Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 通过在睾丸中注入 inulin-fitc 来评估血液睾丸屏障的完整性。这是一种有效的体内方法, 研究血液睾丸屏障完整性, 可由遗传和环境元素损害。
Abstract
精子发生是精原体在睾丸生精小管中发育为成熟精子的过程。这一过程得到了血美屏障 (Sertoli) 塞尔托利细胞连接点的支持, Sertoli 是哺乳动物体内最严密的组织屏障, 并将精原细胞上皮分离成两个隔间, 一个是基部和一个阴囊。btb 为减数分裂 i变 i变 i变的生殖细胞创造了一个独特的微环境, 并通过精子发生将减数分裂后的精子体发育为精子。在这里, 我们描述了一种可靠的检测方法来监测小鼠睾丸在体内的完整性。一个完整的 btb 阻止了 fitc 共轭菊粉从基部扩散到精子管的顶端室。与替代方法相比, 此技术适用于研究可能影响 btb 功能或完整性的基因候选物、病毒或环境毒物, 操作简单, 对手术技能的要求极少。
Introduction
哺乳动物精子发生被认为是一个高度结构化的过程, 包括精原体自我更新和分化, 通过精母细胞成为单倍体精子通过有丝分裂, 减数分裂, 和精子细胞生成, 在此期间戏剧性发生生化和形态变化。发育中的生殖细胞逐渐从精子管的底部向腔内输送。这个过程是由生殖细胞和塞尔托利细胞1,2之间的细胞接触调节的。相邻的塞尔托利细胞形成位于生精小管基部附近的 Sertoli。btb 物理上将上皮分为基底和肾上腺室。在上皮周期的第八-ix 期, 基底隔间的前瘦素精母细胞通过 btb 迁移, 进入内皮隔间 3.因此, btb 的功能是为完成减数分裂和精子发生 4,5,6提供免疫诊断的微环境.与其他仅由紧密连接点 (tj) 组成的血组织屏障 (如血脑屏障) 不同, btb 由四个不同的连接点 (tj、外质化专业、缝隙连接点和中间丝状连接点) 组成。) 塞尔托利细胞之间 1,7。
许多研究使用转基因小鼠、病毒感染和环境毒物来研究 btb 完整性的机制 7,8, 9.btb 破坏会导致精子发生和不孕不育受损。由于 Sertoli 的形成和完整性已被证实受到塞尔托利细胞8之间接触的影响, 基于分离的塞尔托利细胞原代培养的体外模型已被用于 Sertoli 研究。然而, 该模型不能准确地模拟 btb 动态在体内。此外, 没有建立这种与塞尔托利细胞共同培养的方法, 能够反映 Sertoli10、11 的所有相关结构和功能成分。
一般来说, btb 完整性检测通常基于小分子, 如 ez-link sulfo-nhs-lc-biopin 和 fitc 共轭菊粉 (inulin-fitc). 通常情况下, 生物素或 inulin-FITC 从基底隔间的扩散被 btb 结构阻断。因此, 我们能够使用这种方法来评估 btb 损伤与对照组相比的程度。虽然 btb 可能会受到某些类型的刺激的影响, 例如使用氯化镉 (cdcl2)12的治疗, 但小分子可以接触到 btb, 这些分子最终会作为指标进入肾上腺隔间。
早期体内 btb 完整性检测包括将生物素或 inulin-FITC 注入颈静脉, 这涉及手术, 具有侵入性、复杂性和耗时性。此外, 由于记者的物质通过循环在全身扩散, 在精子管中的生物素或伊努林-fitc 的局部浓度是有限的。此外, 全身接触可能会诱发免疫反应。在这里, 我们提出了一个简单而有效的体内btb 完整性检测, 使直接注射少量的 inulin-FITC 到睾丸间质。使用荧光标记法, 染色过程方便, 因为不需要二级抗体。在这里, 荧光染料进入睾丸的过程是可视化的。
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Protocol
所有进行的动物实验都得到了南京医科大学委员会的批准。雄性 c57bl6 小鼠在光周期条件下保存, 并提供食物和水。
1. 准备工作
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微注射毛细血管
