Summary
Dans le présent protocole, les méthodes pour effectuer des croisements de consanguinité et à l’évaluation de la réussite de ces croisements, sont décrites pour la fourmi Vollenhovia emeryi. Ces protocoles sont importants pour les expériences visant à comprendre les bases génétiques des systèmes de détermination du sexe dans les hyménoptères.
Abstract
Les composantes génétiques et moléculaires de la cascade de détermination sexuelle ont été largement étudiées dans l’abeille, Apis mellifera, un organisme modèle hyménoptères. Cependant, on connaît les mécanismes de détermination du sexe trouvés chez les autres taxons hyménoptères non-modèle, comme les fourmis. En raison de la nature complexe des cycles de vie qui ont évolué en espèces hyménoptères, il est difficile de maintenir et d’effectuer des croisements expérimentaux entre ces organismes dans le laboratoire. Nous décrivons ici les méthodes pour effectuer des croisements de consanguinité et d’évaluer le succès de ces croisements chez fourmi Vollenhovia emeryi. Induire la consanguinité dans le laboratoire à l’aide de V. emeryi, est relativement simple en raison de la biologie particulière de l’espèce. En particulier, cette espèce produit androgénétique mâles et femelles reproducteurs pièce polymorphisme de l’aile, qui simplifie l’identification des phénotypes dans les croisements génétiques. En outre, l’évaluation de la réussite de la consanguinité est simple, comme mâles peuvent être produites en permanence par consanguinité Croix, tandis que les mâles normaux apparaissent pendant une saison de reproduction bien définie uniquement dans le domaine. Notre protocole permettent avec V. emeryi comme modèle pour étudier les bases génétiques et moléculaires du système de détermination du sexe chez les espèces de fourmis.
Introduction
Taxons hyménoptère eusocial, tels que les fourmis et les abeilles, ont développé un système de détermination sexuelle haplodiploïdes dans lequel les individus qui sont hétérozygotes à la détermination de sexe complémentaire d’un ou plusieurs loci (CSD) devenue des femelles, tandis que ceux qui sont homo - ou hémizygotes devenir des hommes (Figure 1A)1.
Les composantes génétiques et moléculaires impliquées dans la cascade de détermination du sexe ont été bien étudiés chez l’abeille, Apis mellifera, un modèle hyménoptères organisme2,3,4. Génomique comparative des études récentes suggèrent que les fourmis et les abeilles partagent plusieurs homologues putatifs dans la voie de détermination du sexe, tel que le gène de détermination de sexe initiale, CDD5. Cependant, preuve de conservation fonctionnelle de ces homologues fait encore défaut à fourmis.
Pour résoudre ce problème, les lignes de consanguinité devront être établies car ils sont essentiels pour la cartographie génétique et les études moléculaires. Toutefois, il est difficile de maintenir et d’effectuer des croisements expérimentaux entre ces organismes en laboratoire en raison de la nature complexe des cycles de vie qui ont évolué.
Ici, nous utilisons Vollenhovia emeryi comme modèle pour étudier les fondements génétiques et moléculaires de la système de détermination de sexe dans fourmis6,7. Les lignes de la consanguinité de cette espèce ont été développées précédemment pour la cartographie génétique du locus de caractères quantitatifs (QTL) pour les caractères liés à la détermination du sexe pour la première fois dans les fourmis6. En outre, la cascade de détermination sexuelle moléculaire a été étudié7. Cette espèce a évolué d’un système de reproduction inhabituel qui emploie la gynogenèse et androgenèse (Figure 1B)8,9. La plupart des nouvelles reines et les mâles sont par clonage produits des génomes maternels et paternels, respectivement. En outre, les travailleurs et des reines sont produites sexuellement8. Ce système de reproduction est particulièrement bien adapté aux études génétiques parce que les croisements de consanguinité produites à l’aide de sexuellement produit des reines et les mâles sont génétiquement équivalentes à un rétrocroisement classique. Reines sexuellement produites diffèrent morphologiquement de queens produites à partir de génomes maternelle10 (Figure 1B), mener et évaluer des croisements de consanguinité sont grandement simplifiée en utilisant cette méthode.
Dans cet article, les méthodes pour l’établissement de colonies de laboratoire pour l’essai de passage, demande de consanguinité traverse à l’aide de paires de fratrie et l’évaluation de la réussite de ces croisements à l’aide de génotypage des membres de la colonie et la dissection de la progéniture mâle les organes génitaux sont décrites dans V. emeryi.
