Summary
여기, 선물이 testes에 눌린 FITC를 주입 하 여 혈액 고환 방 벽 완전성을 평가 하는 프로토콜. 이것은 유전과 환경 요소에 의해 손상 될 수 있습니다 혈액 고환 방 벽 무결성 공부 효율적인 vivo에서 방법.
Abstract
Spermatogenesis는 고환의 seminiferous tubules에서 성숙한 정 충으로 spermatogonia의 개발 이다. 이 과정은 Sertoli 세포 접합 혈액 고환 방 벽 (도 서 구매), 포유류 몸에 있는 가장 단단한 조직 장벽 이며 2 개의 구획로 기초는 adluminal seminiferous 상피를 분리에 의해 지원 됩니다. 웨스트가 감수 분열 생식 세포에 대 한 독특한 microenvironment 만듭니다 I / II와 spermiogenesis 통해 정 충으로 postmeiotic spermatids의 개발에 대 한. 여기, 우리가 마우스 고환에서 vivo에서의 서 구매 무결성을 모니터링 하는 데 신뢰할 수 있는 분석 결과 설명 합니다. 그대로 웨스트가 seminiferous tubules의 꼭대기 구획에는 기저에서 FITC 활용 눌린의 확산을 차단합니다. 이 기술은 유전자 후보, 바이러스, 또는 서 구매 기능 또는 무결성, 쉬운 절차와 다른 방법에 비해 수술 능력의 최소한의 요구 사항에 영향을 미칠 수 있는 환경 유독 공부 위해 적당 하다.
Introduction
포유류 spermatogenesis spermatogonial 자체-갱신 및 감 별 법 spermatocytes 통해 유사 분열, 감수 분열, 그리고 spermiogenesis를 통해 단일 정 충에는 극적인 고도로 구조화 된 과정으로 간주 됩니다. 생화학 및 형태학 상 변화 발생합니다. 개발 생식 세포는 루멘으로 seminiferous 관의 기지에서 점차적으로 이송 됩니다. 이 프로세스는 세균 세포와 Sertoli 세포1,2사이 세포 세포 접촉에 의해 통제 된다. 인접 한 Sertoli 세포 형성 seminiferous 관의 기지 근처에 있는 서 구매. 도 서 구매 실제로 나눕니다 상피는 기저 및 adluminal 구획. 8 조-IX 상피 주기의 단계 preleptotene/leptotene spermatocytes 기저 구획에서도 서 구매, adluminal 구획3입력에 걸쳐 마이그레이션합니다. 따라서,는 서 구매의 함수 감수 분열 및 spermiogenesis4,,56의 완료에 대 한 immunoprivileged microenvironment를 제공 하는. 다른 혈액 조직 장벽 (예, 혈액-뇌 장벽)만 꽉 접합 (TJs)으로 구성 된, 달리는 서 구매 (TJs, ectoplasmic 전문화, 간격 접속점, 그리고 중간 필 라 멘 트에 기초를 둔 4 명의 다른 접합에 의해 형성 된다 desmosomes) 사이 Sertoli 세포1,7.
많은 연구는 사용 유전자 변형 마우스, 바이러스 감염, 환경 유독 웨스트가 무결성7,,89의 메커니즘을 조사 하. 도 서 구매 중단 장애인된 spermatogenesis subfertility 또는 불 임 유도합니다. 생체 외에서 모델 격리 Sertoli 세포의 기본 문화에 따라 사용 되었습니다 이후 웨스트가 형성 및 무결성 확인 되었습니다 Sertoli 세포8사이 접촉에 의해 영향을 받을, 웨스트가 연구. 그러나,이 모델에는 웨스트가 역학 비보모방 정확 하 게 수 없습니다. 또한, Sertoli 세포와 생식 세포의 이러한 공동 문화는 모든 관련 구조 및 기능 구성 요소 웨스트가10,11의 반영의 능력으로 설립 되었습니다.
