Summary
Qui descriviamo un protocollo per l'immunizzazione del adulto zebrafish (Danio rerio) con un vaccino basato su DNA e dimostrare la convalida di un evento di successo vaccinazione. Questo metodo è adatto per lo screening preclinico di candidati vaccinali in vari modelli di infezione.
Abstract
L'interesse nella vaccinazione basati sul DNA è aumentato durante le due decadi scorse. Vaccinazione del DNA si basa sulla clonazione di una sequenza di un selezionata antigene o una combinazione di antigeni in un plasmide, che consente un design su misura e sicuro. La somministrazione di vaccini a DNA nelle cellule ospiti conduce all'espressione degli antigeni che stimolano la risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata. Questo rapporto descrive un protocollo per la clonazione delle sequenze di antigene nel plasmide pCMV-EGFP, l'immunizzazione di zebrafish adulto con vaccini candidati di microiniezione intramuscolare e l'elettroporazione successivo per migliorare l'assunzione. Gli antigeni del vaccino sono espresso come proteina fluorescente verde (GFP)-proteine di fusione, che permette la conferma dell'espressione dell'antigene sotto UV luce da pesci vivi e la quantificazione dei livelli di espressione della proteina di fusione con ELISA, anche come loro rilevazione con un'analisi di western blot. L'effetto protettivo dei candidati vaccino viene testato da infettare il pesce con Mycobacterium marinum postvaccinazione cinque settimane, seguita dalla quantificazione dei batteri con qPCR quattro settimane più tardi. Rispetto ai modelli di screening preclinici mammiferi, questo metodo fornisce un metodo conveniente per lo screening preliminare dei candidati vaccinali basati sul DNA romanzo contro un'infezione micobatterica. Il metodo possa essere applicato a screening basati sul DNA vaccini contro varie malattie batteriche e virali.
Introduction
I primi studi per vaccino a DNA sono stati effettuati in 1990s1, e da allora, i vaccini del DNA sono stati testati contro varie malattie infettive, cancro, dell'autoimmunità e Allergia2. Nei mammiferi, un vaccino a DNA contro il virus della West Nile nei cavalli e un vaccino terapeutico del cancro per melanoma orale canino sono stati concessi, ma queste non sono attualmente in uso clinico2. Oltre all'interesse evocata dagli studi dei mammiferi, la vaccinazione del DNA ha rivelato per essere un modo conveniente per immunizzare i pesci d'allevamento contro le malattie virali. Un vaccino contro il virus di pesce alla necrosi ematopoietica infettiva (IHNV) è stato in uso commerciale dal 2005, e un vaccino contro il virus della necrosi pancreatica infettiva (IPNV) è stato recentemente autorizzato3. Inoltre, diversi vaccini a DNA contro gli agenti patogeni pesci stanno sviluppandi.
Come vaccini tradizionali spesso contengono agenti patogeni attenuati dal vivo o inattivati, essi rappresentano un rischio potenziale di trasmettere la malattia2. Vaccini a DNA, a sua volta, scongiurare questo rischio, in quanto si basano sulla somministrazione di plasmide che codifica gli antigeni batterici o virali, piuttosto che l'agente patogeno tutta sé2,4. Vaccini a DNA sono prodotte con tecniche di ricombinazione del DNA, che permette il disegno preciso dei vaccini e la formulazione flessibile delle combinazioni di antigene e adiuvanti in un singolo vaccino costrutto5. Inoltre, la produzione di vaccini a DNA è più veloce, più facile e più efficiente di quella di vaccini ricombinanti base di proteine, che è un grande vantaggio per il candidato vaccino ai fini dello screening, ma anche, per esempio, nel caso di focolai di pandemie 2.
Nei pesci, le più comuni vie di somministrazione di vaccini a DNA sono intraperitoneale, intramuscolare e orale3,6,7, mentre nei mammiferi, sottocutanea e intradermiche rotte sono opzioni aggiuntive2. Dopo un'iniezione intramuscolare, i plasmidi di DNA amministrati entrano nelle cellule al luogo di amministrazione (ad es., per lo più miociti, ma anche cellule presentanti l'antigene residenti [APC]). La proporzione di cellule transfected può essere significativamente aumentata di elettroporazione2,8. Dopo aver inserito la cella, alcuni DNA plasmidico entra nel nucleo, dove i geni codificati dal plasmide sono trascritti2. In questo protocollo, utilizziamo il plasmide pCMV-EGFP che ha un forte promotore onnipresente ottimizzato per9di espressione eucariotico. In questo costrutto, gli antigeni sono tradotte come una proteina di fusione con un GFP. La GFP consente la conferma di una vaccinazione di successo e il prodotto corretto antigene mediante la semplice visualizzazione dell'espressione dell'antigene con un microscopio a fluorescenza in pesci vivi.
