Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a integridade da barreira sangue-testículo injetando inulina-FITC em testículos. Este é um método eficiente na vivo para estudar a integridade de barreira sangue-testículo, que pode ser comprometida por elementos genéticos e ambientais.
Abstract
Espermatogênese é o desenvolvimento das espermatogónias em espermatozoides maduros nos túbulos seminíferos do testículo. Este processo é suportado por junções de células de Sertoli na barreira sangue-testículo (BTB), que é a barreira de tecido mais apertada no corpo dos mamíferos e segrega o epitélio seminífero em dois compartimentos, um basal e um adluminal. O BTB cria um microambiente exclusivo para as células germinativas em meiose eu / II e para o desenvolvimento de postmeiotic espermátides em espermatozoides através de acridina. Aqui, descrevemos um ensaio confiável para monitorar a integridade do BTB do rato testículo na vivo. Uma intacta BTB bloqueia a difusão de inulina FITC-Conjugado da basal para o compartimento apical dos túbulos seminíferos. Esta técnica é apropriada para o estudo de genes candidatos, vírus ou tóxicos ambientais que podem afetar a função do BTB ou integridade, com um procedimento fácil e de um requisito mínimo de habilidades cirúrgicas em comparação com métodos alternativos.
Introduction
Espermatogênese de mamíferos é considerado um processo altamente estruturado que engloba espermatogónias auto-renovação e diferenciação através de espermatócitos em espermatozoides haploides através de mitose e meiose acridina, durante o qual dramática ocorrem alterações bioquímicas e morfológicas. Desenvolvimento das células germinativas são progressivamente transportadas da base do túbulo seminífero em direção ao lúmen. Este processo é regulado pelo celular os contactos entre as células germinativas e células de Sertoli1,2. Células de Sertoli adjacentes formam o BTB que situa-se perto da base do túbulo seminífero. O BTB fisicamente divide o epitélio em um basal e um compartimento adluminal. Durante estágios VIII - IX do ciclo do epitélio, preleptotene/leptóteno espermatócitos de compartimentos do basais migram através do BTB, entrando o adluminal compartimentos3. Portanto, a função do BTB é fornecer um microambiente immunoprivileged a conclusão de meiose e acridina4,5,6. Ao contrário de outras sangue-tecido barreiras (por exemplo, barreira hemato - encefálica) que são compostas apenas de junções apertadas (TJs), o BTB é formado por quatro diferentes junções (TJs, especializações ectoplásmicas, junções e intermediário baseado no filamento desmossomas) entre Sertoli células1,7.
Muitos estudos utilizaram-se ratos geneticamente modificados, infecções por vírus e tóxicos ambientais para investigar mecanismos de BTB integridade7,8,9. O rompimento do BTB induz a espermatogênese prejudicada e Subfertilidade ou infertilidade. Desde a formação do BTB e integridade foram confirmados para ser afetado pelos contatos entre as células de Sertoli8, um modelo in vitro com base em cultura primária de células de Sertoli isoladas tem sido utilizado para o estudo do BTB. No entanto, este modelo exatamente não pode imitar BTB dinâmica em vivo. Além disso, não há tal co-cultura de células germinativas com células de Sertoli estabeleceu como capaz de refletir todos os componentes estruturais e funcionais relevantes do BTB10,11.
Em geral, ensaios de integridade em vivo BTB normalmente são baseados em pequenas moléculas, tais como o EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e inulina conjugado FITC (inulina-FITC). Normalmente, a difusão da biotina ou inulina-FITC do compartimento basal é bloqueada pela estrutura do BTB. Portanto, somos capazes de usar esse método para avaliar a extensão do dano BTB em comparação com grupos de controle. Enquanto BTB pode ser comprometida com certos tipos de estímulos, tais como tratamento com cádmio cloreto (CdCl2)12, BTB torna-se acessível para pequenas moléculas, os quais acabaram por inserir o compartimento adluminal como indicadores.
Um início na vivo BTB integridade ensaio envolve a injeção de biotina ou inulina-FITC na veia jugular, que envolve a cirurgia e é invasiva, complicado e demorado. Além disso, como as substâncias repórter difundem por todo o corpo através da circulação, a concentração local de biotina ou inulina-FITC nos túbulos seminíferos é limitada. Além disso, a exposição sistémica pode induzir reações imunes. Aqui, apresentamos um simples e eficaz na vivo BTB integridade ensaio permitindo injeção direta de uma pequena alíquota de inulina-FITC para o interstício de um testículo. Usando o método de rotulagem fluorescente, o processo de coloração é conveniente, como anticorpos secundários não são necessários. Aqui, o processo de tintura fluorescente entrando o testículo é visualizado.
