotor de várias enzimas de antioxidante8. Na ausência de estresse oxidativo, Nrf2 é sequestrado no citoplasma por Keap1, que posteriormente provoca sua ubiquitination e degradação. Desequilíbrio da via Nrf2/Keap1 tem sido implicado na homeostase redox inapropriado e posterior cicatrização no cenário de maior estresse oxidativo9. Anteriormente mostramos que a supressão de Keap1 estimula o aumento da atividade Nrf2 e promove resgate da cicatrização de feridas cutâneas patológica no diabético feridas9.
Aqui descrevemos um protocolo que utiliza bioluminescência L-012-assistida de imagem para medir os níveis ROS em um modelo de cura ferida cutânea excisional, que é fundamental para destacar a associação entre ROS e cicatrização de feridas. Esta técnica demonstra alterações em tempo real em carga oxidativa dentro feridas e periferia imediata. Além disso, este método permite rápida avaliação de intervenções e mecanismos de manipulação de redox que afetam. Aqui usamos um modelo de Keap1 nocaute para a restauração da homeostase redox para avaliar a aplicabilidade da nossa estratégia. Porque nossa técnica é não-invasivo e feridas são imperturbadas, o mesmo animal pode ser usado para mais confirmação análises com base em lysates histologia ou célula.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da New York University School of Medicine. Todos os ratos estão alojados atrás de uma barreira e todo o pessoal usa equipamento de protecção adequado.
1. dia 0: Preparação do modelo murino de cicatrização Excisional
- Anestesia o diabéticos ratos (Leprdb/db), com idades entre 8 a 12 semanas, com isoflurano inalatório de 2%. Confirme que cada rato tem sido devidamente anestesiado utilizando o teste do beliscão pé almofada. Aplique lubrificante ocular esterilizada para cada olho para evitar a irritação do ressecamento. Pesquisadores devem seguir as orientações do seu pessoal veterinário institucional ao anestesiar animais utilizando isoflurano.
- Pesar os ratos e registar o peso corporal de cada rato. Confirme o estado diabético de animais gravando a glicose no sangue de cada animal utilizando um glicosímetro.
- Desinfecte o equipamento de anestesia e espaço de trabalho processual. Remover os pelos dorsais dos ratos usando uma máquina de cortar cabelo, seguido pela aplicação de loção de cabelo remoção limpe o excesso de pelos fora. Utilize toalhetes com álcool para limpar a pele exposta, duas vezes e deixe para secar.
- Crie duas feridas de espessura total de 10 mm estendendo-se através da carnosus panículo usando socos de biópsia estéril de 10 mm de acordo com uma ferida excisional bem-estabelecida cura técnica7,8. Use luvas estéreis para todas as cirurgias de sobrevivência. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos em sacos antes da cirurgia e aberto apenas no campo cirúrgico.
- As feridas abrir usando uma folha de silicone grossa de 0,5 mm com recortes circulares de 10 mm e fixe os stents no lugar usando o splint interrompido suturas de seda 4-0.
- Seguir cirurgia, remover os animais da anestesia e coloque no aquecimento pad para facilitar a recuperação adequada. Digno de nota, se a temperatura do corpo do animal diminui durante o procedimento, o animal pode ser transportado para a almofada de aquecimento mais cedo para minimizar a perda de calor do corpo sob anestesia. Monitore os animais até que estejam acordados e móveis.
- Depois de totalmente recuperado, volte os animais para gaiolas individuais, contendo alimentos e água (certifique-se de que comida está no chão da gaiola para enriquecimento no pós-operatório). Fornece toalhas de papel picado adicional material de nidificação por 2 semanas. Não faz casa animais que se submeteram à cirurgia com outros animais, para evitar interações adversas e alterações de status de cura de feridas.
- Para alívio da dor pós-operatória, injete ratos por via subcutânea com buprenorfina em 0,1 mg/kg de peso corporal duas vezes por dia, começando imediatamente após o procedimento, durante 3 dias.
2. dia 1: Preparação de siRNA Keap1
Nota: Prepare todos os tratamentos dentro de um armário de biossegurança.
- Prepare-se diluição de siRNA combinando 37,5 µ l de meio de soro reduzida com 12,5 µ l de 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo.
- Prepare a diluição de lipossoma combinando 25 µ l de meio de soro reduzida com 25 µ l de mistura de lipossomas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Adicionar 50 µ l da diluição de siRNA para 50 µ l lipossoma diluição gota a gota (volume de 1:1) e misture suavemente.
- Incube durante 20 minutos em temperatura ambiente.