Quel que soit le système de reproduction employé, application de croisements de consanguinité est souvent la première étape essentielle dans toute enquête sur les systèmes de détermination du sexe dans les hyménoptères. Par exemple dans Cardiocondyla obscurior, l’absence presque totale de mâles diploïdes après 10 générations de fratries d’accouplement en laboratoire montre absence de CSD locus11. Il est possible de prédire le nombre de loci CSD de la proportion de mâles produites en consanguinité Croix6,12,13.
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Protocol
1. collecte et l’entretien de V. Emeryi Colonies en laboratoire sur le terrain
NOTE : Nids de V. emeryi sont trouvent dans la pourriture des journaux et tombés en décomposition nozzles secondaire forêts dans tout le Japon. Cette espèce présente deux types de colonies, savoir, (1) colonies produisant seulement des reines à ailes longues et (2) les colonies produisant principalement des reines à ailes courtes en plus petit nombre de reines de longues ailes8,14. Dans ce protocole, nous avons recueilli le dernier type de colonies dans la préfecture d’Ishikawa, Japon.
- Recueillir V. emeryi colonies au début de l’été.
Remarque : Pour obtenir un nombre suffisant d’individus sexués pendant la saison de reproduction, colonies contenant plus de 300 personnes sont préférés. - Transférer les spécimens de fourmi des branches recueillies à un nid de plâtre artificiel avec un couvercle en verre à l’aide d’un aspirateur (Figure 2, gauche).
- Maintenir les colonies dans des nids artificiels à 25 ° C sous un cycle lumière/obscurité de 16:8 h. Fournir l’eau du robinet avec une bouteille de lavage pour mouiller le plâtre.
- Ajouter environ 100 mg de poudre sèche de cricket enveloppé dans du papier d’aluminium et une pointe de rempli d’eau de sucre brun (pointe de 20 µL) tous les deux jours jusqu'à ce qu’apparaissent de nouveaux reproducteurs (F1 ailé-reines et les mâles de1 F).
2. laboratoire Croix
NOTE : Nouveaux reproducteurs commencent à émerger de la fin de l’été à l’automne (Figure 3). Reines de longues ailes sont produits sexuellement, et à ailes courtes reines sont produites par clonage et possèdent le génome maternel (Figure 1). Utilisez à ailes longues reines et les mâles pour les croisements de consanguinité.
- Pour arrêter les individus de se déplacer, mettez colonies dans une pièce d’environnement constant à 4 ° C pendant 15 min.
- Enlever les milieu-jambes de 30 ouvriers avec une pincette sous un microscope stéréoscopique et transférez-les dans nouveau nid de plâtre plus petit (Figure 2, droite) pour les croisements de consanguinité.
Remarque : Les jambes sont retirées pour distinguer les travailleurs présents auprès des travailleurs qui seront produites par les croisements ultérieurs de consanguinité. - Ajouter 3-4 larves ou pupes dans un nid de plâtre contenant des travailleurs.
NOTE : Les travailleurs présentent une activité exploratoire dans la colonie de reines-moins de0 F. Les larves ou nymphes peuvent attirer efficacement ces travailleurs et les nouveaux reproducteurs dans le centre de la colonie au cours de l’essai de passage. Ainsi, maintenir des conditions de la colonie expérimentale près de la colonie normale. - Transférer une reine de longues ailes et un mâle dans un nid de plâtre préparé à l’étape 2.3 pour consanguinité croisements.
- Garder des colonies à 25 ° C sous un cycle 16:8 h de lumière/obscurité avec la nourriture et l’eau, tel que décrit au point 1.3 jusqu'à ce que la Reine perd ses ailes et pondent leurs œufs.
Remarque : Cela prend une semaine à un mois. - Vérifier le quotidien colonie expérimentale sous un microscope stéréoscopique. Après que exécution de consanguinité traverse entre les descendants de1 F, oeufs peuvent être observés au microscope stéréoscopique.
- Après le F1 Reine commence à pondre des œufs, supprimer les mâles1 F et des larves ou des nymphes, ajoutés à l’étape 2.3 du nid pour éviter le mélange de la génération de1 F (mâles et femelles, utilisées pour des croisements de consanguinité) et la génération de2 F (progéniture produit à partir de croisements de consanguinité).
Remarque : S’il y a peu de mâles dans la colonie, il est possible d’induire des croisements de consanguinité à l’aide d’un mâle et 1 à 3 reines dans la même colonie expérimentale. - Garder les colonies sous le même conditionsas décrite au point 1.3, jusqu'à ce que la progéniture de2 F émerge.
NOTE : Reine de transfert F1 et F2 descendance dans nouveau plus grand nid de plâtre (Figure 2, gauche) pour le maintien à long terme de la colonie.