Nei mammiferi, i vaccini del DNA hanno dimostrati di stimolare diversi tipi di risposte immunitarie a seconda i tipi di cellulari trasfettate2,5. Miociti trasfettate secernono antigeni nello spazio extracellulare o rilasciarli alla morte delle cellule e gli antigeni inghiottiti dalle APC sono, successivamente, ha presentati su istocompatibilità complex II molecole2. Questo genera risposte delle cellule CD4 e CD8 T, in particolare, oltre a cellule B risposte2,5,10. Nei pesci, linfociti T e B, così come le cellule dendritiche (DCs), sono state identificate, ma loro divisione del lavoro nella presentazione dell'antigene è meno ben compreso11. DCs di zebrafish, tuttavia, hanno dimostrato di condividere conservate caratteristiche fenotipiche e funzionali con i loro omologhi dei mammiferi12. Inoltre, la vaccinazione del DNA ha dimostrata di suscitare le risposte immunitarie simili nei pesci e nei mammiferi, compreso le cellule T e B risposte6,13,14,15,16 .
Zebrafish adulti e larve sono ampiamente utilizzati per diverse malattie infettive modello, ad esempio il modello di infezione pesce M. marinum della tubercolosi utilizzato in questo protocollo17,18,19,20 ,21,22. In confronto con organismi di modello dei mammiferi, i vantaggi di zebrafish includono le loro piccole dimensioni, veloce riproducibilità e bassa ospita le spese23. Questi aspetti rendono il pesce zebra modello animale ideale per gli studi di indagine preclinica su vasta scala per i nuovi vaccini e composti farmaceutici23,24,25.
In questo protocollo, descriviamo come romanzo dell'antigene del vaccino candidati contro mycobacteriosis possono essere valutati dalla vaccinazione basati sul DNA di zebrafish adulto. In primo luogo, descriviamo come antigeni sono clonati nel plasmide pCMV-EGFP espressione, seguito da un protocollo dettagliato per l'iniezione intramuscolare di plasmidi di vaccino e l'elettroporazione successiva nel muscolo. L'espressione di ogni antigene è confermata da postimmunization una settimana microscopia di fluorescenza. L'efficacia dei candidati dell'antigene è quindi provata sperimentalmente infettando pesce vaccinati con M. marinum.
Protocol
Esperimenti tra cui zebrafish adulto richiedono un'autorizzazione per la sperimentazione animale per la vaccinazione e gli studi successivi con il modello di infezione. Tutti i metodi e gli esperimenti descritti qui sono approvati da animale esperimento Board della Finlandia (ESAVI) e gli studi sono effettuati in conformità con la direttiva 2010/63/UE.
1. clonazione dei vaccini DNA
- Selezionare un plasmide di espressione ottimizzato per l'espressione eucariotico del o gli antigeni di interesse sotto un promotore forte, costitutivo, come ad esempio il promotore in anticipo immediato del citomegalovirus (CMV). Per attivare la verifica in vivo dell'espressione dell'antigene, selezionare un plasmide di vaccino che codifica un tag fluorescente, come ad esempio il plasmide pCMV-EGFP9 utilizzata nel presente protocollo.
- Utilizzare adeguati strumenti basati sul web e bioinformatica per selezionare una sequenza di antigene potenzialmente immune-protettive (o diverse sequenze) di circa 90 – 600 nt (30 – 200 aa)26 da geni-di-interesse dell'agente patogeno che verrà utilizzato nella modello di infezione successiva.
- Utilizzare un software disponibile, o manualmente disegnare primers per amplificare i geni di antigene dal genoma dell'agente patogeno e clonare le sequenze di antigene nel sito multiplo-clonazione del plasmide di espressione. Assicurarsi di conservare la struttura di lettura corretta quando si seleziona l'antigene.
- Includono sia una sequenza (CCACC) di Kozak27 e un codone di inizio (ATG) nel primer 5'. Per conservare l'etichetta del C-terminale EGFP, evitare successivi codoni di stop (TAG, TAA, TGA) nella sequenza di antigene e il primer 3'. Inoltre, assicurarsi che l'etichetta GFP rimane nello stesso frame di lettura con l'antigene di interesse.
- Utilizzare RNA o DNA Estratto da agente patogeno come un modello per generare una quantità adeguata di prodotto di PCR con primers clonazione. Preferibilmente, utilizzare una correzione di bozze DNA polimerasi per mantenere la sequenza corretta dell'antigene.
- Purificare il prodotto PCR e controllare la dimensione corretta del prodotto mediante elettroforesi in gel. Digerire e legare il prodotto di PCR con il plasmide digerito vaccino.
- Trasformare il mix di legatura in cellule batteriche competenti secondo un protocollo adatto. Utilizzare una selezione antibiotica appropriata per colonie positive e produzione del plasmide in e. coli; il plasmide pCMV-EGFP, ad esempio, contiene un gene di resistenza all'ampicillina per questo.
- Utilizzare Sanger sequenziamento per confermare l'inserimento della sequenza corretta dell'antigene. I seguenti primer può essere utilizzato per gli antigeni di sequenziamento nel plasmide pCMV-EGFP: CMV in avanti 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 'e invertire EGFP-N 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'.
