Summary
ICP0 subisce la traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Non è noto il meccanismo molecolare di questo evento. Qui descriviamo l'uso del microscopio confocale come uno strumento per quantificare ICP0 movimento nell'infezione di HSV-1, che getta le basi per analizzare quantitativamente ICP0 traslocazione in futuri studi meccanicistici.
Abstract
Cellula infettata proteine 0 (ICP0) del virus herpes simplex 1 (HSV-1) sono una proteina di inizio immediata contenente un'anello-tipo E3 ubiquitina ligasi. È responsabile della degradazione proteasomica di fattori restrittivi ospite e l'attivazione successiva gene virale. ICP0 contiene una sequenza canonica localizzazione nucleare (NLS). Entra nel nucleo immediatamente dopo la sintesi de novo ed esegue le sue funzioni di difesa anti-ospite principalmente nel nucleo. Tuttavia, più tardi nell'infezione, ICP0 si trova esclusivamente nel citoplasma, suggerendo la presenza di una traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Presumibilmente ICP0 traslocazione consente ICP0 di modulare le sue funzioni secondo sue sedi subcellulari alle fasi di infezione diversa. Al fine di delineare la funzione biologica e il meccanismo di regolazione della traslocazione nucleare--citoplasmico ICP0, abbiamo modificato un metodo di microscopia immunofluorescente per monitorare il traffico di ICP0 durante l'infezione HSV-1. Questo protocollo coinvolge macchiatura immunofluorescente, microscopio confocale imaging e nucleare vs citoplasmico analisi di distribuzione. L'obiettivo del presente protocollo è quello di adattare le immagini confocal di stato stazionario prese a un corso di tempo in una documentazione quantitativa del movimento ICP0 in tutta l'infezione litica. Proponiamo che questo metodo può essere generalizzato per analizzare quantitativamente nucleare vs localizzazione citoplasmatica di altre proteine virali o cellulare senza coinvolgere la tecnologia di imaging dal vivo.
Introduction
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) provoca una vasta gamma di lievi a gravi malattie erpetiche compreso herpes labiale, herpes genitale, cheratite stromal ed encefalite. Una volta infettato, il virus stabilisce un'infezione latente permanente in neuroni dei gangli. In alcuni casi, il virus può essere riattivato da vari motivi quali febbre, stress e soppressione immune1, conducente all'infezione di herpes ricorrente. Proteina della cellula infettata 0 (ICP0) è un regolatore chiave di virale cruciale per l'infezione HSV-1 sia litica e latente. Esso transattiva a valle virus geni tramite contrastando l'host difese antivirale intrinseca/innate2,3. ICP0 è un'attività della ligasi di ubiquitin E3, che si rivolge ai diversi fattori di cella per degradazione proteasoma-dipendente3. Esso interagisce anche con varie vie di cella per regolare le loro attività e successivamente per compensare host antivirale restrizioni3. ICP0 è noto per individuare in diversi compartimenti subcellulari come procede l'infezione3,4,5. La proteina ha un segnale di arginina/lisina-ricco di localizzazione nucleare (NLS) situato a residui 500 a 5066. Al momento di sintesi de novo a inizio infezione da HSV-1, ICP0 viene immediatamente importato nel nucleo. In primo luogo viene rilevato in una dinamica nucleare struttura definito dominio nucleare 10 (ND10)7. L'attività di ligasi di ubiquitin E3 di ICP0 innesca la degradazione delle proteine organizzatore ND10, proteina promyelocytic di leucemia (PML) e proteina maculato 100 kDa (Sp100)8,9,10. Dopo la perdita di proteine organizzatore, ND10 corpi nucleari sono dispersi e ICP0 è diffusa per riempire l'intero nucleo4,11.
