Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de immunisatie van de volwassen zebravissen (Danio rerio) met een op basis van DNA vaccin en de validatie van een succesvolle vaccinatie evenement aan te tonen. Deze methode is geschikt voor de preklinische screening van vaccin kandidaten in verschillende modellen van de infectie.
Abstract
De belangstelling voor DNA gebaseerde vaccinatie is toegenomen tijdens de afgelopen twee decennia. DNA vaccinatie is gebaseerd op het klonen van een opeenvolging van een geselecteerde antigeen of een combinatie van antigenen in een plasmide, waarmee een ontwerp op maat en veilig. Het beheer van DNA-vaccins in cellen van de gastheer leidt tot de uitdrukking van antigenen die zowel de humorale als de cel-gemedieerde immuun reacties stimuleren. Dit verslag beschrijft een protocol voor het klonen van antigeen sequenties in de pCMV-EGFP plasmide, de immunisatie van volwassen zebrafish met de kandidaten van de vaccin door intramusculaire microinjection, en de daaropvolgende electroporation ter verbetering van de inname. De vaccin-antigenen worden uitgedrukt als de groen fluorescente proteïne (GFP)-fusie-eiwitten, waardoor de bevestiging van de antigeen-expressie onder UV-licht van levende vis en de kwantificering van de niveaus van de expressie van de fusieproteïne met ELISA, zo goed als hun detectie met een westelijke vlekkenanalyse. Het beschermende effect van de kandidaten van het vaccin is getest door het infecteren van de vis met Mycobacterium marinum vijf weken postvaccination, gevolgd door de kwantificering van de bacteriën met qPCR vier weken later. Ten opzichte van zoogdieren preklinische screening modellen, biedt deze methode een voordelige methode voor de oriënterende van kandidaten van de nieuwe DNA-gebaseerd vaccin tegen een mycobacteriële infecties. De methode kan verder worden toegepast om te screenen op basis van DNA vaccins tegen verschillende bacteriële en virale ziekten.
Introduction
De eerste DNA vaccin studies werden uitgevoerd in de jaren 1990-1, en sindsdien, DNA-vaccins tegen diverse besmettelijke ziekten, kanker, autoimmuniteit en allergie2zijn getest. Bij zoogdieren, een DNA-vaccin tegen West-Nijlvirus bij paarden en een therapeutische kanker vaccin voor canine mondelinge melanoom in licentie is gegeven, maar deze zijn momenteel niet in klinische gebruik2. Naast het belang opgeroepen door zoogdieren studies, heeft DNA vaccinatie bleek te zijn een handige manier om te immunizeren gekweekte vis tegen virusziekten. Een vaccin tegen vis infectieuze hematopoïetische necrose virus (IHNV) is in commercieel gebruik sinds 2005, en een vaccin tegen infectieuze alvleesklier necrose virus (IPNV) was onlangs licentie3. Bovendien worden verschillende DNA-vaccins tegen vis ziekteverwekkers ontwikkeld.
Zoals traditionele vaccins vaak geïnactiveerde of levende verzwakte ziekteverwekkers bevatten, vormen ze een potentiële risico van overdracht van de ziekte-2. DNA-vaccins, voorkomen op zijn beurt, dit risico, omdat ze gebaseerd zijn op het beheer van de plasmide codering bacteriële of virale antigenen, in plaats van de hele pathogen zelf2,4. DNA-vaccins worden geproduceerd met DNA recombinatie technieken, waarmee het nauwkeurige ontwerp van vaccin-antigenen en het flexibel opstellen van antigeen combinaties en hulpstoffen in een enkel vaccin construct5. Bovendien is de productie van DNA-vaccins is sneller, gemakkelijker en meer kosten-efficiënter dan die van op basis van eiwitten recombinante vaccins, die is een groot voordeel voor vaccin kandidaat screeningonderzoek, maar ook bijvoorbeeld bij het uitbreken van de pandemie 2.
In vis, de meest voorkomende administratie routes voor DNA-vaccins zijn intraperitoneaal, intramusculaire en mondelinge3,6,7, terwijl bij zoogdieren, subcutane en intradermale routes zijn extra opties2. Na een intramusculaire injectie, de beheerde DNA-plasmiden Voer de cellen bij de beheersite (bv., meestal myocytes, maar ook resident antigeen-presenteren cellen [APCs]). Het aandeel van transfected cellen kan aanzienlijk worden verhoogd door electroporation2,8. Na het invoeren van de cel, komt sommige plasmide DNA de kern, waar zijn de genen gecodeerd door de plasmide getranscribeerde2. In dit protocol gebruiken we de pCMV-EGFP plasmide die een sterke alomtegenwoordige promotor geoptimaliseerd voor eukaryoot expressie9 heeft. In deze constructie, worden de antigenen vertaald als een fusieproteïne met een GFP. Het GFP waardoor de bevestiging van een succesvolle vaccinatie en het juiste antigeen-product door het eenvoudige visualisatie van antigeen expressie met een fluorescentie Microscoop in levende vis.