- Adicionar 50 µ l de gel de metilcelulose 2% em água e misture suavemente pipetando para cima e para baixo.
- Tratar cada animal com um si de bobagemNS (controle) ou siKeap1 (experimental). Aplique o gel para o topo da ferida. Envolva o tronco do animal com curativo de filme transparente para manter o gel no local, mantendo os membros livres para manter a mobilidade.
3. dia 3: Preparação da solução L-012
Nota: Prepare todos os reagentes em um armário de biossegurança.
- Em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, prepare L-012 em 1X PBS numa concentração de 0,5 mg/100 mL.
- Manualmente o vórtice do tubo de microcentrifugadora. O L-012 não completamente se dissolve na PBS, porém deve ser uniformemente suspensa no líquido. Digno de nota, não tente dissolver L-012 na água para evitar perturbador fisiológica de eletrólitos depois da injeção.
- Transferi a solução para uma seringa de 1 mL, utilizando uma agulha de 27G.
Nota: Certifique-se de proteger a solução de L-012 de luz.
4. dia 3: In Vivo Imaging de feridas diabéticas
- ANESTHETIZE ratos com isoflurano inalatório de 2%. Pesquisadores devem seguir as orientações do seu pessoal veterinário institucional ao anestesiar animais utilizando isoflurano. Confirme que cada rato tem sido devidamente anestesiado utilizando o teste do beliscão pé almofada. Aplique lubrificante ocular esterilizada para cada olho para evitar a irritação do ressecamento.
- Suavemente retire o curativo de filme transparente os ratos sem perturbar as feridas.
- Coloque os ratos no hemiciclo de imagens em seus respectivos pedidos. Para manter níveis adequados de2 O na câmara, defina a entrada de sistema de imagem e os níveis de2 indução câmara O a 1,0 L/min.
- Os ratos de bioluminescência e fotografia na linha de base antes da injeção do composto L-012 da imagem.
- Limpe o abdômen com toalhetes com álcool e deixe para secar. Realize uma injeção intraperitoneal da solução de L-012 de 5 mg por peso de 200 g, utilizando uma agulha de calibre 27. Por exemplo, um mouse com 20 g deve receber 0,5 mg de L-012.
- Imediatamente após a injeção de L-012, coloque os ratos em seus respectivos locais na câmara de imagens. Os ratos da imagem ao longo de 60 minutos, durante 1 minuto com intervalos de 4 minutos. Defina a ferida de 10 mm como a região de interesse para a determinação do nível de ROS.
- Seguir cirurgia, remover os animais da anestesia e coloque no aquecimento pad para facilitar a recuperação adequada. Monitore os animais até que estejam acordados e móveis.
- Depois de totalmente recuperado, volte os animais para gaiolas individuais, mantendo o mesmo ambiente de enriquecimento pós-operatória descrito anteriormente no 1.6. Não faz casa animais que se submeteram à cirurgia com outros animais, para evitar interações adversas e alterações de status de cura de feridas.
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Representative Results
Três dias depois de criar feridas bilaterais de acordo com um modelo estabelecido ferida excisional (figura 1A), ratos diabéticos estão posicionados na câmara de imagens. Uma fotografia inicial e uma medida de bioluminescência são tomadas antes da injeção de L-012 a conta para o sinal de fundo (figura 1B). Após injeção intraperitoneal com a solução de L-012, os ratos são reposicionados na câmara e bioluminescência é visualizada em áreas da ferida onde ROS for detectada (Figura 1). Depois de selecionar a imagem correta e análise configurações conforme descrito na Figura 2, prossiga com a imagem. Bioluminescência é gravada durante 1 minuto em intervalos de 5 minutos ao longo de 60 minutos (Figura 3). Isto demonstra a saturação de bioluminescência da região de interesse ao longo do tempo. Em nosso modelo animal, tempo de imagem ideal para atingir a saturação completa do L-012 foi determinado como sendo 50 min, depois do qual nenhuma diferença notável em bioluminescência foi apreciada. Desta vez será diferente dependendo do animal modelo utilizado e deve ser independente determinado e otimizado para diferentes modelos de ferida, dependendo do tamanho, tipo de animal, tratamento, etc.