- 使用外径、内量计和长度分别为 1.0 mm、0.8 mm 和 10.0 cm 的微注射毛细血管。
- 用毛细管拉拔玻璃毛细血管 (图 1a)。根据所使用的毛细管牵引机, 测试和调整设置。
- 用钳子将移液器吸头断裂, 以获得在吸头直径为50μm 的毛细血管。
注意: 提示可能太长, 无法穿透睾丸。 - 使用微型移液器斜面以30°角锐尖 (图 1c)。
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试剂
- 制备1% 戊巴比妥钠: 在10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中溶解戊巴比妥钠100毫克 (步骤 2.3.3)。
- 准备 10 mgml inulin-FITC: 在100μl 的 pbs 中溶解 inulin-FITC 1 毫克 (步骤 2.1.6)。
- 制备4% 的甲醛: 在100毫升 pbs 中溶解聚甲醛 (pfa) 4 克 (步骤 2.3.3)。
- 准备30% 蔗糖: 溶解蔗糖3克在10毫升的 pbs (步骤 2.3.4)。
- 制备0.1% 氯化镉: 在10毫升的 pbs 中溶解浓度为10毫克的氯化镉 (步骤 2.1.1)。
2. 方法
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麻醉和手术前准备
- 称量8周龄的 c57bl6 雄性小鼠, 并计算所需剂量的 cdcl2。手术前用 cdcl2 (5 mgkg b. w., ip.) 治疗一组小鼠 (n = 3), 为3d。以 pbs 为对照, 治疗另一组8周龄的 c57bl6 雄性小鼠 (n = 3)。
- 在无菌条件下使用无菌注射器、针头、剪刀和钳子进行手术。
- 新鲜地准备麻醉工作溶液。麻醉所需剂量为70毫克戊巴比妥钠/体重。平均而言, 8周大的成年 c57bl6 小鼠体重约25克, 相当于175微克1% 戊巴比妥钠 (每只小鼠1.75 毫克)。
注: 戊巴比妥钠溶于无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。在使用之前, 溶液由0.22 微米过滤单元过滤。 - 用75% 的乙醇清洁手术部位, 并用干净的纸巾覆盖该区域。
- 打开恒温加热器, 将温度调整到37°c。
- 在手术当天准备 inulin-fitc 工作解决方案 (10 mg/ml)。
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手术
- 称量8周龄的 c57bl6 雄性小鼠, 并计算麻醉所需剂量。
- 使用1-ml 无菌注射器进行戊巴比妥钠腹腔注射。把老鼠关在干净的笼子里。
- 观察小鼠的眼睛反射反应和呼吸模式, 以确认它是在完全麻醉下。
注: 通常情况下, 10-15分钟, 直到鼠标被深度麻醉, 完全缺乏脚趾捏反应和维持缓慢, 稳定的呼吸。 - 将鼠标移动到手术区域, 并用潮湿的纸巾覆盖眼睛区域, 以避免麻醉过程中干燥 (图 2a)。
- 用剃须刀刮掉它的腹部头发, 用75% 的乙醇对手术区域进行消毒。
- 用锋利的剪刀, 在前腺体上方做一个1厘米长的皮肤切口, 露出腹壁。用小钳子提起腹壁, 做一个0.5 厘米的切口, 露出腹腔 (图 2b)。
- 使用钳子来搜索附属物和睾丸周围的脂肪垫。小心地将脂肪垫拉出, 以清楚地暴露附着的睾丸 (图 2c和2d)。通常, 一次在一个睾丸上做手术。
注: 避免用手触摸脂肪垫和睾丸。 - 将纸张 (直径9厘米) 放在脂肪垫和睾丸下面 (图 2c)。
- 将 inulin-FITC 注入微注入移液器, 并将其连接到微机械手单元 (图 1d)。轻轻地将微注射移液器插入下, 并将总共20μl 的 inulin-fitc 加载到睾丸的间质中 (图 2e和2E)。