Bij zoogdieren, zijn DNA-vaccins aangetoond te stimuleren van verschillende soorten immuunresponsen afhankelijk van de transfected cel typen2,5. Transfected myocytes afscheiden van antigenen in de extracellulaire ruimte of vrij te laten op de dood van de cel, en de antigenen opgeslokt door APCs zijn, vervolgens gepresenteerd op grote histocompatibility complex II moleculen2. Dit triggert CD4 en CD8 T cel reacties, vooral naast B-cel reacties2,5,10. In vis, zijn T en B-lymfocyten, evenals dendritische cellen (DC's), geïdentificeerd, maar hun verdeling van de arbeid in antigeen presentatie minder goed begrepen11 is. Zebravis DCs, echter hebben aangetoond dat de geconserveerde fenotypische en functionele kenmerken delen met hun tegenhangers van de zoogdieren12. Bovendien, DNA vaccinatie is aangetoond dat het uitlokken van soortgelijke immuunresponsen in vissen en zoogdieren, met inbegrip van T en B-cel reacties6,13,14,15,16 .
Zowel de larven als de volwassen zebrafish worden veel gebruikt voor model verschillende infectieziekten, zoals de vis M. marinum infectie model van tuberculose gebruikt in dit protocol17,18,19,20 ,21,22. In vergelijking met zoogdieren modelorganismen, de voordelen van zebravis omvatten hun kleine omvang, snelle reproduceerbaarheid, en lage kosten23huisvesting. Deze aspecten maken de zebravis een ideale diermodel voor grootschalig preklinisch onderzoek studies voor nieuwe vaccins en farmaceutische stoffen23,24,25.
In dit protocol beschrijven we hoe roman vaccin antigeen kandidaten tegen mycobacteriosis kunnen worden geëvalueerd door de DNA gebaseerde vaccinatie van volwassen zebrafish. Eerst beschrijven we hoe antigenen zijn gekloond in de pCMV-EGFP expressie plasmide, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor de intramusculaire injectie van vaccin plasmiden en de daaropvolgende electroporation in spier. De expressie van elk antigeen wordt bevestigd door fluorescentie microscopie één week postimmunization. De werkzaamheid van het antigeen wordt vervolgens getest door experimenteel infecteren gevaccineerde vis met M. marinum.
Protocol
Experimenten met inbegrip van volwassen zebrafish voor dierproeven voor zowel de vaccinatie en de latere studies met het model van de infectie een machtiging nodig hebben. Alle methodes en experimenten die hier beschreven worden goedgekeurd door het dier Experiment Board van Finland (ESAVI) en de studies zijn verricht overeenkomstig richtlijn 2010/63/EU van de EU.
1. klonen van DNA-vaccin-antigenen
- Selecteer een expressie plasmide geoptimaliseerd voor de eukaryoot expressie van het antigen(s) van belang onder een sterke, constitutief promotor, zoals de onmiddellijke vroege promotor cytomegalovirus (CMV). Opdat de in vivo -keuring van de antigeen-expressie, selecteert u een vaccin plasmide die een fluorescerende tag, zoals de pCMV-EGFP plasmide9 gebruikt in dit protocol codeert.
- Passende web-based en bioinformatic hulpmiddelen gebruiken om te kiezen van een potentieel immuun-beschermende antigeen-reeks (of verschillende reeksen) van ongeveer 90-600 nt (30 – 200 aa)26 van de gene(s)-van-belang van het pathogene agens die worden gebruikt in de latere infectie model.
- Beschikbare software gebruiken, of handmatig ontwerpen van inleidingen te versterken van de antigeen-genen van het genoom van pathogenen en klonen van de antigeen-sequence(s) op de site van meerdere-klonen van de plasmide expressie. Zorg ervoor dat het juiste leesraam behouden bij het selecteren van het antigeen.
- Zowel een Kozak sequentie (CCACC)27 als een start codon (ATG) opnemen in de 5'-primer. Vermijd om te behouden de C-terminal EGFP tag, tussenliggende stop codonen (TAA, TAG, TGA) in de antigeen-reeks en de 3'-primer. Zorg er bovendien voor dat de GFP-tag in de dezelfde leesraam met het antigeen van belang blijft.
- RNA of DNA geëxtraheerd uit het pathogene agens oplevert als sjabloon gebruiken voor het genereren van een voldoende hoeveelheid van het PCR-product met het klonen inleidingen. Bij voorkeur, gebruik een corrigeren polymerase van DNA voor het behoud van de juiste antigeen-reeks.
- Zuiveren van het PCR-product en controleer de juiste grootte van het product door gelelektroforese. Verteren en afbinden van het PCR-product met de plasmide verteerd vaccin.
- Transformeer de afbinding mix in bevoegde bacteriecellen volgens een geschikte protocol. Gebruik van een adequate antibiotische selectie voor positieve kolonies en plasmide productie in E. coli; de pCMV-EGFP plasmide, bevat bijvoorbeeld een ampicilline-resistentie gen hiervoor.