- Produrre e purificare una quantità sufficiente del costrutto di vaccino. Sciogliere o eluire il plasmide in acqua sterile. Assicurarsi che il DNA del plasmide prodotta è di alta qualità e la concentrazione è almeno 0.72 µM o 2.000 ng / µ l.
2. gli aghi di Microinjection di trazione
- Preparare in anticipo gli aghi di microinjection. Utilizzare tubi capillari in vetro alluminosilicato di 10 cm. Si noti che i tubi capillari in vetro borosilicato sono troppo fragili per l'iniezione di pesci adulti.
- Tirare gli aghi con un dispositivo di fabbricazione di aghi micropipetta.
Nota: Gli aghi dovrebbero essere simili a quello presentato nella Figura 1. Con il dispositivo utilizzato in questo protocollo (Tabella materiali), le seguenti impostazioni di causare il tipo desiderato di aghi:- Impostare il vetro capillare nella V-scanalatura nella barra di estrattore e serrare leggermente la manopola di bloccaggio.
- Spostare la staffa di supporto accanto il filamento e spingere delicatamente il capillare attraverso il filamento nella barra dell'estrattore sul lato opposto del filamento. Evitare di toccare il filamento con il capillare.
- Serrare le manopole di serraggio, impostare giù il vetro di sicurezza e premere il tasto di tiro.
Attenzione: Il filamento è caldo.
- Posizionare gli aghi su un pezzo di adesivo riutilizzabile all'interno di una piastra di Petri 15 cm per proteggere le punte dell'ago. Tenere il piatto coperto per pulire gli aghi.
3. gli aghi micropipetta di riempimento
- Preparare la miscela di vaccino. Utilizzare 0,5 – 12 µ g del plasmide per ogni somministrazione. Se la combinazione di diversi plasmidi differenti nel mix di una vaccinazione, utilizzare una concentrazione di DNA totale massima di 12 µ g al pesce.
- Calcolare il volume del vaccino "master mix" in base al numero di pesci in ogni gruppo (Vedi sotto). Aggiungere 1 µ l di sterile filtrata rosso fenolo per ogni dose di iniezione per facilitare sia il riempimento degli aghi capillari e l'osservazione dell'iniezione. Aggiungere 1 sterile x PBS fino a un volume totale massimo di 5 – 7 µ l in una sola iniezione dose8.
Nota: Iniezione volumi superiori a 7 µ l possono causare la perdita occasionale della soluzione iniezione e devono, pertanto, essere evitati. - Posizionare un pezzo di nastro adesivo, colla verso l'alto, su un supporto adeguato, ad esempio, il lato di una casella di punta vuota. Collegare delicatamente gli aghi capillari al nastro.
- Pipettare un massimo di 7 µ l della miscela vaccino su un pezzo di parafilm. Utilizzando una punta di caricamento, trasferire il vaccino del film nell'ago. Pipettare lentamente e con attenzione, evitare di pipettaggio bolle d'aria nell'ago.
- Lasciare gli aghi a stabilirsi per 15-30 min rimuovere possibili rimanenti piccole bolle d'aria.
4. impostazione del Microinjector ed Electroporator per l'immunizzazione
- Impostare il micromanipolatore e una sorgente di luce nella giusta posizione. Passare la presa di pressione di aria nella posizione aperta.
- Regolare i parametri per il pneumatico pompa (Vedi anche Figura 2) come segue.
- Impostare la manopola di sfiato sulla porta di espulsione per tenere per prevenire reinterro della pipetta per azione capillare. Impostare la tubazione dal porto Espelli la micropipetta. Non utilizzare la porta di vuoto in questo protocollo.
- Regolare la lunghezza di impulso: utilizzare la modalità temporizzata, dove un timer elettronico controlla la durata del tempo il solenoide pressione rimane aperto. Verificare che la spia verde accanto al manometro di pressione di espulsione si accende quando il solenoide di pressione è aprire (eccitato).
- Impostare l' impulso gamma a 10 s; con questa impostazione, gli impulsi possono essere ulteriormente impostati da 100 ms a 10,1 s. uso il periodo 10-Disabilita comporre per la regolazione fine della lunghezza di impulso — ogni turno del quadrante è 1.0 s. Se necessario, questo può anche essere regolato durante l'iniezione.
- Utilizzare l'iniziatore di impulso (pulsante "start") sul pannello frontale della pompa pneumatica, o un remoto interruttore a pedale la (scelta consigliata). Questo è collegato al pannello frontale della pompa pneumatica.
- Impostare l'ago sul supporto micropipetta del micromanipolatore. Tagliare la punta dell'ago con le pinzette, in modo che liquido può essere spinto fuori e utilizzare il microscopio per visualizzare la posizione corretta. Premere l'interruttore a pedale una volta per vedere che un impulso di 1-s spinge una piccola gocciolina fuori l'ago.