Uma região de interesse (ROI) com a finalidade de quantificar a bioluminescência limitada à área ferida diabética é desenhada sobre a imagem de superposição (Figura 4). Estes ROIs são definidos da mesma forma para todas as feridas, incluindo antes da injeção de L-012 (Figura 4A) e após a injeção de L-012 no absurdo de siRNA-tratada (Figura 4B) e Keap1 ratos tratados com siRNA (Figura 4). Bioluminescência foi calculada dividindo-se a contagem total da intensidade luminosa pela área. A tabela 1 mostra os cálculos graficamente na Figura 4. As feridas diabéticos tratados com siRNA absurdo tinham 45.775 11.649 bioluminescência/cm2, enquanto Keap1 supressão resultou em bioluminescência de 19.405 5.939/cm2 (média SD). Um de t-Student demonstrou uma diminuição significativa da bioluminescência (p = 0.042) no Keap1 tratados com siRNA ferida em comparação com o absurdo siRNA-tratados ferido, correlacionando com baixa carga oxidativa com maior atividade do Nrf2 (Figura 4 D). para confirmar que os níveis relativos de ROS visualizado pela L-012 em siNS e correlacionar de siKeap1 com outros meios estabelecidos de medir a inflamação, foram analisados 10 dia ferida seções do tecido. H & E manchas mostraram reduzida infiltração celular em siKeap1-tratados feridas em contraste com siNS-os tratados, indicando reduziram morfologia inflamatória (Figura 5A). Imunorreatividade de F4/80, um marcador para macrófagos, proteína (fluorescência vermelha) na ferida cortes histologicos revelada reduzido feridas de macrófagos em siKeap1 tratados em comparação com siNS-tratamento de feridas (Figura 5B). Isto demonstra ainda mais que os níveis ROS visualizados pela L-012 são precisas e correlacionar com outros modelos de medição de ROS estabelecidos. Criticamente, aplicar esta técnica não necessitam sacrificar animais para cortes histologicos requeridos para a H & E e mancha da imunofluorescência.
Figura 1: montagem Experimental para tratamento de imagens. (A) de ratos diabéticos estão feridos, usando um modelo estabelecido excisional ferida. (B) A sobreposição de linha de base da fotografia com a injeção de pre-L-012 bioluminescência. (C) após injeção intraperitoneal com L-012, ROS é visualizado. Escala de luminescência para B e C. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configurações de imagem e análise em vitro programa sistema de imagem. (A), selecione "Imaging assistente" no painel de controle de aquisição (seta vermelha). (B) "Bioluminescência de imagem" é o modo de imagem selecionado. (C) "filtro aberto" é selecionado como a técnica de medição. (D) Imaging assunto selecionado é "mouse" e a opção de "estudo de série de tempo" está selecionada. O número total de segmentos e tempo de atraso entre segmentos é a entrada. (E) selecione "sequência de adquirir" para prosseguir com a imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: estudos longitudinais de na vivo imagem ROS. Ratos diabéticos são fotografados por 1 minuto após injeção intraperitoneal com L-012 no minuto 5 círculos de intervalos ao longo de 60 min. vermelho: ROI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: quantificar bioluminescência. Fotografias com sobreposição de bioluminescência de feridas diabéticas (A) antes da injeção de L-012, (B) com ferimentos trataram com pecados após injeção de L-012 e (C) com ferimentos tratados com siKeap1 após a injeção de L-012. (D) quantificação de bioluminescência média dividido por área de superfície da ROIs para pecados e siKeap1 feridas tratadas. Círculos de amarelo: ROI. Dados são representados como média ± desvio; p < 0.05, n = 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ROS correlações com manchas immunohistochemical. (A) H & E manchas de diabético ferida cortes histologicos em 10 dias mostraram infiltrado celular reduzido como provas de morfologia inflamatória reduzida em siKeap1 trataram feridas em comparação com o siNS -trataram de feridas. (B) F4/80 imunofluorescência (vermelho) mostrou diminuição número de macrófagos ΔH feridaKeap1 tratados seções em 10 dias, em comparação com seu siNS -trataram homólogos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| ROI | Sim | Contagem total | Contagens de AVG | DESVPAD contagens | Área [cm ²] | Contagens/área total | Contagens/área média |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| ROI 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| ROI 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| ROI 4 | NS | 1.24 E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| ROI 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| ROI 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| ROI 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tabela 1: quantificação bioluminescência para definido ROIs. Bioluminescência é medida para cada ROI e padronizada em relação à área de superfície. Cálculos de média, desvio padrão e erro padrão são calculados em conformidade. ROI de 1, 2, 3 e 4 representam ROI das feridas das repetições biológicas dos pecados tratados feridas diabéticas e ROI 5, 6, 7 e 8 representam ROIs de repetições biológicas de siKeap1 tratados feridas diabéticas.