3. l’évaluation du succès de la consanguinité
- Extraction de l’ADN et le génotypage de la génération parentale (F0)
- Supprimer une jambe d’une reine de0 F à l’aide de pinces et transférer la jambe dans un microtube de 1,5 mL contenant 100 µL de l’agent de chélation.
- Sous un microscope stéréoscopique, disséquer un abdomen femelle dans le plat en verre rempli de 300 µL d’eau ultrapure à l’aide de pinces et d’isoler la spermathèque contenant le sperme des mâles accouplées.
- Décollez le tissu de la spermathèque et isoler les spermatozoïdes des tissus de la femelle à l’aide de broches de l’insectes.
NOTE : Pour faciliter l’extraction de sperme de la spermathèque, stocker des spécimens femelles en 100 % EtOH pendant plus d’une journée avant la dissection. - À l’aide d’une micropipette, transférer le sperme dans un microtube de 1,5 mL contenant 100 µL de l’agent de chélation.
- Incuber les échantillons de reine0 F et le sperme préparé à l’étape 3.1.1 et 3.1.3, respectivement, à 95 ° C pendant 20 min. Flash Centrifuger le microtube et conserver à 4 ° C.
- Génotype de tous les échantillons à l’aide de la méthode décrite ailleurs4.
- Extraction de l’ADN de la paire de fourmis utilisées pour des croisements de consanguinité (F1)
- Après que confirmant la production de œufs par le sib accouplés Reine1 F, extraire l’ADN de la Reine à l’aide de ses ailes de hangar ou un pied milieu et génotype en utilisant la même méthode décrite à l’article 3.1 ci-dessus.
- Extraire l’ADN de F1 mâle en utilisant une jambe et le génotype en utilisant la même méthode décrite à l’article 3.1 ci-dessus.
Remarque : Les échantillons peuvent être conservés en 100 % EtOH avant l’extraction de l’ADN et l’ADN en agent de chélation peuvent être conservée pendant deux mois à 4 ° C.
- Évaluation de la fertilité masculine chez les mâles produit à partir de croisements de consanguinité
NOTE : Les mâles diploïdes produites à partir de croisements de consanguinité sont souvent stériles.- Disséquer les organes reproducteurs internes dans un plat en verre avec 400 µL de solution de PBS avec une pincette.
- Retirer les PBS et ajouter 4 % de paraformaldéhyde (IFP) à l’aide d’une micropipette.
- Fixer le tissu en incubant en PFA pendant 30 min à température ambiante (15-25 ° C).
- Laver le tissu 5 fois avec 400 µL de PBS à l’aide d’une micropipette.
- Diluer le 4', 6-diamidino-2-phénylindole solution de (DAPI) à 1 µg/mL dans du PBS.
- Retirer les PBS et ajouter environ 300 µL de cette solution diluée de coloration DAPI au tissu.
- Incuber 15 min sous condition sombre à température ambiante (15-25 ° C).
- Laver le tissu 5 fois avec 400 µL de PBS et transfert de tissu sur le centre du verre de diapositive à l’aide de pinces.
- Monter le tissu sur montage moyenne contenant conjugué tétraméthylrhodamine TRITC phalloïdine.
- Observer des échantillons par laser confocal utilisant 20 X ou 63 X lentilles de l’objectif de microscope à balayage.
- Utiliser un laser à excitation de 405 nm et un détecteur hybride à 410-530 nm pour la détection de DAPI.
- Utiliser un laser à excitation 561 nm et un détecteur hybride à 565-650 nm pour la détection de TRITC.
- Utilisez une vitesse de balayage de 400 Hz (400 lignes/s) avec une résolution de 1024 × 1024 pixels.
- Capturer des images à l’aide d’une plateforme logicielle.
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Representative Results
Résultats de l’analyse de microsatellites en utilisant F0 et F1 générations ont montré que des croisements de consanguinité ont été exécutées avec succès (Figure 4)6. Ainsi de la consanguinité des croisements, reines fécondées ont été obtenues dans le mois d’établir les colonies de croisement expérimentale. Un quart (27,1 ± SD de 8,91 %) de tous les descendants (F2) de la Croix de la consanguinité était de sexe masculin, tandis que le reste était femelle (travailleurs et une reine)6. Cartographie de QTL à l’aide de la progéniture de croisements de consanguinité a montré que les mâles produites par consanguinité croisements sont diploïdes et homozygotes à deux CDD locus (CSD1 et CSD2 dans la Figure 5), alors que les femelles (travailleurs) produites à partir de croisements de consanguinité sont diploïdes et hétérozygotes au moins à un CDD locus6.