注: 小心地按下微注射移液器, 以避免移动它。 - 监测睾丸中 inulin-FITC 的移动 (图 2g)。
- 注射完成后, 立即将睾丸放回腹腔。
- 在对侧睾丸上重复这个步骤。该睾丸注射20μl 的 pbs 作为对照。
- 用手术缝合线缝合皮肤, 将鼠标移动到恒温加热器的热垫上 (图 1 b)。通过皮下注射每1公斤体重服用1毫克的镇痛药 (丁丙诺非)。
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收获睾丸和冷冻切片的制备
- 注射40分钟后, 根据动物护理和使用指南, 通过宫颈脱位对受体细胞小鼠进行安乐死。
- 用一把锋利的剪刀收集睾丸。将睾丸放入1毫升的冰凉 pbs 中, 以消除任何血液污染。
- 将4% 的甲醛 (pfa) 在4°c 下固定在4-24小时内, 丢弃4% 的 pfa, 并在室温下用 1.5 ml 的 1% pbs 清洗组织3x。
- 在30% 的蔗糖中, 可在一夜之间脱水。将睾丸放入嵌入框架中, 以最佳的切割温度化合物 (oct) 覆盖组织。oct 冻结后, 用 oct 填充嵌入框架, 使整个睾丸都能覆盖 oct。
- 在-20°c 的低温下, 将睾丸的冷冻横截面切割成5微米厚, 并使其粘附在显微镜幻灯片上。
注: 在干冰中解冻嵌入的组织可能会增加切割的刚性。
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映像申请
- 将幻灯片放入加湿盒中。在室温下加热滑梯10分钟。
- 在室温下用三缓冲盐水 (tbs) 清洗3x 部分。
- 在黑暗中风干5分钟。用无尘纸擦掉任何剩余的 tbs。
- 用 4 ', 6-二胺-2-苯并丁醇 (dapi) 覆盖横截面。将倒置的盖板放在显微镜幻灯片上。
- 使用共聚焦显微镜获取图像。总20x 放大倍率通常足以检测明亮的荧光信号。
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Representative Results
执行 btb 完整性分析的实验设置如图 1所示。用毛细管拉拔和微型移液器斜面拉和锐化微注射毛细血管 (图 1 a和1c)。微注射用恒温加热器和设备如图 1 b 和1 d 所示。
图 2显示了注入 inulin-FITC 的一些关键步骤。在小鼠经历完全麻醉后, 用剪刀做一个小切口 (图 2 a 和2 b)。使用微注射移液器外露并注入荧光染料 (图 2G - 2g)。
图 3显示了基于体内检测评估 btb 完整性的研究的典型图像。对 cdcl2治疗组的小鼠注射了3天的急性 cdcl 2 (5 mg kg b. w., ip.)。对照组 btb 结构阻断了 inulin-fitc 从基底室的扩散, 而 btb 结构受损, 而 inulin (绿色荧光) 进入 cdcl 2 中精原体上皮的顶端室-治疗组。白线段表示菊粉从基底膜所走的距离 (图 3 a)。btb 伤害的程度由距离决定。对于椭圆管, 半径是从基部隔间到小管中心的最短和最长距离的平均值。我们使用这样的比率作为 btb 损害程度的指数:
在这里, dinulin是由伊努林从基部隔间所走的距离, d半径是同一神学院小管的半径 (图 3b)。在 rictorfl/+ 小鼠中完整的 btb 阻止了菊粉在屏障上的扩散进入顶端隔间。相反, rictorcko 小鼠有一个妥协的 btb 允许菊粉扩散 (图 3c)。