- Gebruik Sanger sequencing te bevestigen van het inbrengen van de juiste antigeen-reeks. De volgende inleidingen kunnen worden gebruikt voor het rangschikken antigenen in de pCMV-EGFP plasmide: CMV vooruit 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 'en EGFP-N achteruit 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'.
- Produceren en te zuiveren van een voldoende hoeveelheid van de vaccin-constructie. Ontbinden of elueer de plasmide in steriel water. Ervoor te zorgen dat de geproduceerde plasmide-DNA van hoge kwaliteit is en de concentratie ten minste 0,72 µM of 2.000 ng/µL is.
2. het trekken van de Microinjection naalden
- Bereiden microinjection naalden. Gebruik 10-cm aluminosilicaat glazen capillairen. Merk op dat borosilicaatglas haarvaten te broos voor het injecteren van volwassen vis.
- Trek de naalden met een micropipet-naald-fabriceren apparaat.
Opmerking: De naalden ziet er vergelijkbaar is met de in Figuur 1gepresenteerd. Met het apparaat dat wordt gebruikt in dit protocol (Tabel of Materials), resulteren de volgende instellingen in het gewenste soort naalden:- Instellen van de glazen capillaire in de V-groef in de bar van de trekker en draai de klemmen knop licht.
- Verplaats de houder naast de gloeidraad en duw voorzichtig het capillair via de gloeidraad in de bar van de trekker aan de andere kant van de gloeidraad. Raak de gloeidraad met het capillair.
- Draai de klemmen knoppen, de veiligheidsglas vastgelegd, en druk op de knop trek.
Let op: De gloeidraad heet.
- Plaatst de naalden op een stuk van herbruikbare lijm in een petrischaal 15 cm plaat ter bescherming van de naald-tips. Houd de schaal bedekt voor de naalden schoon te houden.
3. vullen van de micropipet-naalden
- De mix van vaccin te bereiden. 0,5 – 12 µg plasmide per dosis gebruiken. Als het combineren van verscheidene verschillende plasmiden in één vaccinatie mix, gebruiken een totale DNA maximumconcentratie van 12 µg per vis.
- Bereken het volume van het vaccin "master mix" volgens het aantal vissen in elke groep (zie hieronder). 1 µl van steriele gefiltreerd fenol rood toevoegen aan elke dosis van de injectie te verlichten van zowel het vullen van de capillaire naalden en de observatie van de injectie. Toevoegen van steriele 1 x PBS tot een maximumvolume van 5 – 7 µl in één injectie dosis8op de totale.
Opmerking: Injectie volumes hoger dan 7 µL kunnen resulteren in de occasionele lekkage van de injectie-oplossing en daarom moeten worden vermeden. - Plaats een stukje tape, lijm kant naar boven, op een passende houder, bijvoorbeeld, de kant van een lege tip-box. Zachtjes de capillaire naalden te hechten aan de tape.
- Pipetteer een maximum van 7 µL van de vaccin-mix op een stuk van laboratorium film. Pipetteer met behulp van een tip van het laden, het vaccin uit de film in de naald. Pipetteer langzaam en zorgvuldig, Vermijd pipetting luchtbellen in de naald.
- Laat de naalden die genoegen nemen met 15-30 min mogelijk resterende kleine luchtbellen te verwijderen.
4. het opzetten van de Microinjector en de Electroporator voor immunisatie
- Stel de micromanipulator en een lichtbron in de juiste positie. Ga de lucht druk kraan naar de open positie.
- Aanpassen van de parameters voor de Pneumatische pomp (Zie ook Figuur 2) als volgt.
- Stel de vent -knop op de uitwerpen haven te houden om te voorkomen dat backfilling van de pipet door capillaire werking. Stel de slang van de uitwerpen haven op de micropipet. Gebruik niet de Vacuum poort in dit protocol.
- De Impulslengteaanpassen: gebruik de getimede modus, waar een elektronische timer controleert de duur van de tijd de druk magneetventiel open blijft. Controleer het groene lampje naast de Eject-manometer verlicht wanneer de druk solenoïde is opent (energiek).
- De pulse bereik ingesteld op 10 s; met deze instelling, de pulsen mogelijk verder ingesteld uit 100 ms op 10.1 s. Gebruik de 10-draai periode kiezen voor "fine-tuning"-de impulslengte — elke beurt van de wijzerplaat is 1.0 s. Indien nodig, kan dit ook worden aangepast tijdens een injectie.
- Gebruik de initiator van de pols ("startknop") op het voorpaneel van de Pneumatische pomp, of een externe voetschakelaar (aanbevolen). Dit is aangesloten op het voorpaneel van de Pneumatische pomp.
- Stel de naald op de houder van de micropipet van de micromanipulator. Snijd het puntje van de naald met een pincet, zodat de vloeistof kan worden geduwd, en gebruik van de Microscoop te bekijken van de juiste positie. Druk op de voetschakelaar eens om te zien dat een 1-s puls een kleine druppel uit de naald duwt.
- Gebruik de volgende instellingen voor de electroporator: voltage = 40 V; Pulse lengte = 50 ms, aantal pulsen = 6. De electroporator verbinden met de pincet. Zie dat de werkelijke spanning en pulslengte weergegeven op de monitor niet aanzienlijk van de instellingen verschillen.