Dissection des mâles haploïdes a révélé les testicules et le sperme, comme prévu (Figure 6 a-6C). Toutefois, chez les mâles diploïdes, spermatozoïdes ont jamais observés, suggérant que les mâles produites en consanguinité croisements sont stériles en V. emeryi6. En outre, les testicules des mâles diploïdes n’a pas pu développer (Figure 6-6E).
Figure 1 . Système reproducteur typique dans les hyménoptères (A) et le système de reproduction atypique impliquant l’androgenèse et gynogenèse en (B) V. emeryi. En général, les femelles (les travailleurs et les reines) se développent à partir des oeufs fécondés de diploïdes et les mâles se développent à partir des œufs non fécondés de haploïdes contenant la moitié du génome maternel (A). Dans V. emeryi, travailleurs stériles et quelques longues ailes reines (LWQ) se développent à partir des oeufs fécondés de diploïdes, tandis que les reines à ailes courtes (SWQ) se développent avec des génomes maternels presque complètes des œufs non fécondés de diploïdes (gynogenèse). Les hommes héritent jamais génomes maternels mais sont des clones de leurs pères (androgenèse) (B). Ce chiffre a été modifié par [Miyakawa et coll. 2018]7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Expérimentale mise en place des colonies de c. emeryi . Après la collecte sur le terrain, les colonies sont transférés dans un nid de plâtre artificiel et conservés au laboratoire. Un nid de plâtre gros (à gauche) est préparé pour maintenir des colonies collectées, alors qu’un petit nid de plâtre (à droite) est préparé pour des croisements expérimentaux de consanguinité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Nouveau V. emeryi reproducteurs émergent au cours de la saison de reproduction. Mature et bien-fedcolonies ont tendance à produire des reines à ailes longues (LWQ) avec le génome parental en plus des reines à ailes courtes (SWQ) qui portent seulement le génome maternel (Figure 1B). Photo : gracieuseté de M. Taku Shimada. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Conception des croisements de consanguinité et microsatellites génotypes du1 F0 et F. 11 marqueurs microsatellites mis au point dans les précédentes études6,8,9, femelles et mâles de la génération parentale (F0) a montré des génotypes différents. Les génotypes des femelles et des mâles utilisés pour des croisements expérimentaux (F1) hérité les génotypes parents et paternels, respectivement, ce qui indique que les femmes ont été croisées avec succès avec leurs frères, avec laquelle les femelles partagent moitié leur génomes. Les nombres indiquent les longueurs des produits PCR au locus microsatellites L-5, qui est l’un des marqueurs utilisés pour le génotypage6,8,9,10. Ce chiffre a été illustré d’après les données du [Miyakawa et Mikheyev 2015]6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Patrons d’allèle deux loci de CSD (CSD1 et CSD2) chez la progéniture produite par consanguinité croisements. Proportion de mâles diploïdes (environ 25 %) et la cartographie de QTL à l’aide de petits produits sib accouplées cuisinent suggèrent l’existence de deux locus CSD dans V. emeryi. Les femelles sont hétérozygotes dans au moins un des deux locus CSD, tandis que les mâles sont homozygotes pour tous les loci. Génotypes sont représentés par les lettres de l’alphabet. Ce chiffre a été modifié par [Miyakawa et coll. 2018]7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Les organes reproducteurs mâles internes d’androgénétique mâles haploïdes et diploïdes en V. emeryi. Morphologie des testicules et des autres organes reproducteurs internes disséquées par des mâles haploïdes androgénétique (A). Sperme (tissu fibreux) voyait dans les testicules des mâles haploïdes (B et C). Couleur bleue marque noyaux colorés par DAPI et marques de couleur rouge F-actine souillé par la phalloïdine tétraméthylrhodamine TRITC conjugué B, C, et E. (a) glandes accessoires ; (t) testicules ; (v) des canaux déférents ; (g) organes génitaux. Morphologies des organes reproducteurs internes disséquées par des mâles diploïdes (D). Testicules et le sperme des mâles diploïdes n’ont été jamais observés (D et E, N >> 30). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cet article explique les protocoles qui peuvent être utilisés pour induire des croisements de consanguinité et d’évaluer la présence de la consanguinité dans la fourmi V. emeryi. Dans les expériences, génotypage des individus utilisés pour les croisements est nécessaire pour s’assurer que les croisements de consanguinité ont réussi. Cependant, l’efficacité de ces tests de passage à niveau est clairement apparente comme mâles diploïdes peuvent être produites tout au long de l’année, tandis que les mâles haploïdes ne peuvent être produits à l’automne dans le champ et le laboratoire6. Sib accouplées reines commencent à produire des descendants masculins immédiatement après le passage à niveau. Aucune différence morphologique phénotypiques ont été observées entre mâles haploïdes et diploïdes au V. emeryi6,7. Cependant, diploïde mâle V. emeryi presque tous les cas ne se développent pas testicules. En l’absence de marqueurs génétiques pour tester la parenté génétique des paires utilisé pour traverser les épreuves, le potentiel reproducteur de la progéniture mâle peut servir à déduire si la consanguinité a eu lieu. Toutefois, il est à noter que les mâles produites en consanguinité croisements ne sont pas toujours stériles dans autres espèces hyménoptères15,16,17.