- Utilizzare le seguenti impostazioni per il electroporator: tensione = 40 V; durata d'impulso 50 ms, il numero di impulsi di = = 6. Collegare le pinzette per il electroporator. Vedere che la tensione effettiva e la lunghezza di impulso mostrato sul monitor non differiscono in modo significativo dalle impostazioni.
5. iniezione del vaccino a DNA ed elettroporazione
- Per le immunizzazioni secondo questo protocollo, uso sano, 6 a 12 mesi di zebrafish adulto. Tenere i pesci in un sistema di scorrimento con un ciclo luce/buio 14/10 h, con un massimo di sette pesci per 1 L d'acqua.
- Preparare una soluzione di estere (tricaina) di etilico dell'acido 3-aminobenzoic 0,02% (pH 7) nel serbatoio di acqua per anestetizzare il pesce28. Utilizzare una piastra Petri 10cm o qualcosa di simile.
- Preparare un serbatoio di recupero compilando un becher da 5 L con 3 L di acqua potabile.
- Preparare una vaccinazione imbottitura per tenere i pesci in una posizione fissa durante la vaccinazione. Prendete un pezzo di2 cm 5 x 7 di un 2 a 3 cm di spessore spugna. Tagliare una scanalatura in spugna con un bisturi o forbici affilate.
Nota: L'imbottitura di vaccinazione stessa utilizzabile in esperimenti multipli. Disinfettare la spugna tra gli esperimenti immergendolo in alcool etilico al 70% e lasciare per asciugare. - Mettere a bagno la spugna in acqua dell'impianto ed impostare la spugna su una piastra Petri accuratamente.
- Veloce il pesce 24 h prima le vaccinazioni.
- Anestetizzare una zebrafish inserendolo in una piastra Petri contenente 0,02% tricaina. Attendere fino a quando il pesce non risponde al tocco di stimolazione e finché non ci sarà nessun movimento delle branchie. Anestetizzare un singolo pesce alla volta.
- Utilizzando un cucchiaio di plastica, trasferire il zebrafish anestetizzati sulla spugna bagnata e fissato sul lato ventrale del pesce nella scanalatura. Nella posizione corretta, assicurarsi che la testa e la maggior parte del corpo del pesce sono dentro la gola e la pinna dorsale e la coda sono sporgenti fuori dalla scanalatura.
- Sotto il microscopio, posizionare l'ago in un angolo di circa 45° vicino al muscolo dorsale di zebrafish, utilizzando l'asse x e y fine-tuning ruote sul micromanipolatore.
- Trovare la piccola macchia senza scale davanti alla pinna dorsale, dove si spinge l'ago non richiede forza. Se si avverte resistenza, provare un posto adiacente. Evitare di ferire la spina dorsale, la pinna dorsale o le scale.
Nota: Se l'ago si piega mentre si spinge, accorciare l'ago leggermente tagliandolo. - Utilizzare l'interruttore a pedale gradualmente iniettare la soluzione di vaccino nel muscolo. L'iniezione di osservare attraverso il microscopio: rosso fenolo è visibile come entra nel tessuto muscolare. Se necessario, regolare la durata dell'impulso.
Nota: In alternativa, utilizzare il pulsante di iniziatore di impulso sul pannello frontale della pompa pneumatica per l'iniezione. Tuttavia, l'uso di un interruttore a pedale remoto consente con l'altra mano per regolare la lunghezza di impulso dalla ruota 10 giri dial. Evitare di iniettare la soluzione troppo in fretta, poiché ciò potrebbe danneggiare il tessuto in eccesso. Assicurarsi di non iniettare qualsiasi aria. - Electroporate il pesce subito dopo l'iniezione. Assicurarsi che il pesce è ancora sotto anestesia. Tenere il pesce sulla spugna e impostare il pesce tra elettrodi pinzette-tipo, in modo che gli elettrodi si trovano su ciascun lato del sito di iniezione. Non premere troppo stretto le pinzette di elettrodo, ma mantenere entrambi gli elettrodi a contatto con il pesce.
- Premere il pulsante start su electroporator a dare sei 40 V, impulsi di 50 ms.
- Trasferire delicatamente il pesce per il serbatoio di recupero.
- Pulire gli elettrodi dopo ogni elettroporazione swiping loro con etanolo al 70%.
Nota: Controllare con attenzione il benessere dei pesci dopo la vaccinazione. Eutanasia qualsiasi pesci che presentano segni di disagio (una lenta ripresa dall'anestesia, aberrante nuoto, ansimante) in tricaina 0,04%. Dopo il recupero, trasferire il pesce all'unità di flusso continuo e alimentarlo normalmente.
6. visualizzazione e Imaging dell'espressione dell'antigene
- Anestetizzare il pesce in 0.02% tricaina 2 – 7 giorni dopo l'immunizzazione e utilizzare una luce UV per vedere l'espressione di EGFP vicino al sito di iniezione.