일반적으로, vivo에서 웨스트가 무결성 분석 실험 일반적으로 EZ-링크 Sulfo NHS LC 비오 틴 등 FITC 활용 눌린 (눌린 FITC) 작은 분자에 근거한 다. 일반적으로, biotin 또는 기초 구획에서 눌린 FITC의 보급도 서 구매 구조에 의해 차단 됩니다. 따라서, 우리는이 메서드를 사용 하 여 제어 그룹에 비해 웨스트가 손상의 정도 평가 하기 위해 수 있습니다. 도 서 구매는 특정 유형의 카드뮴 염화 (CdCl2)12, 치료 등의 자극으로 손상 될 수 있습니다 동안 웨스트가 된다 결국 지표로 adluminal 구획을 입력 작은 분자에 액세스할 수 있습니다.
초기 vivo에서 웨스트가 무결성 분석 결과 포함 biotin 또는 눌린 FITC는 수술를 포함 하 고 침략 적, 이며 복잡 한, 시간이 걸리는 경 정 맥에 주입 됩니다. 게다가, 기자 물질 순환을 통해 몸 전체를 통해 확산로 비오 틴 또는 seminiferous tubules에 눌린 FITC의 현지 농도 제한 됩니다. 또한, 조직의 노출 수 면역 반응을 유도 하 고 있다. 여기, 우리는 간단 하 고 효과적인 vivo에서 웨스트가 무결성 분석 결과 고환의 interstitium에 눌린 FITC의 작은 약 수의 직접 분사를 사용 현재. 형광 라벨 메서드를 사용 하 여 얼룩 과정이 편리 하 고, 2 차 항 체는 필요 하지 않습니다 으로입니다. 여기, 형광 성 염료는 고환 입력의 과정은 시각.
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Protocol
모든 수행된 동물 실험 난징 의학 대학 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고. 남성 C57BL/6 마우스 제어 photoperiod 조건 하에서 유지 했다 그리고 음식과 물을 함께 제공 했다.
1입니다. 준비
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Microinjection 모 세관
- 외경, 내부 직경와 1.0 m m, 0.8 m m와 10.0 c m, 길이 microinjection 모세를 각각 사용 합니다.
- 모 세관 끌어당기는 사람 (그림 1A)와 유리 모 세관을 당겨. 테스트 하 고 사용 되는 모 세관 끌어당기는 기계에 따라 설정을 조정 합니다.
- 사용 하는 끝에 50 µ m 직경의 모 세관을 가져오는 집게와 피 펫 팁을 휴식.
참고: 도움말은 고환에 침투 하는 너무 오래 있을 수 있습니다. - Micropipette beveler (그림 1C)을 사용 하 여 30 ° 각도에서 팁을 선명 하 게.
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시 약
- 1 %pentobarbital 나트륨 준비: pentobarbital 나트륨 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (단계 2.3.3) 10 mL에 100mg을 디졸브.
- 10 mg/mL 눌린 FITC 준비: 눌린 FITC PBS (단계 2.1.6)의 100 μ 1 mg을 디졸브.
- 4 %paraformaldehyde 준비: paraformaldehyde (PFA) 4g PBS (단계 2.3.3) 100 mL에 녹.
- 30% 자당 준비: 자당 10 ml PBS (2.3.4 단계)의 3 세대 분해.
- 0.1% 카드뮴 염화 물 준비: 카드뮴 염화 PBS (2.1.1 단계) 10 mL에 10 mg을 디졸브.
2입니다. 방법
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마 취와 presurgery 준비
- 그리고 8 주 된 C57BL/6 남성 마우스 무게 CdCl2의 필요한 복용량을 계산. 쥐의 그룹 치료 (n = 3) CdCl2 (5 mg/kg 들어, i.p.) 수술 전에 3 d. 8 주 된 C57BL/6 남성 생쥐의 또 다른 그룹 치료 (n = 3) 컨트롤로 PBS를 가진.
- 멸 균 주사기와 바늘가 위, 집게를 사용 하 여 무 균 조건 하에서 수술을 수행 합니다.
- 갓 마 취 작업 솔루션을 준비 합니다. 마 취의 필요한 복용량은 체중의 pentobarbital 나트륨/kg의 70 mg 이다. 평균적으로, 나이의 8 주에는 성인 C57BL/6 마우스 무게 175 μ 1 %pentobarbital 나트륨 (마우스 당 1.75 m g)에 해당 하는 25 g.
참고: pentobarbital 나트륨 살 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 녹입니다. 솔루션으로 필터링 되는 0.22 um 사용 되기 전에 필터 단위. - 75% 에탄올과 수술에 대 한 영역을 청소 하 고 깨끗 한 조직 수건으로 그 지역을 커버.