5. injectie van het DNA-vaccin en Electroporation
- Voor inentingen volgens dit protocol, gebruik gezond, 6 tot en met 12 maanden oude volwassen zebrafish. Houd de vis in een flow-through-systeem met een 14/10 h licht/donker cyclus, met een maximum van zeven vis per 1 liter water.
- Voorbereiden op een 0,02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester (tricaïne) oplossing (pH 7) in tank water de vis28anesthetizing. Een 10 cm petrischaal of iets dergelijks gebruiken.
- Bereid een herstel tank door een bekerglas van 5 L vullen met 3 L water schoon systeem.
- Bereiden een vaccinatie opvulling om te houden van de vis in een vaste positie tijdens de vaccinatie. Neem een stukje van de2 5 x 7 cm van een 2 tot 3 cm dikke spons. Snijd een groef in de spons met een mes scalpel of scherpe schaar.
Opmerking: De dezelfde opvulling van de vaccinatie kan worden gebruikt in meerdere experimenten. Desinfecteren van de spons tussen de experimenten door het onderdompelen in 70% ethylalcohol en laten drogen. - Grondig week de spons in water van het systeem en de spons aangezet in een petrischaal.
- Snel de vis 24 h vóór de vaccinaties.
- Anesthetize een zebravis door deze te plaatsen op een petrischaal met 0,02% tricaïne. Wacht totdat de vis niet te raken van de stimulatie reageert en er geen verkeer van de kieuwen bestaat. Anesthetize een enkele vis tegelijk.
- Met behulp van een plastic lepel, breng de narcose zebravis op de natte spons en de ventrale zijde van het VIS afgezet in de groef. In de juiste positie, ervoor zorgen dat het hoofd en het grootste deel van het lichaam van de vis binnen de groef en de rugvin en de staart zijn uitsteken uit van de groef.
- Onder de Microscoop, zorgvuldig plaats de naald in een hoek van ongeveer 45° dicht bij de zebravis de dorsale spier, met behulp van de x - en y - as "fine-tuning"-wielen op de micromanipulator.
- De kleine vlek zonder schalen voor de rugvin, waar de naald duwen niet kracht eisen doet te vinden. Als weerstand wordt gevoeld, probeer dan een aangrenzende plek. Vermijd verwonden van de wervelkolom, de rugvin of de schalen.
Opmerking: Als de naald terwijl het duwen bochten, verkorten de naald iets door te snijden. - Gebruik de voetschakelaar te injecteren geleidelijk de vaccin-oplossing in de spier. Observeren van de injectie door de Microscoop: fenol rood is zichtbaar als het binnenkomt het spierweefsel. De duur van de pols aanpassen indien nodig.
Opmerking: Gebruik als alternatief, de initiatiefnemer pulsknop op het voorpaneel van de Pneumatische pomp voor de injectie. Echter, het gebruik van een externe voetschakelaar kan met behulp van de andere kant voor het aanpassen van de impulslengte door het wiel 10-draai-dial. Vermijd injecteren van de oplossing te snel, omdat dit overmatige weefselschade kan veroorzaken. Zorg ervoor dat niet te injecteren een lucht. - Electroporate de vis onmiddellijk na de injectie. Zorg ervoor dat de vis nog steeds onder verdoving is. Houd de vis op de spons en de vis tussen pincetten-type elektroden, zo ingesteld dat de elektroden bevinden zich aan elke kant van de injectieplaats. Druk niet op de elektrode pincet te strak maar houd beide elektroden in contact met de vis.
- Druk op de startknop op de electroporator te geven van zes 40 V, 50 ms pulsen.
- Zachtjes overbrengen in de vis de herstel-tank.
- Reinig de elektroden na elke electroporation door te jatten ze met 70% ethanol.
Nota: Zorgvuldig toezicht houden op het welzijn van de vissen na de vaccinatie. Geen tekenen van ongemak vis euthanaseren (een langzaam herstel van anesthesie, afwijkende zwemmen, hijgend) in 0,04% tricaïne. Na herstel, breng de vis aan de eenheid doorstroming en voeden het normaal.
6. visualisatie en beeldvorming van antigeen expressie
- Anesthetize de vis in 0.02% tricaïne 2-7 dagen na vaccinatie en gebruik van een UV-licht om te zien van EGFP expressie in de buurt van de injectieplaats.
Opmerking: Visuele inspectie onder een UV-licht is een eenvoudig en niet-invasieve operatie die geschikt is voor de routinematige controle op succesvolle vaccinaties, ook in grootschalige experimenten. Als geen beelden van de vis vereist zijn, kan deze stap ook in de reguliere vissentanks zonder de noodzaak om anesthetize of verplaatsen van de vis worden uitgevoerd. - Gebruiken om te fotograferen, een fluorescentie Microscoop te visualiseren EGFP uitdrukking bij de injectie plaats8. Gebruik van een 2 X-objectief en selecteer het juiste filter te visualiseren fluorescentie of zichtbaar licht weergaven.