La première étape critique dans le succès du protocole est le maintien des colonies bien nourris, comme les nourrir après que collecte sur le terrain augmentera la probabilité d’obtenir un nombre suffisant de reproducteurs pour les croisements. Dans V. emeryi, on a signalé une corrélation positive entre la nutrition et la production de reines de longues ailes, qui sont les reines utilisées pour les croisements de consanguinité10. Chez les insectes sociaux, petites, ou colonies en mauvaise santé, généralement ne pas produire de nouveaux reproducteurs18. Il est donc important de recueillir des colonies matures sur le terrain et de leur fournir des quantités suffisantes d’aliments nutritifs pour les expériences utilisant de nouveaux reproducteurs.
La deuxième étape critique est de garder les travailleurs, reproduction et quelques larves ou nymphes ensemble lors des essais de croisement et à maintenir la colonie expérimentale de croisement dans le même État que celui d’une colonie normale jusqu’au passage à niveau est terminée (pour une semaine à un mois). Il est difficile de maintenir les colonies qui doivent être utilisés pour traverser les épreuves sans travailleurs pendant plus de 3 jours parce que les hommes sont incapables de se nourrir par eux-mêmes et doivent être nourris par les travailleurs. Dans ces conditions non naturels, le taux de réussite de croisements de consanguinité a été extrêmement faible6.
Il y a deux limites relatives à l’application de ces protocoles aux autres espèces de fourmis. Tout d’abord, les repères permettant d’induire les croisements sont spécifiques à l’espèce. Il est relativement facile induire des croisements de laboratoire chez V. emeryi depuis intra-colonie d’accouplement sans vol se produit dans la nature. Cependant, plusieurs espèces de fourmis ont évolué des rituels accouplements qui impliquent des vols nuptiaux pendant laquelle nouveau partenaire de reines et les mâles pendant ou après le vol19. Il est donc important d’élucider les déclencheurs qui induisent le passage dans chaque espèce dans un environnement de laboratoire. Par exemple, dans la fourmi parasite Acromyrmex ameliae, le stimulus principal pour le déclenchement des vols nuptiaux semble léger20. La deuxième limitation est, dans certains cas, les mâles diploïdes produites par consanguinité croisements ne peuvent être collectées car ils sont non-viables ou tué par les travailleurs parce qu’ils ne pas travailler et/ou n’ont pas ou à faible potentiel de reproduction et sont donc un coût important pour la colonie de la les espèces objective21,22,23. Heureusement, diploïde V. emeryi mâles ne sont pas tués par les travailleurs et ils vivent jusqu'à ce qu’ils meurent naturellement, ce qui suggère qu’ils ne sont pas fréquemment rencontrés dans la nature et une stratégie visant à exclure des mâles diploïdes de colonies n’a pas évolué chez cette espèce.
Par rapport aux autres espèces de fourmis qui emploient la parthénogenèse arrhénotoque à reproduire (Figure 1A), on peut supposer qu’il y a certains avantages à la production de croisements expérimentaux consanguinité utilisant V. emeryi par androgenèse comme le Croix de consanguinité sont génétiquement équivalente à un rétrocroisement classique. En effet, le système nous a permis de concevoir des expériences pour étudier les gènes de la détermination du sexe, les mécanismes moléculaires et effectuer des études fonctionnelles dans cette espèce6,7.
En résumé, traverse des méthodes pour mener la consanguinité et pour évaluer le succès du résultant des croisements ont été décrites dans V. emeryi. Ces protocoles sont essentiels pour des expériences visant à comprendre les bases génétiques et moléculaires des systèmes de détermination du sexe dans les hyménoptères.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions M. Taku Shimada, le délégué de AntRoom, Tokyo, Japon, pour nous avoir fourni sa photo de V. emeryi reproducteurs. Ce projet a été financé par la société japonaise pour la bourse de recherche de Promotion of Science (JSPS) pour jeunes scientifiques (16J00011) et Grant aide des jeunes scientifiques (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
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