- 서 모스 탯 히터를 켜고, 37 ° c 온도 조정
- 수술 당일에 눌린 FITC 작업 솔루션 (10 mg/mL)를 준비 합니다.
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외과 절차
- 8 주 된 C57BL/6 남성 마우스 무게 하 고 마 취의 필요한 복용량을 계산.
- Pentobarbital 나트륨 1 mL의 멸 균 주사기를 사용 하 여의 복 주사를 수행 합니다. 깨끗 한 새 장에 마우스를 유지.
- 눈 반사 반응과 완벽 한 마 취 다는 것을 확인 하는 마우스의 호흡 패턴을 관찰 합니다.
참고: 일반적으로 10-15 분 필요까지 마우스는 깊이 취, 느리고, 꾸준한 호흡의 유지 보수와 발가락 핀치 응답의 총 부족 합니다. - 작업 영역에 마우스를 이동 하 고 마 취 (그림 2A) 동안 건조를 방지 하는 촉촉한 티슈로 그 눈 영역을 커버.
- 그것의 복 부 머리는 면도기로 면도 하 고 수술 지역 75% 에탄올으로 소독.
- 날카로운가 위, 복 벽을 노출 preputial 동맥 위에 1 cm 피부 절 개를 확인 합니다. 작은 집게로 복 벽을 들어올리고 노출 복 막 구멍 (그림 2B)에 0.5 c m 절 개를 하 게 합니다.
- 집게를 사용 하 여 지방 패드 epididymis 고환 주위에 대 한 검색. 밖으로 명확 하 게 연결 된 고환 노출 지방 패드를 조심 스럽게 빼냅니다 (그림 2C 및 2D). 일반적으로, 한 번에 하나의 고환에서 작동 합니다.
참고: 지방 패드와 고환 손으로 만지지 마십시오. - 뚱뚱한 패드와 고환 (그림 2C) 밑에 종이 (지름에서 9 c m)를 배치 합니다.
- Microinjection 피 펫에 눌린 FITC를 주입 하 고 micromanipulator 단위 (그림 1D)에 연결 합니다. 부드럽게 tunica albuginea 아래 microinjection 피 펫을 삽입 하 고 (그림 2E 와 2F) 고환의 interstitium에 눌린 FITC의 20 μ의 총을 로드.
참고: 신중 하 게 그것을 이동 하지 않으려면 microinjection 피펫으로 우울. - (그림 2G) 고환에 눌린 FITC의 움직임을 모니터링 합니다.
- 바로 넣어는 고환 다시 복 부 캐비티에 주입의 완료 후에.
- Contralateral 고환에서 절차를 반복 합니다. 이 고환은 PBS의 20 μ와 제어로 주입 됩니다.
- 피부 외과 봉합 사를 닫고 서 모스 탯 히터 (그림 1B)의 열 패드를 마우스를 이동 합니다. 피하 주사를 통해 몸 무게 1 킬로그램 당 진통제 (buprenorphine)의 1 밀리 그램의 복용량을 관리 합니다.
-
수확 하는 고환과 냉동된 섹션 준비
- 주입 후 40 분 동물 관리에 따르면 자 궁 경부 전위에 의해 받는 사람 마우스를 안락사 하 고 지침을 사용 합니다.
- 날카로운가 위를 사용 하 여 testes를 수집. 모든 혈액 오염 제거를 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL에 testes를 놓습니다.
- 4 12-24 h. 삭제 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 testes 수정 %PFA 및 세척 조직 3 실 온에서 1 %PBS 1.5 mL x.
- 하룻밤 30% 자당에서 조직 탈수. 포함 하는 프레임에는 고환을 넣고 커버 최적의 절삭 온도 복합 조직 (10 월). OCT, 냉동 후 채울 포함 프레임 10 월 전체 고환 10 월 커버 될 수 있다 그래야.
- -20 ° C에서 cryostat에 testes의 5 μ m 두께, 냉동 횡단면을 잘라내어 현미경 슬라이드를 준수 하자.
참고: 드라이 아이스에서 포함 된 조직 거 절단 강성을 증가할 수 있습니다.
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이미지 요청
- 슬라이드는 습도 상자에 놓습니다. 10 분 동안 실내 온도에 슬라이드 따뜻한.