- Houd de narcose vis nog steeds door te drukken op de ventrale fin voorzichtig met een pincet naar de onderkant van een petrischaal. Neem zowel licht-Microscoop en fluorescentie beelden van hetzelfde gebied.
- Het samenvoegen van de beelden van het licht-Microscoop en fluorescentie met behulp van de juiste software-29. Het toevoegen van een schaal-bar.
7. kwantificering van de expressie niveau en de grootte van de antigenen
- De vis in 0,04% tricaïne euthanaseren. Het ontleden van het fluorescerende deel van de dorsale spieren met een scalpel en pincet onder UV-licht. Haal de eiwitten uit de monsters8.
- Controleer of de juiste grootte van in-vivo-geproduceerde eiwitten met een westelijke vlekkenanalyse, met behulp van een horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd GFP antilichaam (of soortgelijke)8. Omvatten een negatieve controle (unimmunized vis) om elke achtergrond signalen en aspecifieke bindende, samen met een besturingselement uiting van EGFP te sluiten zonder een gesmolten antigeen.
Opmerking: Voor de westelijke vlekkenanalyse, de verwachte grootte (in kDa) van de antigeen-fusion eiwitten kan worden berekend, bijvoorbeeld door de vergelijking:
Molecuulgewicht (MW) van dsDNA = (aantal nucleotiden x 607.4) + 157.9; of met behulp van web-gebaseerde tools. - Kwantificeren van de expressie van elk antigeen met behulp van een GFP-ELISA8 (optioneel).
8. het combineren van de vaccinatie Protocol met een M. marinum infectie Model
- Bepalen van de grootte van de groep vereist voor de betrouwbare bepaling van de effectiviteit van een roman vaccin kandidaat in het model van de infectie en de kwantitatieve analyse gebruikt (zie, bijvoorbeeld, Myllymaki et al.. 24 en Charan en Kantharia30). De juiste macht berekeningen uitvoeren terwijl het planning van de experimenten.
- Om te beoordelen van de effectiviteit van het vaccin kandidaten, infecteren de vis 5 weken postimmunization. Gebruik een intraperitoneaal infectie met ongeveer 30 kolonie-vormende eenheden (kve) van M. marinum, die leidt tot een latente infectie in de meeste8,20,31 vissen.
Opmerking: Wanneer u M. marinum, gaat u als volgt een BSL2 veiligheid protocol. De voorbereiding van de bacterie of virus is afhankelijk van het pathogene agens oplevert. - Het aantal ziekteverwekkers in elke vis te kwantificeren. Euthanaseren van de vis 4 weken postinfection en de bacteriële belasting in elke vis uit het geëxtraheerde DNA bepalen met behulp van primers specifiek voor M. marinum20,24qPCR.
Opmerking: Zorg dat een passende controlegroep omvatten en gebruik de juiste statistische methoden voor het analyseren van de resultaten. In het algemeen, een groep van vis geïmmuniseerd met de lege pCMV-EGFP plasmide is een geschikt negatieve controle. - Bevestiging van positieve resultaten met antigenen zonder het GFP-tag. Clone de antigenen zoals beschreven in stap 1 en herhaalt u de vaccinatie-experiment.
Representative Results
De stappen die betrokken zijn bij het protocol van de vaccinatie van DNA van volwassen zebrafish worden geïllustreerd in Figuur 3. Op het eerste, de geselecteerde antigeen-sequenties zijn gekloond in een plasmide pCMV-EGFP en plasmide DNA wordt geproduceerd en gezuiverd24 (Figuur 3). Vaccin kandidaten worden vervolgens intramuscularly met een microinjector geïnjecteerd en de injectieplaats is electroporated om de inname van de plasmide in cellen (Figuur 3). De gebruikte vaccinatie dosis is geoptimaliseerd door het injecteren van verschillende hoeveelheden van de pCMV-EGFP plasmide en het meten van het GFP-expressie met ELISA (aanvullende Figuur 1). Twee tot zeven dagen postvaccination, de uitdrukking van de fusieproteïne gedetecteerd onder UV-licht en gevisualiseerd met fluorescentie microscopie (Figuur 3 en Figuur 4). De niveaus van de expressie van verschillende antigenen kunnen variëren van zeer intensieve (antigeen 1) tot een zwakke uitdrukking (Figuur 4). Daarnaast GFP expressie in de dorsale spieren (antigeen 1), of in een beperkter gebied (antigeen 2) kan worden waargenomen (Figuur 4). Als geen fluorescentie wordt gedetecteerd binnen 10 dagen, is het echter raadzaam om ervoor te zorgen dat er geen fouten in antigeen klonen of primer ontwerp zijn. Om te bevestigen dat de geuite fusieproteïne van het juiste formaat is, kunnen eiwitten worden geëxtraheerd uit het spierweefsel rondom het injectiegebied en gebruikt voor een westelijke vlekkenanalyse.