È interessante notare che, dopo l'inizio della replicazione del DNA virale, ICP0 scompare dal nucleo. Si trova esclusivamente nel citoplasma, suggerendo la presenza di una traslocazione nucleare--citoplasmico tardi in HSV-1 infezione4,12. Il requisito della replica del DNA implica la partecipazione potenziale di una proteina virale tardivo nel facilitare la traslocazione citoplasmica di HSV-1 ICP04,12. Apparentemente ICP0 traffico tra diversi comparti durante infezione autorizza ICP0 per modulare le interazioni di varie vie cellulari in modo spaziale e temporale, e quindi coordinare le sue multiple funzioni alla fine tune l'equilibrio tra litiche e latente HSV-1 infezione13. Per capire meglio ICP0 multifunzionalità e il coordinamento di ICP0 domini funzionali durante l'infezione litica, abbiamo dissecato accuratamente la base molecolare della dinamica ICP0 traslocazione12. Per condurre gli studi meccanicistici precedentemente segnalati12, abbiamo applicato un metodo di macchiatura immunofluorescente per visualizzare la localizzazione sottocellulare ICP0 presso lo stato di infezione diversa sotto il microscopio confocale. Abbiamo anche sviluppato un protocollo quantitativo per analizzare il nucleare vs citoplasmico distribuzione di ICP0 utilizzando il software confocale. La popolazione delle cellule di infezione da HSV-1 è stata tabulata in tutte le fasi di infezione e sono state analizzate le tendenze del movimento ICP0, sotto diversi trattamenti biochimici12. Qui descriviamo il protocollo dettagliato quello spostamento di documenti ICP0 nell'infezione di HSV-1. Proponiamo che questo metodo può essere adottato come metodo generale per studiare la traslocazione nucleare vs citoplasmatica per altre proteine virali o cellulare, che può servire come alternativa al live imaging quando la tecnica di imaging dal vivo è inapplicabile a causa problemi quali etichettatura metodo, intensità del segnale o abbondanza di proteine.
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Protocol
1. cellula semina e infezione da Virus
- A 20 – 24 h prima dell'infezione del virus, seme 5 x 104 di fibroblasti di polmone embrionale umano (HEL) o altre cellule per essere esaminato in una diapositiva di 4 pozzetti 11 mm sfalsati in crescita medio (di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% fetale bovino siero (FBS)). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2).
Nota: Ogni bene dovrebbe avere confluency di 70-80% delle cellule al momento dell'infezione. - Il giorno successivo, è necessario rimuovere il mezzo di crescita e infettare le cellule con virus in Medium-199 in una gamma di 4 – 10 pfu/cella. Incubare le cellule infettate da virus per 1h a 37 ° C. Tenere scuotendo la diapositiva durante il periodo di incubazione.
- Dopo l'incubazione di 1h, rimuovere Medium-199 e integrare con il mezzo di crescita.
Nota: Farmaci che interferiscono con le fasi di infezione diversa possono aggiungersi a questo punto o prima dell'assorbimento virale. - Incubare le cellule infettate da virus a 37 ° C con 5% CO2 per varie lunghezze di periodo di infezione.
2. fissazione e permeabilizzazione
- In fase di infezione corretto rapidamente lavare le cellule infettate con tampone fosfato salino (PBS) 3 volte e aggiungere 200 μL di paraformaldeide 4% appena preparato in PBS. Incubare le cellule con paraformaldeide per 8 – 10 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule in ciascun pozzetto.
- Paraformaldeide di aspirare e lavare i pozzetti con 200 μL di PBS per 3 volte. Aspirare completamente PBS dopo il lavaggio 3rd .
- Aggiungere 100 μL di tensioattivo non ionico 0,2% in ogni pozzetto per permeabilize le cellule per 5 – 10 min.
- Il tensioattivo non ionico di aspirare e lavare i pozzetti con 200 μL di PBS per 3 volte.
3. immunofluorescenza colorazione
- Completamente aspirare PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante (1% albumina di siero bovino (BSA) e 5% di siero equino in PBS) in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 h o a 4 ° C durante la notte.
- Aggiungere determinato sperimentalmente concentrazione di anticorpo primario (anticorpo policlonale di coniglio anti-ICP012) in tampone bloccante e incubare anticorpo primario a temperatura ambiente per 2 h o a 4 ° C durante la notte.
- Lavare con tampone bloccante 3 volte con un'incubazione di 10 min. Aggiungere anticorpo secondario coniugato 594 Alexa Capra anti-coniglio (1: 400 diluito in tampone bloccante) e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h. Quindi lavare i vetrini 3 volte con tampone bloccante a intervalli di 10 min.