Nota: Controllo visivo sotto una luce UV è un'operazione semplice e non invasivo che è adatta per la verifica sistematica delle vaccinazioni di successo, anche negli esperimenti su larga scala. Se nessuna immagine del pesce sono necessaria, questo passaggio può essere eseguito anche in vasche di pesci regolare senza la necessità di anestetizzare o spostare il pesce. - Per acquisire immagini, utilizzare un microscopio a fluorescenza per visualizzare espressione di EGFP presso il sito di iniezione8. Utilizzare un obiettivo obiettivo 2x e selezionare il filtro corretto per visualizzare la vista di luce visibile o fluorescenza.
- Tenere i pesci anestetizzati ancora premendo la pinna ventrale delicatamente con le pinzette verso un fondo di Petri. Prendere le immagini di fluorescenza e luce-microscopio della stessa area.
- Unire le immagini di fluorescenza e luce-microscopio utilizzando il software appropriato29. Aggiungere una barra di scala.
7. quantificazione del livello di espressione e la dimensione degli antigeni
- Eutanasia il pesce in tricaina 0,04%. Sezionare la parte fluorescente del muscolo dorsale con un bisturi e pinzette sotto luce UV. Estratto di proteine dai campioni8.
- Verificare la corretta dimensione di in vivo-prodotto proteine con un'analisi di western blot, utilizzando una perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo coniugato GFP (o simili)8. Includere un controllo negativo (non immunizzati pesce) per escludere eventuali segnali di fondo e l'associazione aspecifiche, insieme a un controllo che esprimono EGFP senza un antigene fuso.
Nota: Per l'analisi di western blot, la dimensione prevista (in kDa) l'antigene-delle proteine di fusione può essere calcolata, ad esempio, dall'equazione:
Peso molecolare (MW) di dsDNA = (numero di nucleotidi x 607.4) + 157,9; o utilizzando strumenti web-based. - Quantificare l'espressione di ogni antigene utilizzando un GFP-ELISA8 (opzionale).
8. la combinazione del protocollo di vaccinazione con un modello di infezione M. marinum
- Determinare la dimensione di gruppo necessaria per la determinazione affidabile dell'efficacia del candidato vaccino romanzo il modello di infezione e il dosaggio utilizzato (Vedi, ad esempio, Myllymaki et al. 24 e Charan e Kantharia30). Eseguire i calcoli di alimentazione appropriata durante la pianificazione degli esperimenti.
- Per valutare l'efficacia dei vaccini candidati, infettare il postimmunization di 5 settimane di pesce. Utilizzare un'infezione intraperitoneale con circa 30 unità formanti colonie (cfu) di M. marinum, che conduce ad un'infezione latente nella maggior parte di pesce8,20,31.
Nota: Quando si utilizza M. marinum, seguire un protocollo di sicurezza BSL2. La preparazione del batterio o virus dipende l'agente patogeno. - Quantificare il numero di agenti patogeni in ogni pesce. Eutanasia di un postinfection di 4 settimane di pesce e determinare la carica batterica in ogni pesce dal DNA estratto con qPCR usando gli iniettori specifici per M. marinum20,24.
Nota: Assicurarsi di includere un gruppo di controllo appropriato e utilizzare i corretti metodi statistici per analizzare i risultati. In generale, un gruppo di pesci immunizzati con il plasmide pCMV-EGFP vuota è un idoneo controllo negativo. - Confermare i risultati positivi con gli antigeni senza il tag GFP. Clonare gli antigeni come descritto nel passaggio 1 e ripetere l'esperimento di vaccinazione.
Representative Results
Nella Figura 3sono illustrati i passaggi necessari per il protocollo di vaccinazione del DNA di zebrafish adulto. In un primo momento, le sequenze di antigene selezionato vengono clonate in un plasmide pCMV-EGFP e il DNA del plasmide è prodotto e purificato24 (Figura 3). Vaccini candidati sono quindi iniettati per via intramuscolare con un microinjector e il sito di iniezione è individulamente per migliorare l'assunzione del plasmide nelle cellule (Figura 3). La dose di vaccinazione usato è stata ottimizzata iniettando diverse quantità del plasmide pCMV-EGFP e misurare l'espressione di GFP con ELISA (integrativa Figura 1). Due a postvaccinazione di sette giorni, l'espressione della proteina di fusione viene rilevato sotto luce UV e visualizzati con microscopia di fluorescenza (Figura 3 e Figura 4). I livelli di espressione di antigeni differenti possono variare da molto ad alta intensità (antigene 1) per un'espressione debole (Figura 4). Inoltre, espressione di GFP può essere osservato attraverso il muscolo dorsale (antigene 1), o in un'area più limitata (antigene 2) (Figura 4). Tuttavia, se nessuna fluorescenza viene rilevata entro 10 giorni, è consigliabile assicurarsi che non vi siano senza errori nel design di clonazione o primer di antigene. Per confermare che la proteina di fusione espressa sia di dimensioni corrette, proteine possono essere Estratto da tessuto muscolare intorno al sito di iniezione e utilizzate per un'analisi di western blot.