Het effect van het vaccin kandidaten wordt geëvalueerd door uitdagende van de vis met een lage dosis van M. marinum door een intraperitoneale injectie (Figuur 5). Vier tot vijf weken postinfection, de bacteriële graven zijn vastbesloten met qPCR en vergeleken met bacteriële belasting in de controlegroep (Figuur 5). Bovendien, de doeltreffendheid van de meest veelbelovende kandidaten van het vaccin kan worden getest door het toezicht op de overleving na een hoge dosis M. marinum infectie()Figuur 5). Echter, naast het geven van een kwantitatieve resultaat op de progressie van de infectie, in plaats van slechts een status van levend of dood, de kwantificering van de qPCR gebaseerde cfu vereist minder tijd en kleinere groep maten en is, dus een ethisch meer verantwoorde benadering voor een primaire scherm. Globaal, is dit protocol vergemakkelijkt de screening van de doeltreffendheid van nieuwe vaccin-antigenen binnen 12 weken (Figuur 5).
Figuur 1: Close-up (12 X) van aluminosilicaat naalden gebruikt in de volwassen zebrafish intra musculaire injecties. De onderstaande tip heeft verlaagd met een pincet en is klaar om te worden gebruikt voor microinjections. Dit cijfer is aangepast Oksanen €35zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Microinjection apparatuur en set-up. De belangrijkste onderdelen van de apparatuur die nodig is voor de vaccinatie van DNA van volwassen zebrafish worden gemarkeerd in vet. De kritische aanpassingen worden aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: opstellen van het DNA-vaccin plasmiden en de procedure immunisatie. (1) geselecteerde antigenen zijn gekloond grenzend aan de GLP-tag in de pCMV-EGFP plasmide. (2) het vaccin construct is geproduceerd microbiologisch, geconcentreerd en gezuiverd. (3) 12 µg plasmide wordt geïnjecteerd in de dorsale spieren van een narcose volwassen zebrafish met een microinjector, en de injectieplaats is vervolgens electroporated met zes 40-V, 50-ms pulsen. (4) twee tot zeven dagen postvaccination, de GFP uitdrukking van de antigeen-GFP fusieproteïne is gevisualiseerd met een fluorescentie Microscoop. (5) de TL deel van de dorsale spieren kan worden ontleed en worden gebruikt voor eiwit extractie. De grootte van de fusieproteïne is bevestigd met een westelijke vlekkenanalyse en het niveau van de expressie met GFP-ELISA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: visualiseren van de uitdrukking van de antigeen-EGFP fusieproteïne. Narcose volwassen zebrafish zijn ingeënt met 12 µg experimenteel vaccin-antigenen (antigeen 1 – 3) en de injectieplaats is electroporated, vervolgens met zes 40 V, 50 ms pulsen. Twee tot zeven dagen postvaccination, de injectieplaats is beeld met een microscoop. Ten eerste wordt de expressie van GFP ontdekt onder een fluorescentie Microscoop. Het gebied wordt gecontroleerd met behulp van een 2 X omvang doelstelling en image gemaakt en opgeslagen in TIFF vorm. Het licht microscope beeld van hetzelfde gebied wordt samengevoegd met de fluorescentie-beeld met behulp van de ImageJ software. De hoeveelheid en de positie van de antigeen-expressie kunnen variëren tussen antigenen en afzonderlijke vissen. Bijvoorbeeld, de uitdrukking van antigeen 1 wordt waargenomen in de dorsale spieren en de uitdrukking van antigeen 2 wordt gezien als kleine vlekken, overwegende dat antigeen 3 komt sterk tot uiting in een beperkter gebied. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: testen van de effectiviteit van het vaccin kandidaten tegen een mycobacteriële infecties. (1) volwassene zebrafish zijn ingeënt met experimentele DNA-vaccins tegen mycobacteriosis. (2) vijf weken postvaccination, de vissen zijn besmet met een lage dosis van Mycobacterium marinum (~ 30 cfu). (3) vier weken later, de interne organen worden ontleed en gebruikt voor DNA-extractie. (4) de kiemen in elke vis wordt gekwantificeerd met qPCR met behulp van M. marinum-specifieke primers. Immunisatie met antigeen 1 geleid tot een aanzienlijke daling in de bacteriële graven (p < 0,01, two-way ANOVA), terwijl de antigenen 2 en 3 had geen effect. (5) het beschermende effect van de meest veelbelovende kandidaat vaccin (antigeen 1) wordt verder geëvalueerd in een experiment van de overleving, waar vis zijn besmet met een hoge dosis (~ 10.000 kve) bacteriën en hun voortbestaan wordt gecontroleerd gedurende 12 weken. Consistent met de afname van de bacteriële last waargenomen in panel 4, vaccinatie met antigeen 1 ook verbeterd het voortbestaan van de vis na een infectie M. marinum (p < 0.01), suggereert dit antigeen zou een veelbelovende kandidaat voor een nieuw vaccin tegen tuberculose. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: hoeveelheid plasmide DNA beïnvloedt de expressie van EGFP plasmide-afgeleide in volwassen zebrafish. Groepen van vis (n = 5 in elke groep) werden ingespoten met pCMV-EGFP, 0,5 – 20 μg en electroporation (zes pulsen van 50 V) werd gebruikt voor het verbeteren van de transfectie. Vis van de Control (CTRL) werden ingespoten met 2 μg van de plasmide van de lege pCMV niet met het gen EGFP. GFP-ELISA werd uitgevoerd 3 dagen postinjection om te bepalen van de relatieve expressie van EGFP in vis homogenates. P-waarden: *p < 0.03, **p < 0.004. De foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. NS = niet significant. Dit cijfer is aangepast Oksanen €35zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De procedure voor het immuniseren van volwassen zebrafish met DNA-gebaseerde vaccins moet enkele technische expertise. Zelfs voor een ervaren onderzoeker neemt vaccinatie van een enkele vis ongeveer 3 min, met uitzondering van preparaten. Zo kan een maximum van ongeveer 100 vissen worden geïmmuniseerd binnen een dag. Als meer dan 100 vissen vereist voor het experiment zijn, kunnen de inentingen worden verdeeld tot 3 dagen. Naast de kwaliteit van het experiment is voldoende opleiding van de onderzoeker (s) voor behandeling van de vis en het uitvoeren van de immunisatie essentieel voor het welzijn van de vissen. Zorg ervoor dat lokale juridische en dierenwelzijn regels en richtlijnen volgen als het gaat om de huisvesting van de vissen, van plan de experimenten, en de kwalificaties die vereist zijn voor het personeel tot de proeven.