- 섹션 3을 씻어 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 실 온에서 x.
- 어둠 속에서 5 분 건조. 먼지가 종이 어떤 잔여 TBS를 닦아내십시오.
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 크로스 섹션 커버. 거꾸로 coverslip 현미경 슬라이드에 배치 합니다.
- Confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 20 배 확대의 총은 일반적으로 밝은 형광 신호를 탐지 하는 데 충분 합니다.
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Representative Results
도 서 구매 무결성 분석 결과 수행 하기 위한 실험 설정 그림 1에 표시 됩니다. 고 각각 모 세관 끌어당기는 사람와 micropipette beveler microinjection 모 세관을 선명 하 게 (그림 1A 및 1c). 서 모스 탯 히터 및 microinjection에 대 한 장비는 그림 1B 및 1 D에 나와 하 고 있습니다.
그림 2 눌린 FITC의 주입에 대 한 주요 단계 중 일부를 표시합니다. 가 위를 사용 하 여 마우스 완전 마 취 (그림 2A 와 2B) 받은 후 작은 절 개를. 마우스 고환 노출 이며 microinjection 피 펫 (그림 2C - 2 G)을 사용 하 여 형광 염료를 주입.
그림 3 비보에 분석 결과에 따라도 서 구매 무결성을 평가 하는 연구의 전형적인 이미지를 표시 합니다. 쥐 CdCl2-3 일 동안 CdCl2 (5 mg/kg 들어, i.p.)의 급성 복용량 주입 치료 그룹. 눌린 FITC 기저 구획에서의 확산에 CdCl2에서에서 seminiferous 상피의 꼭대기 부분으로 제어 그룹, 웨스트가 건설 손상 동안에 눌린 (그린 형광) 구절도 서 구매 구조에 의해 차단 -치료 그룹. 화이트 선 세그먼트는 눌린 지하실 멤브레인 (그림 3A)에서 여행 하는 거리를 나타냅니다. 웨스트가 손상의 범위는 거리에 의해 결정 됩니다. 타원형 루멘에 대 한 반지름 이며 짧은의 평균 기저 구획에서 가장 긴 거리는 관의 센터에. 이러한 비율 웨스트가 손상의 정도 대 한 인덱스로 사용합니다.
여기, D눌린 눌린 기저 구획에서 여행 하는 거리 이며 D반지름 은 동일한 seminiferous 관 (그림 3B)의 반지름입니다. 에 그대로 웨스트가 Rictorfl / + 마우스 입력 꼭대기 구획 장벽을 가로질러 눌린의 확산을 차단. 반면, Rictorcko 쥐 눌린 확산 (그림 3C) 허용 손상된 웨스트가 있다.
그림 1: 마우스 고환 중간 microinjection 장비. (A) 풀 유리 수직 모 세관 끌어당기는 사람와 모 세관. (B)이이 패널 히터 서 모스 탯을 보여줍니다. (C) 팁 micropipette beveler를 사용 하 여 날카롭게 된다. (D) microinjection에 대 한 단위에는 microinjection 펌프 및 스테레오 현미경 포함 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 이미지는 vivo에서 고환의 간 질 성 microinjection 절차의 마우스에. (A)이이 패널은 면도기에 의해 복 부 머리의 제거를 보여줍니다. (B)이이 패널에는 0.5 cm 복 벽 절 개를 노출 복 막 구멍을 보여 줍니다. (C) 풀 지방 밖으로 명확 하 게 연결 된 고환 노출 패드. (D)이이 패널 epididymis 고 고환의 위치를 보여준다. (E)이이 패널 microinjection 피 펫의 위치를 보여준다. (F) 삽입 하는 고환의 interstitium에 microinjection 피 펫. (G)이이 패널에는 고환은 고환의는 interstitium에 성공적인 주입으로 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 웨스트가 무결성을 평가 하는 연구는 vivo에서 기능 분석 결과에 따라. 성인 남성 쥐 (n = 처리 그룹과 통제 그룹에 3) CdCl2 (5 mg/kg 들어, i.p.) 3 일 (대우 그룹)에 대 한 치료 또는 PBS로 3 일 (제어 그룹)에 대 한 치료. 