图 1: 小鼠睾丸间质微注射设备.(a) 用垂直毛细管拉拔器拉玻璃毛细血管。(b) 此面板显示恒温加热器。(c) 使用微型移液器斜面对吸头进行锐化。(d) 微注射装置包括微注射泵和立体显微镜。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 在小鼠体内进行睾丸间质微注射的代表性图像.(a) 这个面板显示了剃须刀摘除腹部头发的情况。(b) 这个面板显示0.5 厘米的腹壁切口, 以暴露腹腔。(c) 将脂肪垫拉出, 以清楚地暴露附着的睾丸。(d) 此面板显示睾丸和附属物的位置。(e) 此面板显示微注射移液器的位置。(f) 将微注射移液器插入睾丸的间质中。(g) 这个面板显示了一个睾丸, 成功地注入到睾丸的间质。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 基于体内功能分析评估 btb 完整性的研究.成年雄性小鼠 (治疗组和对照组均为3) 用 cdcl2 (5 mg kg b. w., ip.) 治疗 3天 (治疗组), 或用 pbs 治疗 3天 (对照组)。绿色荧光 (inulin-fitc) 位于对照组的精管底部附近, 而 inulin-fitc 在 cdcl2 治疗组启动穿越 btb 的通道。(a) 在这个面板中, 白线段表示 inulin fitc 入侵的距离。刻度柱为20μm。(b) btb 完整性检测的数据显示在此直方图中, 该直方图显示了 inulin (dinulin) 与同一小管 ( d半径) 的半径所走的距离。80个小管是随机选择的。p & lt; 0.001 (学生t-考试)。(c)在 rictorcko 小鼠的睾丸中 btb 的完整性受到损害。在rictorcko 小鼠小管中, 伊努林深入精子上皮, 到达小管腔内。刻度柱为50μm。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
精子发生在精子上皮, 是一个高度有序和动态的过程, 由生殖细胞和体细胞 (如 塞尔托利细胞)控制13。由塞尔托利细胞构建的 Sertoli 结构将精子上皮分为基底和顶端隔间。减数分裂和单倍体生殖细胞的发育发生在形成免疫屏障的顶端隔间 14.
btb 功能可能会受到有毒物质的损害, 也可能会由于与细胞连接形成有关的基因缺陷而受到损害, 从而导致男性不育。为了检验 Sertoli 的完整性, 已经建立了一个体外sertoli 细胞培养系统, 该系统能够形成在体内与Sertoli 紧密模仿的功能上皮15。该体外系统为研究塞尔托利细胞连接点的结构和功能提供了一个简单的模型。然而, 从睾丸中分离出并在体外培养的塞尔托利细胞在动物年龄和细胞密度上受到 15,16的限制。此外, 必须监测塞尔托利细胞的纯度和模仿 Sertoli 特征的超微结构的存在17。更重要的是, Sertoli 的结构和完整性还需要生殖细胞和塞尔托利细胞之间的相互作用, 这一点从细菌细胞特异性空突变小鼠的研究中可见一斑, 这些小鼠的 Sertoli 缺陷为 10、18、19。因此, 在体外创建与塞尔托利细胞的联合培养, 以重述 Sertoli在体内的所有关键功能仍然具有挑战性11,20。
该协议描述了一种通过注射体内注射 fitc 来评估 btb 体内完整性的方法, 该方法由 chen 等人根据一个程序进行了修改. 21. 该议定书描述了雄性小鼠的麻醉、腹腔腔的暴露、染料微注入睾丸间质、收获睾丸并将其切割成冷冻部分以及图像的获取。为了顺利完成, 应注意几个步骤。首先, 重要的是使用适当剂量的麻醉, 因为严重的深度麻醉可能会导致死亡。此外, 注射毛细管的尖端长度不应过长;否则, 移液器不能穿透睾丸。
这里介绍的程序可用于分析病毒、化学毒物或候选蛋白质在 btb 调控中的作用。该检测方法灵敏、可靠且易于在体内监测 btb 的完整性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研发项目 (2016yfa0500902)、国家自然科学基金 (31471228, 31471228)、江苏杰出青年科学基金会 (bk20150047)、自然科学组织的支持。江苏省成立 (bk20140897, 14kka180005) 和江苏省创新型企业项目到 k. z。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
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