- Infine lavare il vetrino una volta con PBS per rimuovere residuo BSA e siero equino.
- Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio antifade con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per montare il vetrino e sigillarlo con il vetrino coprioggetti utilizzando smalto trasparente.
4. confocale Imaging
- Con un microscopio confocale, impostare la lunghezza d'onda a 590 – 650 nm per Alexa 594 e 410 – 520 nm per DAPI. Selezionare il formato di immagine a 1024 x 1024 e linea media di 8 di acquisire immagini ad alta risoluzione.
- Analizzare ogni pozzetto sulla diapositiva 4 pozzetti sotto il microscopio confocale. Acquisire immagini rappresentative delle cellule sotto l'obiettivo 100x, come mostrato in Figura 1 e Figura 2.
- Contando il numero elevato di celle, scattare fotografie di campi consecutivi sotto l'obiettivo 40x.
Nota: Richiede 5-10 immagini ad accumulare oltre 200 cellule infettate da ogni punto di tempo di ogni infezione. - In ogni esperimento, scattare foto con parametri costanti confocale per tutti i campioni devono essere confrontati.
5. analisi nucleare vs distribuzione citoplasmica
- Progetto aperto con il software applicativo confocale. Selezionare un'immagine da cui le cellule hanno bisogno per essere tabulati per nucleare vs distribuzione citoplasmica di ICP0.
- Fare clic sulla scheda "Quantità" dal menu in alto e selezionare "Ordina ROIs" dal menu strumenti.
- Disegnare una linea longitudinale attraverso la cella per essere analizzati selezionando "Disegnare la linea" dal menu in alto.
Nota: Istogramma apparirà mostrando l'intensità di fluorescenza lungo la linea per ICP0 e DAPI. Nell'istogramma, la linea blu rappresenta i pixel che DAPI e segna il confine del nucleo, mentre la linea rossa rappresenta ICP0 pixel. -
Basato su una colorazione di fondo, impostare una soglia costante per intensità di ICP0 analizzare ICP0 distribuzione subcellulare in ogni esperimento.
- Come esemplificato nella Figura 2, se il rosso segnale in media è sotto la soglia della regione nucleare ma è sopra la soglia oltre il contorno blu, classificare il segnale rosso principalmente si trova nel citoplasma.
- Se il segnale rosso è sopra la soglia in tutto il nucleo e oltre il limite del segnale blu, gruppo il segnale rosso come nucleo più localizzazione citoplasmatica.
- Se il segnale rosso è di sopra della soglia nel nucleo, ma in media è di sotto di essa all'esterno del contorno del segnale blu, gruppo il segnale rosso come localizzazione nucleare.
- Catalogare più di 200 cellule infettate da ciascun campione in fase di infezione diversa e trama di un grafico a barre per illustrare ICP0 movimento secondo tempo (Figura 3).
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Representative Results
Per comprendere le basi molecolari e le funzioni biologiche della ICP0 tratta durante l'infezione HSV-1, utilizziamo un metodo di microscopia immunofluorescente per analizzare la distribuzione subcellulare ICP0 alle fasi di infezione diversa. La figura 1 Mostra le cellule rappresentante con distintivo ICP0 localizzazione come il progredire dell'infezione. Per quantificare la traslocazione nucleare--citoplasmico di ICP0, analizziamo ICP0 distribuzione rispetto al nucleo di categorizzare le cellule infettate in tre gruppi: localizzazione nucleare, localizzazione citoplasmatica e localizzazione nucleare e citoplasmatica ( Figura 2). Per comprendere gli elementi necessari per il traffico di ICP0 durante l'infezione, teniamo traccia ICP0 movimenti in wild-type o mutanti HSV-1 alle fasi di infezione diversa. Figura 3 Mostra un esempio dei risultati di tabulazione per distribuzione subcellulare di ICP0 al punto di tempo differenti dell'infezione.