눌린 FITC (그린 형광)는 눌린 FITC CdCl2 처리 그룹에서도 서 구매를 통해 통행을 시작 하는 동안 컨트롤 그룹에서 seminiferous 관의 기지 근처에 위치 해 있습니다. (A)이이 패널에 흰색 선 세그먼트 거리 눌린 FITC 침공 나타냅니다. 스케일 바 20 μ m입니다. 도 서 구매 무결성 분석 실험에서 (B) 데이터에에서 표시 됩니다이 히스토그램 눌린 (D눌린) 대 여 주행 거리를 표시 하는 동일한 관 D (Radius) 반지름. 80 tubules 무작위로 선택 됩니다. P < 0.001 (학생의 t-테스트). (C)는 웨스트가 무결성 Rictorcko 쥐의 고환에 손상 됩니다. Rictorcko 마우스 tubules는 눌린 관 루멘을 도달 seminiferous 상피 깊숙한 침투. 눈금 막대는 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Spermatogenesis seminiferous 상피에서 고은 체세포와 생식 세포에 의해 경 세 되 매우 정렬 된 동적 과정 이다 (예를 들어, Sertoli 세포)13. Sertoli 세포 구성, 웨스트가 구조가 나눕니다 seminiferous 상피는 기저와 꼭대기 구획. Meiotic 및 단일 세균 세포의 개발은 면역 장벽14을 형성 하는 꼭대기에 발생 합니다.
유독 하거나 세포 접합, 남성 불 임에 이르는의 형성에 관여 하는 유전자 결함 때문도 서 구매 기능을 손상 수 있습니다. 웨스트가 무결성을 검사 하기 위하여는 시험관에 는 밀접 하 게 형성 기능 상피의 수 있는 Sertoli 세포 문화 시스템 설립 되었습니다15 vivo에서도 서 구매를 싫어 하지. 이 체 외에 시스템 구조 Sertoli 세포 접합의 기능을 공부 하 고 간단한 모델을 제공 합니다. 그러나, Sertoli 세포 고환에서 격리 되며 경작에 생체 외에서 동물 나이 및 셀 밀도15,16에 관하여 제한. 또한, Sertoli 세포의 순도 흉내 낸 웨스트가 기능 해야 하는 ultrastructures의 존재17을 모니터링 합니다. 더 중요 한, 웨스트가 구조와 무결성 필요 생식 세포와 Sertoli 세포, 세균 세포 특정 웨스트가 결함10,,1819null 돌연변이 생쥐의 연구에서 분명 간의 상호 작용 합니다. 따라서,도 서 구매의 모든 중요 한 비보에 기능 업과의 목적 유지 도전11,20대 에 체 외 세포 Sertoli 세균 세포의 공동 문화 만들기.
이 프로토콜 눌린-FITC, 첸 그 외 여러분 에 의해 프로시저에서 수정 된을 주입 하 여도 서 구매 무결성에서 vivo에서 평가 하는 방법을 설명 합니다. 21. 남성 쥐, 복 막 구멍의 노출, 고환, testes를 수확 하 고 냉동된 섹션, 그리고 이미지의 수집으로 그들을 절단의 interstitium에 염료의 microinjection의 마 취는 프로토콜에 설명 합니다. 성공적인 완료에 대 한 몇 가지 단계를 지적 한다. 첫째, 심각 하 게 깊은 마 취 사망을 일으킬 수 있기 때문에 마 취의 적절 한 복용량을 사용 하 여 중요 하다. 또한, 주사 모 세관의 끝의 길이 해서는 안됩니다 너무 오래; 그렇지 않으면, 피펫으로 고환에 침투 수 없습니다.
여기에 제시 된 절차는 바이러스, 화학 유독, 또는 서 구매의 규칙에 관련 된 후보 단백질의 역할을 분석 하는 데 활용할 수 있습니다. 이 분석 결과, 신뢰성, 민감한 이며 웨스트가 무결성 비보를 모니터에 액세스할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 고유 영 학자 (BK20150047), 자연 과학에 대 한 국가 키 R & D 프로그램의 중국 (2016YFA0500902), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31471228, 31771653), 강 소 과학 재단에 의해 지원 되었다 장쑤 성 (BK20140897, 14KJA180005)와 K.Z.에 소성의 혁신적이 고 기업 프로그램의 기초
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
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