Kortom zijn er verschillende kritische stappen om complicaties in het protocol van immunisatie te vermijden. Voor de succesvolle immunisatie, zorgt ervoor dat 1) de vis te worden geïmmuniseerd zijn gezond en voldoende in leeftijd en grootte (de immunisatie van meer jonge vis kan vereisen down-schalen de vaccin-volume en de electroporation-instellingen); 2) de vis zijn goed verdoofd met nee sterker dan 0,02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester, en ze blijven gedurende de hele procedure narcose (verdoving moeten zo kort mogelijk het herstel van de vis te waarborgen); 3) de spons pad is goed doorweekt; 4) vloeistof wordt geïnjecteerd in elke puls van de Pneumatische pomp en, zo niet, de impulslengte is aangepast (trekken van de naald iets naar achteren langs de y-as kan helpen); 5) er zijn geen luchtbellen met de oplossing van het vaccin; 6) de electroporation-instellingen en de werkelijke puls spanning en lengte kloppen; 7) de elektroden veroorzaken geen schade van de huid op de site van electroporation (tijdens de electroporation, houd de elektroden in zacht contact met de vis, en laat de vis onmiddellijk in de tank herstel na electroporation).
Het is belangrijk te volgen van de vis na de electroporation in de tank herstel en te euthanaseren geen vis tekenen van ongemak. Bovendien is het noodzakelijk om de praktijk van de procedure voordat u begint een grootschalige experiment, om te zorgen voor een vloeiend workflow. Indien mogelijk, een onvoldoende opgeleide collega te vragen voor hulp bij het invullen van de naalden en de electroporation.
De methode van de DNA-vaccinatie kunt de op maat gemaakte ontwerp van vaccin-antigenen. Het is mogelijk om clone de hele antigeen of, bij voorkeur, het selecteren van delen van het antigeen op basis van cellulaire lokalisatie en immunogeniciteit24. Bovendien is de methode kan verschillende antigenen of hulpstoffen samenvoegen met één vaccin construct of injecteren van verscheidene afzonderlijke plasmiden op de dezelfde tijd2. Door met inbegrip van een stop codon na de antigeen-reeks of door het EGFP-gen van de plasmide middendoor, is het mogelijk om gebruik te maken van de dezelfde plasmide vector ook om uit te drukken van het antigeen zonder de volgende N-terminale GFP-tag. Het is mogelijk dat dit redelijk bij de bevestiging van de resultaten van positieve screening, als de relatief grote omvang van GFP kan van invloed zijn op de vouwen van het antigeen en, dus, humorale reacties potentieel opgeroepen door de vaccinatie beperken.
Een hogere antigeen-expressie is gekoppeld aan DNA-vaccin immunogeniciteit2. Electroporation na injectie, dus, is opgenomen in dit protocol, zoals het is aangetoond dat de expressie van de antigenen en reporter genen van verviervoudiging verhogen tot vertienvoudigd in zebrafish32. Bovendien, electroporation als een techniek zorgt ervoor dat matige weefsel schade, dus inducerende lokale ontsteking die verder de vaccin-geïnduceerde immuunreacties2 bevordert. Aan de andere kant, is electroporation over het algemeen goed verdragen. Met de hier gebruikte apparatuur, zal vrijwel 100% van de volwassen zebrafish herstellen goed van de zes pulsen van 40 V gebruikt in dit protocol35.