Figura 1: traffico dinamico di ICP0 durante l'infezione HSV-1. Cellule dei HEL coltivate su vetrini da 4 pozzetti sono state infettate con HSV-1 (ceppo F) come prototipo al 10 pfu/cella. A 1, 5 e 9 h post infezione (hpi), le cellule erano fissi, permeabilizzate e ha reagite di coniglio anti-ICP0 e mouse anti-PML gli anticorpi primari e quindi reagite a Alexa 594-coniugato anti-coniglio e per gli anticorpi secondari Alexa 488-cojugated anti-topo sotto 100 obiettivi X di imaging. Proteina promyelocytic di leucemia (PML) serve come una proteina marker per ND10 corpi nucleari, che scomparirà a hpi 5 e 9 a causa di degrado di PML in infezione. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi della distribuzione subcellulare ICP0. Pannello di sinistra: con un microscopio confocale, cellule rappresentative furono ampliate per mostrare la linea longitudinale tracciata attraverso la cella che definisce l'area di interesse (ROI). Pannello di destra: intensità di fluorescenza pixel in ROI sono stati quantificati per ICP0 e DAPI in singole celle e illustrati come istogrammi dal software applicativo confocale. Una soglia arbitraria (linea verde) era impostata in modo da riflettere la colorazione di fondo. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: percentuale della distribuzione subcellulare di selvaggio-tipo e C-terminale troncato ICP0. Cellule dei HEL sono state infettate da virus ricombinante contenente ICP0 wild type (WT ICP0) o C-terminale troncato ICP0 (ICP0 C-troncamento) 4 pfu/cella. Intervalli di tempo indicati, le cellule erano macchiate e analizzate come descritto sopra. Oltre 200 cellule sono state tabulate per posizione di ICP0. Percentuale di celle contenenti nucleari, citoplasmatici o nucleare + citoplasmatico ICP0 sono state tracciate con un software di calcolo del foglio di calcolo. Si tratta di un esemplare esperimento per mostrare che utilizzando questo metodo, abbiamo identificato ICP0 C-terminale un dominio richiesto per traslocazione nucleare--citoplasmico ICP0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è stato usato per studiare la traslocazione nucleare--citoplasmico di HSV-1 ICP0. ICP0 subisce subcellulare traffico durante l'infezione di HSV-1 (Figura 1). Probabilmente, ICP0 interagisce con varie vie di cellule per svolgere funzioni diverse in luoghi diversi. In questo modo ICP0 a mettere a punto le sue multiple funzioni nel braccio di ferro con ospite umano13. Tuttavia, come ICP0 coordina le funzioni multiple in modo spaziale e temporale non è stato ben studiato. Con il protocollo di microscopia fluorescente sopra descritto, abbiamo iniziato ad analizzare le basi molecolari della traslocazione nucleare--citoplasmico ICP0. A partire da ora, abbiamo identificato il C-terminale di ICP0 35 aminoacidi come un elemento obbligatorio importante per questo spostamento. In assenza di C-terminale, ICP0 è trattenuto all'interno del nucleo durante l'infezione (Figura 3). Abbiamo anche trovato questo che uno spostamento di ritardi il nucleare--citoplasmico di ICP0 E3 ligasi-dipendente nucleare ritenzione forza in U2OS cellule12. Inoltre, abbiamo scoperto che ICP0 C-terminale e l'espressione delle proteine virali tarda cooperare per superare la ritenzione nucleare e facilitare la traslocazione citoplasmatica12. Attualmente, stiamo usando questo protocollo alla schermata per il tarda proteine virali coinvolte nella traslocazione nucleare--citoplasmico ICP0.
Il protocollo è stato inizialmente sviluppato per studiare la dinamica tratta di ICP0 nell'infezione di HSV-1. Come illustrato nella Figura 1, presto nell'infezione di HSV-1, ICP0 è colocalized con ND10, dove diversi componenti chiave di fattori cellulari restrittive e ND10 componenti come PML e Sp1008, sono degradati. Dopo degradanti costituenti chiave ND10, ICP0 si diffonde in tutto il nucleo e ritardo nell'infezione, ICP0 è traslocata nel citoplasma. Perché ICP0 subisce la sintesi de novo dopo l'infezione, l'abbondanza di proteina iniziale è molto basso e quindi una sintesi virale robusta nasconderanno rapidamente il movimento delle eventuali singole molecole, che rende difficile tenere traccia utilizzando una singola molecola tecnologia di imaging dal vivo. Pertanto, abbiamo scelto deliberatamente di non utilizzare immagini dal vivo. Invece, abbiamo adottato il protocollo di cui sopra per studiare la localizzazione di stato stazionario ICP0 a punti di infezione diversa, che ci ha servito bene nel tracciamento del movimento temporale ICP0 in una popolazione delle cellule di infezione da HSV-1.