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Discussion
Técnicas comuns de medição ROS tem sido limitadas pela protocolos complexos que requerem a extração do tecido ou da mesma forma técnicas invasivas. Nos últimos anos, as medidas de estresse oxidativo têm sido relatadas com base nas modalidades de imagem inovadoras, permitindo assim que para avaliações spatiotemporal9,10,11. L-012 tem várias vantagens, como uma sonda quimioluminescente relativo MCLA1,4, lucigenin e luminol. O composto é non-toxic, facilmente absorvido, e tem muito mais forte bioluminescência em comparação com o luminol ou similar sondas12. Criticamente, L-012 pode ser administrada com segurança várias vezes no continuum para análise longitudinal, sem quaisquer efeitos adversos ou danos ao animal modelos6. Esta estratégia requer treinamento especial limitado, e o equipamento necessário está prontamente disponível na maioria dos laboratórios de pesquisa, tornando-se um protocolo amplamente acessível.
Para uma utilização óptima, sugerimos que os reagentes ser devidamente atualizado e protegido da luz, para evitar a degradação. Humanizar as feridas através de implante de stent permite murino feridas cicatrizam através da migração e re-epitelização, ao contrário de contração significativa. As suturas devem ser colocadas dois terços do caminho através do perímetro do stent para proteger as bordas da ferida no lugar. Quebra automática de ratos com película transparente vestir após a aplicação do gel garante que tratamentos tópicos permanecem no lugar. Para evitar ferimentos auto-inflingidos nos ratos, que podem confundir os resultados, spray de sabor amargo pode ser aplicado para as periferia e sutura nós para desencorajar a morder. L-012 tem uma limitada solubilidade em PBS, mas irá formar uma suspensão pipetando repetitivo da solução. Estas medidas de solução de problemas de garantir a consistência em feridas diferentes, eliminando variabilidade inter usuário mantendo conforto animal. Uma vez que esta técnica depende da injeção intraperitoneal de uma solução em um modelo animal, existem vários fatores interferentes inerente aos animais que não podem ser controlados. Por exemplo, o fluxo sanguíneo local e subsequente absorção e localização de L-012 para as áreas de interesse não podem ser ditadas. No entanto, esta variável pode ser atenuada com o uso de um animal como seu próprio controle interno tal que uma ferida pode ser tratada com siNS e o outro com o siKeap1.
Nós relatamos sobre a utilidade de uma estratégia para o estudo em vivo de ROS em uma ferida cutânea, modelo de cura. Em nosso estudo, tratamento de feridas com siRNA Keap1 resultou na diminuição da carga oxidativa que confirma a nossa compreensão do significado do Nrf2 / manuseio deKeap1 caminho de antioxidante. Embora esse método permite a análise quantitativa, há uma série de limitações importantes. Enquanto L-012 é altamente sensível, não é específico para ROS e mostrou também reagir de espécies reativas de nitrogênio6. Uma análise mais aprofundada com sondas específicas e métodos baseados em imunoensaio complementam esta abordagem através de maior especificidade e Localização subcellular da ROS correlaciona-se13. O mecanismo proposto pela L-012-baseado bioluminescência envolve a oxidação de L-012 pelo oxigênio molecular através da atividade de peroxidase em combinação com H2O212. Isso limita o uso desta técnica para o estudo de inibidores de enzima antioxidante que interagir com peroxidase. Análise mais detalhada visa especificamente quantificar ROS além de anião superóxido ou metabólitos de espécies reativas de nitrogênio não é possível com a estratégia atual.
Dada a alta sensibilidade do L-012 para a detecção de ROS em geral, é facilmente adaptável para outros modelos de tecido e cicatrização de feridas cutâneas diversas. Nós demonstramos a conveniência desta técnica para avaliar as implicações de redox do therapeutics alvejado para feridas diabéticas como RTA 408 e a entrega de lipoproteoplex de Keap1 de14,de siRNA15. Tendo em conta os pontos fortes significativos do presente protocolo, há imenso potencial futuro na aplicação de estratégias semelhantes para estudar ROS dentro de compartimentos mais profundos através de abordagens ex vivo , dissecações focadas e organoids.
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Disclosures
Nós temos nenhum divulgações para o relatório.
Acknowledgments
Estamos gratos ao núcleo pré-clínicos Imaging a NYU School of Medicine, com agradecimento especial a Orlando Aristizabal e Youssef Zaim Wadghiri. O núcleo é um recurso compartilhado, parcialmente apoiado pela Laura e Isaac Perlmutter Cancer Center suporte Grant NIH/NCI 5P30CA016087 e NIBIB biomédica Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de Diabetes "Caminho para parar de Diabetes" D.C. [número de concessão 1-16-ACE-08] e NYU aplicado apoio fundo de investigação para relações públicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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