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Protocol
Todas as experiências em animais realizadas foram aprovadas pelo Comitê de Nanjing Medical University. Camundongos C57BL/6 machos foram mantidos em condições de fotoperíodo controlados e foram fornecidos com comida e água.
1. preparações
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Capilares de microinjeção
- Use os capilares microinjeção com um diâmetro exterior e interior Dímetro comprimento de 1,0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, respectivamente.
- Puxe os capilares de vidro com um puxador capilar (figura 1A). Testar e ajustar as configurações, dependendo da máquina de extrator capilar que está sendo usado.
- Quebre as pontas de pipeta com fórceps usar para obter os capilares de um diâmetro de 50 µm na ponta.
Nota: As dicas podem ser muito longas para penetrar o testículo. - Afie a ponta em um ângulo de 30° usando um chanfrador micropipeta (Figura 1).
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Reagentes
- Prepare-se 1% de pentobarbital de sódio: dissolver pentobarbital de sódio 100 mg em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) (etapa 2.3.3).
- Prepare-se 10 mg/mL inulina-FITC: dissolver inulina-FITC 1 mg em 100 µ l de PBS (etapa 2.1.6).
- Preparar o paraformaldeído 4%: dissolver paraformaldeído (PFA) 4 g em 100 mL de PBS (etapa 2.3.3).
- Prepare-se 30% de sacarose: dissolver 3 g em 10 mL de PBS (etapa 2.3.4) de sacarose.
- Prepare-se cloreto de cádmio de 0,1%: dissolver cloreto de cádmio 10 mg em 10 mL de PBS (etapa 2.1.1).
2. métodos
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Preparação de anestesia e cirurgia
- Pesar de ratos masculinos de C57BL/6 de 8 semanas de idade e calcular a dose necessária de CdCl2. Tratar um grupo de ratos (n = 3) com CdCl2 (5 mg/kg de peso corporal, i.p.) para 3 d antes da cirurgia. Tratar de um outro grupo de camundongos machos de C57BL/6 de 8 semanas de idade (n = 3) com PBS como controle.
- Realizar a cirurgia sob condições assépticas usando seringa estéril, agulha, tesoura e pinça.
- Prepare a solução de trabalho de anestesia na hora. A dose necessária de anestesia é 70 mg de pentobarbital de sódio/kg de peso corporal. Em média, um rato adulto de C57BL/6 às 8 semanas de idade pesa ~ 25g, que corresponde a 175 μL de 1% pentobarbital de sódio (1,75 mg / rato).
Nota: O pentobarbital de sódio é dissolvido em salina tampão fosfato (PBS). A solução é filtrada por 0.22 hum unidade de filtro antes de serem utilizados. - Limpar a área para cirurgia com 75% de etanol e cobrir a área com uma toalha de tecido limpo.
- Ligar o aquecedor termostático e ajustar a temperatura a 37 ° C.
- Prepare a solução de trabalho de inulina-FITC (10 mg/mL) no dia da cirurgia.
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Procedimento cirúrgico
- Pesar de ratos masculinos de C57BL/6 de 8 semanas de idade e calcular a dose necessária de anestesia.
- Realize uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio utilizando a seringa de 1 mL estéril. Manter o mouse em uma gaiola limpa.
- Observe a resposta reflexa de olho e o padrão de respiração do rato para confirmar que é sob anestesia completa.
Nota: Geralmente, 10-15 min são necessários até que o mouse é profundamente anestesiado, com manutenção de respiração lenta, constante e uma total falta de resposta de pitada de dedo do pé. - Mova o mouse para a área de operação e cobrir a área dos olhos com um papel absorvente úmido para evitar o ressecamento durante a anestesia (Figura 2A).
- Raspar seu cabelo abdominal com uma máquina de barbear e desinfetar a área de cirurgia com 75% de etanol.
- Com uma tesoura afiada, faça uma incisão de 1 cm de pele acima as glândulas prepuciais para expor a parede abdominal. Levante a parede abdominal com pequenas pinças e faça uma incisão de 0,5 cm para expor a cavidade peritoneal (Figura 2B).
- Utilize pinças para pesquisar por almofadas de gordura ao redor do epidídimo e testículo. Puxe cuidadosamente as almofadas de gordura para expor o testículo anexado claramente (Figura 2 e 2D). Normalmente, operam em um testículo de cada vez.
Nota: Evite tocar as almofadas de gordura e testículos com as mãos. - Coloque um papel (9 cm de diâmetro), sob as almofadas de gordura e o testículo (Figura 2).