Per un elevato rapporto segnale--fondo in analisi confocale, due passaggi critici sono degni di nota nella parte bagnato-banco del presente protocollo. In primo luogo, i 4-pozzetti vetrini sfalsati consentono più campioni vengano maneggiati su una singola diapositiva. Si risparmia notevolmente l'utilizzo di preziosi reagenti come virus e anticorpi. Tuttavia, poiché il volume tenuto in ciascun pozzetto è così piccolo, tampone residua non completamente eliminato durante i cambi di buffer può interferire con il reagente successivo. Pertanto, in ogni switch tampone, un'accurata aspirazione è necessario prima di aggiungere il nuovo buffer. In secondo luogo, in base alle nostre esperienze, la misura della permeabilità di reticolazione e la membrana delle cellule è importante per la chiarezza dei segnali di fluorescenza. Abbiamo impostato un numero empirico di 10 min per paraformaldeide e trattamenti di tensioattivo non ionico. Abbiamo trovato quel tempo molto più lungo o più breve del 10 min può diminuire il rapporto di segnale--fondo. Come mostrato in Figura 1 e Figura 2, così come in un precedente studio12, le immagini ottenute nei nostri esperimenti sono cristalline. Il segnale blu prominente che delinea chiaramente il contorno nucleare è chiave per determinare la distribuzione sottocellulare di ICP0. Nella parte computazionale del presente protocollo, un passo fondamentale è quello di impostare una soglia costante per eliminare lo sfondo. Un successo la macchiatura con alto rapporto di segnale--fondo è la chiave per una linea più bassa soglia e contrasto migliore segnale. Tenendo una soglia costante per tutti i campioni lo stesso esperimento, tuttavia, è il fondamento per la documentazione quantitativa di ICP0 (Figura 2 e Figura 3).
Il protocollo può anche servire come uno strumento generale per studiare subcellulare di traffico per altre proteine virali o cellulare quando manca un adeguato metodo di imaging dal vivo. Nella tecnica di imaging dal vivo, le cellule rimangono in ambiente fisiologico ottimo per mantenere la cella condizione metabolica14,15. Un requisito di base per l'imaging di tensione delle cellule è fluorescente etichettare la proteina dell'obiettivo, che può essere realizzata fondendo la proteina dell'obiettivo con un tag fluorescente16, o per fornire un fluoroforo coniugato molecola specifici per la proteina dell'obiettivo17 . In entrambi i casi, i problemi potrebbero aumentare se la fusione del tag fluorescente cambia proprietà della proteina target o molecola coniugata fluoroforo ha difficoltà ad attraversare la membrana cellulare. Photobleaching che provoca il danno delle cellule nel processo è un'ulteriore preoccupazione in vivo imaging18. Di conseguenza, nuove strategie per superare il limite dell'imaging live continuano ad essere la frontiera dello sviluppo tecnologico. Il protocollo che abbiamo descritto qui fornisce analisi temporale delle immagini confocal allo stato stazionario, che può servire come uno strumento alternativo quando un corretto metodo di imaging dal vivo non è disponibile. Il metodo è semplice e affidabile. Fornisce rilevamento chiaro di localizzazione sottocellulare della proteina con sfondo minimo. Utilizzando software confocale, siamo in grado di analizzare la percentuale di cellule con diverse distribuzioni della proteina dell'obiettivo in una popolazione delle cellule quantitativamente e di documentare il movimento della proteina bersaglio alle fasi differenti delle cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il sostegno finanziario da una sovvenzione di NIH (RO1AI118992) assegnata a Haidong Gu. Ringraziamo la struttura microscopia, Imaging & Core Cytometry risorse (MICR) presso la Wayne State University per il supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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