L'effetto dei vaccini candidati viene valutata mettendo in discussione il pesce con una dose bassa di M. marinum tramite un'iniezione intraperitoneale (Figura 5). Un postinfection di quattro o cinque settimane, la conta batterica è determinata con qPCR e rispetto ai carichi batterici nel gruppo di controllo (Figura 5). Inoltre, l'efficacia dei più promettenti candidati vaccino può essere testata monitorando la sopravvivenza dopo una dose elevata di infezione di marinum del M. (nella figura 5). Tuttavia, oltre a dare un risultato quantitativo sulla progressione dell'infezione, invece di semplicemente uno stato di vivo o morto, la quantificazione di cfu basato su qPCR richiede meno tempo e più piccole dimensioni del gruppo ed è, pertanto, un approccio più etico per un primario schermo. Nel complesso, questo protocollo facilita la proiezione dell'efficacia dei nuovi vaccini entro 12 settimane (Figura 5).
Figura 1: Primo piano (12 volte) di alluminosilicato aghi utilizzati nelle iniezioni intra-muscolare di zebrafish adulto. Il suggerimento riportato di seguito è stato tagliato con una pinzetta ed è pronto per essere utilizzato per microiniezioni. Questa figura è stata adattata da Oksanen35. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: strumentazione di Microinjection e set-up. I componenti principali dell'apparecchiatura necessaria per la vaccinazione del DNA di zebrafish adulto sono evidenziati in grassetto. Le regolazioni critiche sono indicate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: preparare i plasmidi di DNA vaccino e la procedura di immunizzazione. (1), selezionate gli antigeni vengono clonati adiacente al tag di GFP nel plasmide pCMV-EGFP. Costrutto (2), il vaccino è prodotto microbiologicamente, concentrato e purificato. (3) 12 µ g del plasmide è iniettato nel muscolo dorsale di un zebrafish adulto anestetizzati con un microinjector, e il sito di iniezione è successivamente elettroporate con sei impulsi di 40-V, 50-ms. Postvaccinazione (4) due a sette giorni, l'espressione di GFP della proteina di fusione GFP-antigene è visualizzato con un microscopio a fluorescenza. (5), il fluorescente parte del muscolo dorsale può essere sezionato e utilizzato per l'estrazione proteica. Le dimensioni della proteina di fusione sono confermata con un'analisi di western blot e il livello di espressione con GFP-ELISA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: visualizzare l'espressione della proteina di fusione antigene-EGFP. Zebrafish adulto anestetizzati sono vaccinati con 12 µ g di antigeni del vaccino sperimentale (antigene 1 – 3) e il sito di iniezione è elettroporate, successivamente, con sei 40 V, impulsi di 50 ms. Due a postvaccinazione di sette giorni, il sito di iniezione è imaged con un microscopio. In primo luogo, l'espressione della GFP è rilevato sotto un microscopio a fluorescenza. L'area è ispezionato utilizzando un obiettivo di grandezza X 2 e imaged e salvata in formato TIFF. L'immagine del microscopio chiaro della stessa area è fusa con l'immagine di fluorescenza usando il software ImageJ. La quantità e la posizione dell'espressione dell'antigene possono variare tra antigeni e singoli pesci. Ad esempio, l'espressione dell'antigene 1 è osservata lungo il muscolo dorsale e l'espressione dell'antigene 2 è visto come piccole macchie, mentre antigene 3 è fortemente espresso in un'area più limitata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: verificare l'efficacia di vaccini contro un'infezione micobatterica. (1) adulto zebrafish sono vaccinati con vaccini a DNA sperimentali contro micobatteriosi. Postvaccinazione di cinque settimane (2), i pesci sono infettati con una dose bassa di Mycobacterium marinum (~ 30 cfu). (3), quattro settimane più successivamente, l'interne organi sono sezionati e utilizzati per l'estrazione del DNA. (4), la conta batterica in ogni pesce è quantificato con qPCR utilizzando M. marinum-primer specifici. Immunizzazione con antigene 1 ha condotto ad una diminuzione significativa nei conteggi batterici (p < 0.01, ANOVA a due vie), mentre gli antigeni 2 e 3 non ha avuto effetto. (5), il protettivo effetto del candidato vaccino più promettente (antigene 1) viene ulteriormente valutata in un esperimento di sopravvivenza, dove pesci sono infettati con una dose elevata (~ 10.000 cfu) dei batteri e la loro sopravvivenza è monitorata per 12 settimane. Coerenti con la diminuzione della carica batterica osservata nel pannello 4, vaccinazione con l'antigene 1 anche migliorato la sopravvivenza dei pesci su un'infezione di M. marinum (p < 0,01), suggerendo questo antigene potrebbe essere un promettente candidato per un nuovo vaccino contro la tubercolosi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1: quantità di DNA plasmidico influisce sulla espressione di EGFP plasmide-derivato in zebrafish adulto. Gruppi di pesci (n = 5 in ogni gruppo) sono stati iniettati con 0,5 – 20 μg di pCMV-EGFP, ed elettroporazione (sei impulsi di 50 V) è stato utilizzato per migliorare la transfezione. Pesci di controllo (CTRL) sono stati iniettati con μg 2 del plasmide pCMV vuota non contenenti il gene EGFP. GFP-ELISA è stata effettuata 3 giorni postinjection per definire l'espressione di EGFP relativa in omogeneati del pesce. Valori di P: *p < 0,03, * *p < 0,004. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard. NS = non significativo. Questa figura è stata adattata da Oksanen35. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
La procedura di immunizzare zebrafish adulto con vaccini basati sul DNA richiede alcune competenze tecniche. Anche per un ricercatore esperto, vaccinare un singolo pesce prende circa 3 min., escluse le preparazioni. Così, un massimo di circa 100 pesci possa essere immunizzato entro un giorno. Se più di 100 pesci sono necessari per l'esperimento, le vaccinazioni possono essere diviso tra fino a 3 giorni. Oltre alla qualità dell'esperimento, sufficiente formazione di ricercatori per gestire il pesce ed eseguendo l'immunizzazione è essenziale per il benessere dei pesci. Assicurarsi di seguire le linee guida e regole locali legali e di benessere animale, quando si tratta di alloggiamento il pesce, pianificazione degli esperimenti e le qualifiche richieste per il personale che effettua gli esperimenti.