- Injetar uma pipeta de microinjeção de inulina-FITC e conectá-lo à unidade micromanipulador (Figura 1). Suavemente Insira a pipeta de microinjeção sob a túnica albugínea e carregar um total de 20 μL de inulina-FITC para o interstício do testículo (Figura 2E e 2F).
Nota: Pressione cuidadosamente a pipeta de microinjeção para evitar movê-lo. - Monitore a movimentação de inulina-FITC no testículo (Figura 2).
- Imediatamente devolva o testículo na cavidade abdominal após a conclusão da injeção.
- Repita o procedimento no testículo contralateral. Esse testículo é injetado com 20 μL de PBS como um controle.
- Fechar a pele com uma sutura cirúrgica e mover o mouse para uma almofada de calor de um aquecedor termostático (figura 1B). Administre uma dose de 1 mg de analgésico (buprenorfina) por 1 kg de peso corporal, via subcutânea.
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Colhendo os testículos e preparação de seções congeladas
- 40 min após a injeção, eutanásia o mouse destinatário por deslocamento cervical de acordo com cuidado animal e usar as diretrizes.
- Use um par de tesouras afiadas para coletar os testículos. Coloque os testículos em 1 mL de PBS gelado para remover qualquer contaminação de sangue.
- Corrigir os testículos em paraformaldeído 4% (PFA) a 4 ° C, durante 12-24 h.. descarte o 4% PFA e lave o tecido 3 x com 1,5 mL de PBS 1% à temperatura ambiente.
- Desidrate o tecido em 30% de sacarose durante a noite. Ponha o testículo no quadro de incorporação e cobrir o tecido com a temperatura ideal de corte composto (OCT). Depois a OCT é congelada, preencha o quadro de encastre com OCT, para que o testículo inteiro pode ser coberto com OCT.
- Corte 5 μm de espessura, congeladas seções transversais dos testículos em um criostato a-20 ° C e deixá-los a aderir às corrediças do microscópio.
Nota: Recongelar tecidos incorporados em gelo seco pode aumentar a rigidez para o corte.
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Requisição de imagem
- Coloque os slides em uma caixa de umidificado. Aquecer as lâminas à temperatura ambiente por 10 min.
- Lave as seções 3 x com salino Tris (TBS) à temperatura ambiente.
- Secar ao ar por 5 min no escuro. Limpe qualquer TBS residual com papel livre de poeira.
- Cobrir as seções transversais com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Lamela em uma corrediça do microscópio invertida de lugar.
- Adquira imagens usando um microscópio confocal. Um total de ampliação de 20 X é geralmente suficiente para detectar o sinal fluorescente brilhantemente.
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Representative Results
A montagem experimental para a realização do ensaio de integridade BTB é mostrada na Figura 1. Puxe e aguçar os capilares microinjeção com um extrator capilar e chanfrador micropipeta, respectivamente (figura 1A e 1C). O aquecedor termostático e equipamentos para o microinjection estão ilustradas na figura 1B e 1D.
Figura 2 exibe algumas das principais etapas para a injeção de inulina-FITC. Use a tesoura para fazer uma pequena incisão após o mouse passou por anestesia completa (Figura 2A e 2B). O testículo de rato é exposto e injectado com corante fluorescente com uma pipeta de microinjeção (Figura 2 - 2 G).
A Figura 3 exibe imagens típicas de um estudo para avaliar a integridade do BTB com base em um ensaio na vivo . Os ratos no CdCl2-grupo de tratamento são injetados com uma dose aguda de CdCl2 (5 mg/kg de peso corporal, i.p.) por 3 dias. A difusão da inulina-FITC do compartimento basal é bloqueada por estrutura BTB no grupo controle, enquanto a construção do BTB é danificada e passagens de inulina (fluorescência verde) no compartimento apical do epitélio seminífero no CdCl2 -grupo de tratamento. Segmentos de linha branca indicam a distância percorrida pela inulina da membrana basal (Figura 3A). A extensão do dano BTB é determinada pela distância. Para um lúmen elíptico, o raio é a média dos mais curtos e a maior distância do compartimento basal para o centro do túbulo. Nós usamos uma relação tal como um índice da extensão dos danos BTB:
Aqui, Dinulina é a distância percorrida por inulina do compartimento basal e DRadius é o raio do túbulo seminífero mesmo (Figura 3B). O BTB intacta em Rictorfl / + ratos bloqueia a difusão de inulina através da barreira para entrar no compartimento apical. Em contraste, RictorCKO em ratos têm um BTB comprometido permitindo a difusão de inulina (Figura 3).