Naast electroporation ter verbetering van de vermelding van de plasmide vaccin in de cellen, gebruiken we een sterke alomtegenwoordige promotor in het vaccin plasmide en een staart polyA eind 3' van het antigeen te verbeteren van antigeen expressie in de cellen transfected vis. In sommige gevallen, indien het codon gebruik van de ziekteverwekker doel aanzienlijk van de gevaccineerde soorten verschilt, is codon optimalisatie gevonden nuttig in het verder verhogen van doel gene expression2. In dit zebrafish -M. marinum model, echter codon optimalisatie hadden geen significant effect op de niveaus van de expressie van twee mycobacteriële model genen, ESAT-6 en GVB-10, en is, dus in dit model35 onnodig geacht .
Gen expressie zoekprofielen hebben sommige temporele variatie tussen de antigenen, afhankelijk van, bijvoorbeeld, de grootte en de structuur van de antigenen in kwestie. Antigeen expressie is echter meestal soortgelijke binnen een groep vis geïmmuniseerd met het zelfde vaccin. Typisch, de helderste expressie van EGFP vier dagen aan één week postvaccination wordt waargenomen, maar een schaal van 2-10 dagen is mogelijk. Het is aanbevolen om het valideren van de expressie van elk antigeen-EGFP fusieproteïne in een kleine groep van vis (2-3) voordat het antigeen in een grootschalig experiment. Indien geen GFP-expressie wordt waargenomen op elk gewenst moment 2-10 dagen na immunisatie, zorg ervoor dat 1) het protocol immunisatie werd zorgvuldig gevolgd. Altijd een groep vis geïmmuniseerd met de lege pCMV-EGFP plasmide als positieve controle hebt en zorg ervoor dat 2) de antigeen-ontwerp en het moleculaire klonen correct werd uitgevoerd (voldoende primer ontwerp; het antigeen en de EGFP tag zijn beide in hetzelfde leesraam en geen tussenliggende stop codonen zijn inbegrepen). In sommige gevallen, ondanks de juiste antigeen ontwerp, kan niet GFP worden gedetecteerd. Dit kan worden veroorzaakt door de onjuiste vouwen of snelle verdeling van de fusie-eiwit. In deze omstandigheden kan het nodig om herontwerp van het antigeen zijn.
In vaccins die worden gebruikt voor het immuniseren van gekweekte vis, is de dosis van de plasmide gebruikt meestal 1 µg of minder7,33,34. In zebrafish, kan verslaggever genexpressie ook worden gedetecteerd na minstens een 0,5 µg plasmide injectie na electroporation; echter, de relatieve doel genexpressie aanzienlijk verhoogt met een hoger bedrag van plasmide per vis (aanvullende figuur 1). In vis ingespoten met de pCMV-EGFP verslaggever plasmide, een injectie met 5 – 20 µg van plasmide geresulteerd in vier tot acht keer hoger EGFP niveaus ten opzichte van de vissen met 0,5 µg geïnjecteerd. Daarom, om te zorgen voor een hoog genoeg doel genexpressie, maar hebben injectie volumes die zijn klein genoeg (≤7 µL) ter voorkoming van weefselschade van de overtollige of vaccin lekkage, kozen we voor 5 tot 12 µg per vis voor doeleinden te gebruiken de oriënterende. Naast vaccin immunogeniciteit, een hoog genoeg doel genexpressie is nodig voor de detectie van verslaggever genexpressie met een fluorescentie Microscoop en westelijke vlek, die noodzakelijk is voor doeleinden te bevestigen de juiste in vivo screening vertaling van het target-antigeen. Echter lager plasmide doses (0,5 – 1 µg) nuttig kan zijn voor andere soorten experimentele toepassingen.
Kortom, kan dit protocol voor de immunisatie van volwassen zebrafish met een DNA plasmide worden gebruikt bij het preklinische testen van kandidaten van de roman vaccin tegen verschillende bacteriële of virale infecties. De uitdrukking van het vaccin antigeen als een GFP-fusieproteïne staat de visualisatie van een succesvolle immunisatie gebeurtenis en antigeen-expressie. Wij hanteren deze methode voor de preklinische screening van roman vaccin antigeen kandidaten tegen tuberculose. Hiervoor, we infecteren de zebravis vijf weken postvaccination en bepalen dat de bacteriële telt in elke vis met qPCR20,24.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar aan de leden van de onderzoeksgroep experimentele immunologie, en met name aan Leena Mäkinen en Hannaleena Piippo, voor al het werk dat zij hebben verricht in het ontwikkelen en optimaliseren van het vaccinatie protocol en hun hulp in werkelijke experimenten met behulp van het protocol.
Dit werk werd gesteund door Jane ja ihmissusi Erkon Säätiö (Jane en ihmissusi Erkko Foundation; naar M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Stichting; M.R.), de concurrerende staat onderzoeksfinanciering van het gebied van de deskundige verantwoordelijkheid van Tampere University Ziekenhuis (naar M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tuberculose Foundation; M.R., H.M., en M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Finse Cultural Foundation; H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (Fins tegen tuberculose Stichting; aan H.M.), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö en Laina Kivi Foundation; aan M.N.) en de Tampere stad Science Foundation (M.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
References
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
- Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
- Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
- Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
- Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).
- Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
- Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
- Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
- Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
- Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
- Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
- Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).
- Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
- Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
- Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
- Matthews, M., Varga, Z. M.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H.
- McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
- Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
- Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).