In sintesi, ci sono diversi passaggi critici per evitare complicazioni nel protocollo di immunizzazione. Per l'immunizzazione di successo, assicurarsi che 1) i pesci saranno immunizzati sono sana e sufficiente in età e le dimensioni (l'immunizzazione dei pesci più giovani possa richiedere la scalatura verso il basso il volume di vaccino e le impostazioni di elettroporazione); 2) il pesce sono adeguatamente anestetizzato con no più forte di 0,02% 3-aminobenzoic estere etilico dell'acido, e rimangono anestetizzati durante tutta la procedura (anestesia dovrebbe essere tenuto più corto possibile garantire il recupero del pesce); 3) il tampone di spugna è correttamente intrisa; 4) liquido viene iniettato in ogni impulso dalla pompa pneumatica e, se non, la lunghezza di impulso è regolata (tirando l'ago leggermente all'indietro lungo l'asse y può aiutare); 5) bolle d'aria con la soluzione di vaccino; 6) le impostazioni di elettroporazione e la tensione di impulso effettivo e la lunghezza sono corrette; 7) gli elettrodi non causano danni alla pelle nel sito di elettroporazione (durante l'elettroporazione, tenere gli elettrodi in dolce contatto con il pesce e rilasciare il pesce immediatamente nel serbatoio di recupero dopo l'elettroporazione).
È importante monitorare il pesce dopo l'elettroporazione nel serbatoio di recupero e di eutanasia qualsiasi pesci che presentano segni di disagio. Inoltre, è necessario praticare la procedura prima di iniziare un esperimento su larga scala, per garantire un flusso di lavoro correntemente. Se possibile, chiedere a un collega sufficientemente addestrato per assistenza con riempimento gli aghi e l'elettroporazione.
Il metodo di vaccinazione del DNA consente la progettazione su misura di antigeni vaccinali. È possibile clonare l'intero antigene o, preferibilmente, selezionare parti dell'antigene basato su cellulare localizzazione e immunogenicità24. Inoltre, il metodo consente la combinazione di diversi antigeni o coadiuvanti nella costruzione di un vaccino o iniettando diversi plasmidi separati al tempo stesso2. Includendo un codone di arresto dopo la sequenza di antigene o asportando il gene EGFP dal plasmide, è possibile utilizzare lo stesso vettore plasmidico anche per esprimere l'antigene senza il cartellino del N-terminale GFP successivo. Questo può essere ragionevole nel confermare i risultati di screening positivo, come le dimensioni relativamente grandi di GFP possono influenzare la piegatura dell'antigene e, quindi, limitare le risposte umorali potenzialmente evocate dalla vaccinazione.
Un' più alta espressione dell'antigene è stata collegata al DNA vaccino immunogenicità2. Elettroporazione dopo l'iniezione è, quindi, stato incluso in questo protocollo, come è stato dimostrato per aumentare l'espressione di antigeni o di geni reporter da quattro volte a dieci volte in zebrafish32. Inoltre, elettroporazione come tecnica provoca lesione moderata del tessuto, così inducendo l'infiammazione locale che promuove ulteriormente la risposta immunitaria indotta da vaccino2. D'altra parte, l'elettroporazione è generalmente ben tollerato. Con l'attrezzatura utilizzata qui, praticamente 100% di zebrafish adulto recupererà bene dagli sei impulsi di 40 V usato in questo protocollo35.