Figura 1: equipamento para o microinjection intersticial testicular de rato. (A) Puxe capilares com um puxador vertical capilar de vidro. (B) este painel mostra o aquecedor termostático. (C) as dicas são afiadas usando o chanfrador micropipeta. (D) a unidade para o microinjection inclui uma bomba de microinjeção e um microscópio estéreo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de um processo na vivo microinjeção intersticial testicular em um mouse. (A), este painel mostra a remoção dos pelos abdominais por uma máquina de barbear. (B), este painel mostra a incisão da parede abdominal de 0,5 cm para expor a cavidade peritoneal. (C) Puxe a gordura almofadas para fora para expor o testículo anexado claramente. (D), este painel mostra a posição do testículo e epidídimo. (E), este painel mostra a posição da pipeta microinjeção. (F) inserir a Pipetar microinjeção para o interstício do testículo. (G), este painel mostra um testículo com uma injeção bem sucedida para o interstício do testículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Um estudo para avaliar a integridade do BTB baseado em um ensaio funcional na vivo . Ratos adultos machos (n = 3 no grupo de tratamento e o grupo de controle) são tratados com CdCl2 (5 mg/kg de peso corporal, i.p.) por 3 dias (grupo de tratamento) ou tratados com PBS durante 3 dias (grupo controle). Inulina-FITC (fluorescência verde) situa-se perto da base do túbulo seminífero no grupo controle, enquanto a inulina-FITC inicia uma passagem através do BTB no grupo CdCl2-tratamento. (A) neste painel, segmentos de linha branca indicam a distância inulina-FITC invade. As barras de escala são 20 μm. (B) dados de ensaios de integridade os BTB figuram este histograma, que mostram a distância percorrida por inulina (Dinulina) vs o raio do túbulo mesmo D (Radius). Oitenta túbulos são selecionados aleatoriamente. P < 0,001 (Student t-teste). (C) o BTB integridade é comprometida em testículos de ratos Rictorcko . Em Rictorcko túbulos de rato, a inulina penetra profundamente dentro do epitélio seminífero, atingindo o lúmen do túbulo. As barras de escala são 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Espermatogênese ocorre no epitélio seminífero e é um processo altamente ordenado e dinâmico que é regido por células germinativas e células somáticas (por ex., células de Sertoli)13. A estrutura do BTB, que é construída pelas células de Sertoli, divide o epitélio seminífero em um basal e um compartimento apical. O desenvolvimento das células germinativas haploides e meióticas ocorre no compartimento apical que forma uma barreira imunológica14.
A função do BTB pode ser comprometida por substâncias tóxicas ou devido a defeitos de genes envolvidos na formação de junções célula, levando a infertilidade masculina. A fim de examinar a integridade do BTB, um em vitro Sertoli estabeleceu sistema de cultura de células que é capaz de formar epitélio funcional que se aproxima imita o BTB na vivo15. Este sistema em vitro fornece um modelo simples para estudar a estrutura e função dos cruzamentos de célula de Sertoli. No entanto, o isolaram de células de Sertoli do testículo e cultivadas em vitro são limitados no que diz respeito a animais idade e célula densidade15,16. Além disso, a pureza das células de Sertoli e a presença de ultrastructures imitando BTB recursos devem ser monitoradas17. Mais importante, integridade e estrutura BTB também necessitam de interações entre as células germinativas e células de Sertoli, como é evidente a partir de estudos de germe-pilha-específico ratos mutantes nulos com BTB defeitos10,18,19. Assim, criando uma cultura co de células germinativas com Sertoli células in vitro para a finalidade de recapitulando toda função crucial na vivo de BTB permanece desafiador11,20.
Este protocolo descreve um método de avaliação BTB integridade na vivo pela injeção de inulina-FITC, que foi modificado de um procedimento por Chen et al . 21. o protocolo descreve a anestesia de ratos masculinos, a exposição da cavidade peritoneal, a microinjeção de corante para o interstício do testículo, os testículos de colheita e corte-os em seções congeladas e a aquisição de imagens. Para uma conclusão bem sucedida, devem notar-se várias etapas. Em primeiro lugar, é importante usar uma dose apropriada de anestesia, porque severamente profunda anestesia pode causar a morte. Além disso, o comprimento da ponta da injeção capilar não deve ser muito longo; caso contrário, a pipeta não pode penetrar o testículo.
O procedimento aqui apresentado pode ser utilizado para analisar o papel do vírus, substâncias químicas tóxicas ou candidato proteínas envolvidas na regulação do BTB. Este ensaio é sensível, confiável e acessível para monitorar a integridade BTB em vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela nacional chave R & D programa de China (2016YFA0500902), Nacional Natural Science Foundation da China (31471228, 31771653), a Fundação de ciência de Jiangsu para ilustres jovens estudiosos (BK20150047), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e o programa inovadora e empreendedorismo da província de Jiangsu para K.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
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