Oltre a utilizzare l'elettroporazione per migliorare la voce del plasmide vaccino nelle cellule, usiamo un forte promotore onnipresente nel plasmide di vaccino e una coda di polyA all'estremità 3' dell'antigene per migliorare l'espressione dell'antigene nelle cellule trasfettate pesce. In alcuni casi, se l'uso di codone del patogeno bersaglio differisce da significativamente dalla specie vaccinati, ottimizzazione di codone è stato trovato utile per aumentare ulteriormente la destinazione gene expression2. In questo modello zebrafish -M. marinum tuttavia, codone ottimizzazione ha avuto alcun effetto significativo sui livelli di espressione di due geni micobatterici modello, ESAT-6 e CFP-10 e ha, quindi, stati ritenuti inutili in questo modello35 .
Profili di espressione genica di destinazione hanno qualche variazione temporale tra gli antigeni, a seconda, ad esempio, la dimensione e la struttura degli antigeni in questione. Tuttavia, l'espressione dell'antigene è solitamente simile all'interno di un gruppo di pesci immunizzati con il vaccino stesso. In genere, il più brillante espressione di EGFP è osservato quattro giorni per una settimana postvaccinazione, ma è possibile una scala di 2 – 10 giorni. Si consiglia di convalidare l'espressione della proteina di fusione ogni antigene-EGFP in un piccolo gruppo di pesci (2 – 3) prima di includere l'antigene in un esperimento su larga scala. Se nessuna espressione di GFP è osservata in qualsiasi punto 2 – 10 giorni dopo l'immunizzazione, assicurarsi che 1) il protocollo di immunizzazione è stato seguito con attenzione. Sempre avere un gruppo di pesci immunizzati con il plasmide pCMV-EGFP vuota come controllo positivo e assicurarsi che 2) la progettazione di antigene e clonazione molecolare è stata effettuata correttamente (disegno primer adeguato; l'antigene e il tag EGFP sono entrambi nella stessa struttura di lettura e nessun intervento codoni di stop sono inclusi). In alcuni casi, nonostante la progettazione corretta dell'antigene, GFP non può essere rilevato. Questo può essere dovuto la piegatura errata o la rapida degradazione della proteina di fusione. In queste circostanze, può essere necessario riprogettare l'antigene.
Nei vaccini che sono usati per immunizzare i pesci d'allevamento, la dose di plasmide utilizzata è in genere 1 µ g o meno di33,7,34. In zebrafish, espressione del gene reporter può anche essere rilevato dopo almeno un iniezione di 0,5 µ g plasmide seguendo elettroporazione; Tuttavia, la relativa espressione genica aumenta significativamente con una maggiore quantità di plasmide per pesce (complementare figura 1). In pesci iniettati con il plasmide del reporter EGFP pCMV, un'iniezione con 5 – 20 µ g di plasmide ha provocato quattro a otto volte superiore EGFP livelli rispetto ai pesci iniettati con 0,5 µ g. Di conseguenza, per garantire un'espressione genica abbastanza alto, ma hanno volumi di iniezione che sono abbastanza piccolo (≤ 7 µ l) per evitare qualsiasi danno di tessuto in eccesso o dispersione di vaccino, abbiamo scelto di utilizzare 5 a 12 µ g / pesce per le finalità di screening preliminare. Oltre immunogenicità del vaccino, un alto abbastanza espressione genica è necessaria per rilevare l'espressione del gene reporter con un microscopio a fluorescenza e con western blot, che è necessario ai fini di confermare il corretto in vivo dello screening traduzione dell'antigene bersaglio. Tuttavia, dosi inferiori plasmide (0,5 – 1 µ g) può essere utile per altri tipi di utilizzi sperimentali.
In conclusione, questo protocollo per l'immunizzazione di zebrafish adulto con un plasmide DNA utilizzabile nella sperimentazione preclinica di nuovi vaccini candidati contro varie infezioni batteriche o virali. L'espressione dell'antigene del vaccino come proteina di fusione GFP permette la visualizzazione di un'espressione di evento e l'antigene di successo immunizzazione. Applichiamo questo metodo per lo screening preclinico di candidati di antigene romanzo vaccino contro la tubercolosi. Per questo, abbiamo infettare il postvaccinazione di cinque settimane di zebrafish e determinare che i contenuti batterici in ogni pesce con qPCR20,24.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati ai membri del gruppo di ricerca immunologia sperimentale, e soprattutto di Leena Mäkinen e Hannaleena Piippo, per tutto il lavoro che hanno fatto a sviluppare e ottimizzare il protocollo di vaccinazione e il loro aiuto in esperimenti reali utilizzando il protocollo.
Questo lavoro è stato supportato da Jane ja AATO Erkon Säätiö (Jane e Aatos Erkko Foundation; a M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Foundation; per M.R.), il finanziamento ricerca competitivo statale della zona esperto responsabilità dell'Università di Tampere Ospedale (a M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tubercolosi Foundation; per M.R., H.M. e M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Fondazione culturale finlandese; per H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finlandese anti-tubercolosi Fondazione; a S.M.), ja Väinö Laina Kiven säätiö (Väinö e Laina Kivi Foundation; a M.N.) e la città di Tampere Science Foundation (di M.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
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